仙茅酒蒸炮制工藝研究△

張一美，王巍，李利華，朱琳，鞠成國，2*

1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；

2.國家中醫藥管理局 中藥炮制技術傳承基地，遼寧 大連 116600

仙茅為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖，具有補腎陽、強筋骨、祛寒濕的功效[1]。仙茅始載于《雷公炮炙論》，常用于腎陽不足、陽痿精冷、筋骨痿軟、腰膝冷痛、寒虛崩漏、帶下、癆虛內傷等臨床現象[2]。仙茅的化學成分主要包括酚及酚苷類、桉烷類、黃酮類、多糖類、木脂素類、生物堿類、揮發油、甜味蛋白等[3]?，F代藥理研究表明，仙茅具有免疫調節、抗氧化、抗骨質疏松[4]、抗關節炎、抗腫瘤、保肝[5]和抗炎[6]等作用，臨床上多用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、骨質疏松癥、腎陽不足所致的陽痿早泄及更年期綜合征等疾病[7]。

歷代仙茅炮制方法主要有藥汁制、泔水制、酒炒、酒浸、酒蒸等[8]。與古代炮制方法相比，現代炮制方法以酒炙法為主，其他方法已很少用或不用。本課題組前期實驗發現，仙茅在經過酒炙后其補腎助陽的功效增強[9]。但傳統酒炙法僅憑經驗對炒制火候、炒制時間等條件進行控制，存在火候難以控制、炒制時間過長或不足、色澤不均勻等弊端。而酒蒸法能較好地控制炮制溫度和時間等。中藥蒸制方法歷史悠久，可追溯至春秋戰國時期，《五十二病方》中有中藥“清蒸”的記載[10]。至南北朝時期，《雷公炮炙論》中增加了“酒蒸”的記載[11]?！毒霸廊珪穼ο擅┯小坝镁瓢枵糁钡挠涊d[12]，蒸制后藥物的不良反應和毒性有所減少或消除。中藥蒸制的目的除了沿襲明清時期的觀點——增強藥效、減少不良反應、改變及緩和藥性、便于切制等，還增加了保持藥效、利于貯存等目的。

仙茅補肝腎、強筋骨的有效成分以酚苷類化合物為主，仙茅苷是其發揮補肝腎作用的有效成分之一[13]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中規定以仙茅苷為指標性成分進行仙茅的質量控制[1]。仙茅中含量較高的成分有苔黑酚龍膽二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷等，其為仙茅發揮強筋骨作用的有效成分[14]。本研究采用正交試驗設計法，以加酒量、悶潤時間、蒸制時間為考察因素，以仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量為評價指標，優選酒蒸仙茅炮制工藝，以期為酒蒸仙茅飲片的規范化、標準化、工業化生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

C21-WT2118 型電磁爐（美的集團股份有限公司）；DFT-200 型高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）；e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XMTD-8222 型電熱恒溫鼓風干燥箱、FA1004B 型萬分之一電子天平（上海精宏試驗設備有限公司）；AE240型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E 型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品仙茅苷（批號：S0818AS，純度＞98%）、苔黑酚龍膽二糖苷（批號：J1014AS，純度＞98%）均購自大連美侖生物技術有限公司；苔黑酚葡萄糖苷（北京索萊寶科技有限公司，批號：1206A022，純度≥98%）；黃酒（浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，批號：20210119，酒精度：10%）；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

仙茅樣品（批號：2208001）購自安國市聚藥堂藥業有限公司，經遼寧中醫藥大學中藥鑒定室李峰教授鑒定為石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 酒制仙茅的制備

2.1.1 傳統酒炙法 取生仙茅飲片20 g，置密閉容器內，加入黃酒（每100 kg 飲片加入黃酒10 kg）拌勻，悶潤，待黃酒被吸盡后，置鍋中，以文火炒干，取出，放涼，即得[15]。

2.1.2 酒蒸法 取生仙茅飲片20 g，置密閉容器內，加入黃酒（每100 kg 飲片加入黃酒20 kg）拌勻，悶潤1 h，置鍋中，蒸制1 h，取出放涼，50 ℃干燥，即得。

2.2 醇溶性浸出物的測定

按《中國藥典》2020 年版通則2201 項下醇溶性浸出物測定法中的熱浸法進行測定[16]。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 1）仙茅苷：Xtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈（76∶24）為流動相；流速為1 mL·min-1；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL[17]。2）苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷：Xtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～7 min，95%～90%B；7～20 min，90%B）；流速為0.6 mL·min-1；檢測波長為220 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL[17]。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷對照品適量，分別加入甲醇溶解稀釋，混勻，制得仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷質量濃度分別為0.245 0、0.572 5、1.377 5 mg·mL-1的單一對照品母液[17]備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.1.2 項下酒蒸仙茅樣品粉末（過三號篩，下同）1.0 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱定質量，于水浴鍋中加熱回流2 h，取出放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取上述濾液20 mL，蒸干，殘渣加入甲醇復溶，轉移至10 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。同法制得仙茅生品及酒炙品的供試品溶液。

2.3.4 系統適用性試驗 取上述各供試品溶液及單一對照品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取2.3.2 項下各單一對照品母液適量，用甲醇稀釋，制成仙茅苷質量濃度分別為7.70、15.30、30.60、61.30、122.50、245.00 μg·mL-1，苔黑酚龍膽二糖苷質量濃度分別為17.89、35.78、71.56、143.10、286.30、572.50 μg·mL-1，苔黑酚葡萄糖苷質量濃度分別為 43.00、86.10、172.20、344.40、688.80、1 377.50 μg·mL-1的各單一對照品線性溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定。以各待測成分進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。

表1 仙茅中3個成分線性關系

2.3.6 精密度試驗 分別精密吸取2.3.2 項下各單一對照品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件連續進樣6 次，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為0.44%、0.30%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取2.3.3 項下供試品溶液（仙茅生品）適量，按2.3.1 項下色譜條件進行測定，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面積的RSD 分別為0.13%、0.37%、0.21%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 取仙茅生品樣品粉末 1.0 g，共6 份，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項下色譜條件進行測定，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均質量分數分別為0.099%、0.387%、0.649%，RSD 分別為0.36%、0.54%、0.30%，表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知含量的同一批仙茅樣品（生品）粉末，每份0.1 g，分別加入各單一對照品溶液適量，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 仙茅中3個成分加樣回收率試驗結果

2.4 單因素試驗

本研究選擇加酒量、悶潤時間、蒸制時間進行單因素試驗。同時，參考文獻[17-19]確定各因素的權重，3 個化學成分及醇溶性浸出物含量的權重均為25%。按公式（1）計算綜合評分。

式中W表示仙茅苷含量，X表示苔黑酚葡萄糖苷含量，Y表示苔黑酚龍膽二糖苷含量，Z表示醇溶性浸出物含量，綜合評分分值越高表示樣品質量越好[20]。

2.4.1 加酒量 取5 份生仙茅飲片，每份20 g，加入不同比例黃酒，至密閉容器內悶潤3 h 后，蒸制2 h，取出放涼，50 ℃干燥?？疾觳煌泳屏浚?%、10%、15%、20%、25%）對綜合評分的影響。當加酒量為15%時，綜合評分最高，故選擇加酒量10%～20%進行正交試驗設計，見表3。

表3 不同加酒量對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質量分數、綜合評分的影響

2.4.2 悶潤時間 取5 份生仙茅飲片，每份20 g，加入15%黃酒，至密閉容器內悶潤不同時間后，蒸制2 h，取出放涼，50 ℃干燥?？疾觳煌瑦灊檿r間（1、2、3、4、5 h）對綜合評分的影響。當悶潤時間為1 h時，綜合評分最高，悶潤時間少于1 h時存在不能完全潤透的情況，而悶潤2 h或3 h時綜合評分較高，故選擇悶潤時間1～3 h進行正交試驗設計，見表4。

表4 不同悶潤時間對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質量分數、綜合評分的影響

2.4.3 蒸制時間 取5份生仙茅飲片，每份20 g，加入15%黃酒，至密閉容器內悶潤1 h，蒸制不同時間，取出放涼，50 ℃干燥?？疾觳煌糁茣r間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對綜合評分的影響。當蒸制時間為1.0 h時，綜合評分最高，其次為1.5、2.0 h，而蒸制時間少于1.0 h時，不能完全蒸透，故選擇蒸制時間1.0～2.0 h進行正交試驗設計，見表5。

表5 不同蒸制時間對酒蒸仙茅中3個成分及浸出物質量分數、綜合評分的影響

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，本研究以加酒量（A）、悶潤時間（B）、蒸制時間（C）為考察因素，仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷和醇溶性浸出物含量的綜合評分為評價指標，采用L9（34）設計試驗。酒蒸仙茅炮制工藝的因素與水平見表6，試驗設計方案與結果見表7，方差分析結果見表8。

表6 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗因素水平

表7 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗設計方案與結果

表8 酒蒸仙茅炮制工藝正交試驗方差分析

由表7可知，各因素對3個酚苷類成分和醇溶性浸出物含量影響為A＞B＞C，最優組合為A3B2C3。由表8 可知，因素A、B、C 影響差異無統計學意義。為節約時間，最終確定最優工藝為A3B1C1，即加酒量20%、悶潤時間1 h、蒸制時間1 h。

2.5.2 驗證實驗 取3 份生仙茅飲片，每份100 g，按上述最優酒蒸炮制工藝制備3 批酒蒸仙茅樣品，再按2.2、2.3 項下方法分別測定含量，并計算綜合得分，結果見表9。綜合評分的RSD為0.71%，表明所得最優酒蒸仙茅工藝穩定、可行。

表9 酒蒸仙茅炮制工藝驗證實驗結果

2.6 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品含量比較

取生仙茅飲片20 g，分別按2.1.1、2.1.2 項下方法分別制備酒炙品和酒蒸品，再按2.2、2.3 項下方法分別測定生仙茅飲及2 種炮制品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷和醇溶性浸出物的含量，結果見表10。結果顯示，酒蒸仙茅的仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量均高于仙茅生品和酒炙品。

表10 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龍膽二糖苷、浸出物質量分數比較 %

3 討論

漢代開始陸續出現了酒制中藥的方法，近幾十年來，對于酒制中藥的研究一直在持續進行?，F代較為常用的酒制法包括酒炙、酒蒸、酒淬等。酒制中藥所用的輔料酒分為黃酒和白酒，現代中藥在酒制時，以黃酒為主。黃酒氣味芳香、主行藥勢、能入血分、可通血脈、能升能散，有活血通絡、和血行氣、散寒祛腥的作用[21]。炮制用輔料黃酒應該清亮透明、無沉淀雜質，不應有異味，顏色應為橙黃至深褐色。黃酒中含有醇，醇有促進血液循環、興奮心臟等作用。酒制中藥時，黃酒與中藥充分拌勻潤透，可滲入組織內部，對中藥內部組織的物理狀態有所改變，對成分的溶解、擴散、置換、溶出等有促進作用，酒制傳統炮制理論有“借酒力以上騰也”“酒制升提”等[15]。

基于“相資為制”的制藥理論，以熱性的黃酒炮制熱性的仙茅，能夠增強仙茅補腎溫陽的作用。目前，《中國藥典》2020 年版對于仙茅的炮制方法也以酒炙法為主，對酒蒸仙茅的研究較少。但酒炙法存在火力不均、火候難以控制等問題，而酒蒸法則能使飲片受熱均勻，且由于其操作過程中處于密閉環境，減少了對飲片的污染。故本研究選擇對酒蒸仙茅炮制工藝進行研究，以期提高其臨床療效和用藥安全性，為臨床用藥提供新思路。

本研究經實驗考察，以本課題組前期研究為參考[17]，發現以2.3.1項下色譜條件測定仙茅苷、苔黑酚龍膽二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量時，其色譜峰分離度較好、基線較為平穩。故選擇以2.3.1 項下色譜條件對其進行檢測。

本研究采用酒蒸法，以加酒量、悶潤時間、蒸制時間為考察因素，結合綜合加權評分對工藝進行優化，得到仙茅酒蒸最佳工藝為加酒量20%，悶潤時間1 h，蒸制時間1 h。經驗證，所得最優酒蒸仙茅炮制工藝具有一定的科學性與可行性。仙茅經酒蒸后，與仙茅生品及傳統酒炙品相比，其醇溶性浸出物及3 個成分含量均有所升高。這可能是由于在炮制過程中，黃酒進入仙茅內部，促進其有效成分的溶出、仙茅中的其他化學成分發生了轉化等，具體原因還有待進一步研究。

酒蒸仙茅的炮制方法在明代的《景岳全書》[12]、現代的《遼寧省中藥飲片炮制規范》1975 年版[22]及《云南省中藥飲片炮制規范》1986 年版[23]中均有記載，但其炮制工藝各不相同。由于炮制工藝變化較大，且中藥成分較為復雜，故本研究選擇對仙茅酒蒸工藝進行優化?，F代對生仙茅及酒炙仙茅臨床應用記載較多，而對酒蒸仙茅臨床應用卻鮮有記載，故后續尚需對其質量標準、藥理實驗、化學成分分析、臨床療效等進行更深入的研究，以期為酒蒸仙茅臨床應用提供參考。

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