基于標準湯劑的竹葉柴胡配方顆粒質量標準研究△

王艷芳，婁濤濤，孫宜春，向家俊，許洋木，卿勇軍，李慧馨

國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

竹葉柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.為傘形科（Umbeliferae）柴胡屬（BupleurumL.）植物，多為西南地區民間習用品，以全草入藥，現收入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》2003 年版[1]。有研究報道竹葉柴胡含有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c等30余種皂苷類化合物，以及槲皮素、兒茶素、蘆丁等黃酮類化合物，現代藥理學研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，為藥用柴胡重要的基原，臨床應用歷史悠久[2-4]。目前，也有研究報道借助指紋圖譜及指標成分含量測定等分析手段對竹葉柴胡的質量進行控制，但并無基于標準湯劑的竹葉柴胡配方顆粒的相關性研究，全面控制竹葉柴胡配方顆粒質量的研究也較少。中藥配方顆粒是由單味中藥經水提、分離、濃縮、干燥等程序制粒所得，既有現代藥品的特點，又保留著傳統中醫藥的特色，可按中醫臨床處方調配后直接沖服，而質量控制是確保中藥配方顆粒臨床療效的基本保障[5-6]。因此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了基于標準湯劑的竹葉柴胡配方顆粒的指紋圖譜及蘆丁含量測定方法，并開展基于飲片-標準湯劑-配方顆粒的關聯性研究，以期為竹葉柴胡配方顆粒的質量管理提供參考。

1 材料

1.1 樣品

15 批竹葉柴胡藥材均采自貴州，經貴州中醫藥大學李偉教授鑒定為傘形科（Umbeliferae）柴胡屬（BupleurumL.）植物竹葉柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.的全草，樣品信息見表1。

表1 竹葉柴胡飲片、標準湯劑及配方顆粒信息

1.2 試藥

對照品蘆?。ㄅ枺?11871-202007，純度：98.1%）、槲皮素（批號：100081-201610，純度：99.1%、竹葉柴胡對照藥材（批號：121343-201903）均購于中國食品藥品檢定研究院；麥芽糊精[中糧生化能源（公主嶺）有限公司]；甲醇、乙腈均為色譜純，購于美國Fisher 公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

A1290 型超高效液相色譜儀（Agilent 公司）、Vanquish F 型超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；KQ-500DB 型超聲波樣品處理機（濟寧天之藍生物科技有限公司）；ML204 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多電子天平有限公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器有限公司）；YMW 型分體煎藥壺（深圳一枚王有限公司）；Direct-Pure 型超純水系統（上海瑞楓科學儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 竹葉柴胡標準湯劑及配方顆粒的制備

根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[7]制備竹葉柴胡標準湯劑凍干粉，根據標準湯劑的標準制備竹葉柴胡配方顆粒。

竹葉柴胡飲片制備：取竹葉柴胡藥材，除去雜質及殘莖，洗凈，潤透，切段（10～15 mm），干燥，即得。

竹葉柴胡標準湯劑制備方法：取竹葉柴胡飲片100 g，加12倍量水，浸泡30 min，采用砂鍋先武火煮沸，再文火煎煮30 min，300目濾布趁熱濾過，藥渣再加10倍量水，先武火煮沸，再文火煎煮20 min，300 目濾布趁熱濾過，合并濾液；在65 °C 減壓濃縮成浸膏，冷凍干燥，即得竹葉柴胡標準湯劑凍干粉。

竹葉柴胡配方顆粒制備方法：取竹葉柴胡（竹葉柴胡）飲片7700 g。加水煎煮，濾過，濾液濃縮成清膏（干膏出膏率為6.1%～13.0%），加入輔料適量，干燥，再加入輔料適量，混勻，制粒，制成1000 g，即得。

2.2 指紋圖譜方法建立

2.2.1 色譜條件 ACQUITY? HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～25 min，5%～25%A；25～30 min，25%～45%A；30～33 min，45%～95%A），柱溫為35 ℃，進樣量為1 μL，檢測波長為255 nm，體積流量為0.30 mL·min-1。

2.2.2 對照品溶液的制備 取竹葉柴胡對照藥材約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。取蘆丁對照品加75%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，搖勻，作為蘆丁對照品溶液。取槲皮素對照品加75%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，搖勻，作為槲皮素對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取竹葉柴胡飲片粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，另依次取竹葉柴胡配方顆粒、標準湯劑凍干粉適量，精密稱定，置已編號的具塞錐形瓶中，依次精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（500 W，40 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取配方顆粒、空白溶劑及陰性樣品（只含輔料），按2.2.3 項下方法分別制備供試品、陰性樣品溶液，按2.2.1 項下色譜條件上機檢測。由圖1 可知，陰性樣品及空白溶液均無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 竹葉柴胡配方顆粒指紋圖譜專屬性試驗

2.3.2 精密度試驗 按2.2.3 項下方法制備1 份供試品溶液，在2.2.1項下色譜條件重復進樣6次，標定6個共有峰，以蘆?。ǚ?）為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積。各色譜峰相對保留時間的RSD為0～0.39%，相 對峰面積的RSD為0.27%～0.98%，該儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 按2.2.3 項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件測定。以峰形較好且峰面積較大的蘆?。ǚ?）的保留時間和峰面積為參照，計算其他共有峰的相對保留時間和峰面積。結果各色譜峰相對保留時間RSD為0～0.56%，相對峰面積的RSD為0.51%～1.12%，表明該方法的重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一批配方顆粒供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按2.2.1 項下色譜條件進樣，測得各色譜峰相對保留時間的RSD 均小于2.0%，相對峰面積的RSD 均小于2.0%，說明該樣品溶液在24 h內較穩定。

2.3.5 耐用性試驗 取同一批配方顆粒樣品，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，分別采用Agilent 1290Ⅱ、Thermo Vanquish F 色譜儀及3 根不同品牌的色譜柱測定，以峰形較好且峰面積較大的蘆?。ǚ?）的保留時間和峰面積為參照，結果顯示各共有峰相對保留時間的RSD為0.15%～0.50%，表明該方法對不同儀器具有良好的耐用性；與其他2 個品牌色譜柱（Dikma C18-AQ 與Shim-pack GISS-HP C18-AQ）相比較，Waters ACOUITY UPLC? HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）的6 個共有峰峰形較好，分離效果最佳，表明該方法對不同色譜柱的耐用性較低。

2.3.6 共有峰的確定 精密吸取各對照品溶液及供試品溶液各1 μL，于2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照藥材作為參照，選擇出峰穩定、峰形和分離度較好的6 個色譜峰作為共有峰，其中峰3（S）與蘆丁對照品色譜峰的保留時間相對應，峰6 與槲皮素對照品色譜峰的保留時間相對應（圖2）。

圖2 竹葉柴胡配方顆粒指紋圖譜峰指認檢測圖譜

取15 批標 準湯劑（S1～S15）、3 批配方 顆粒（S16～S18）和對應3批竹葉柴胡飲片（S19～S21）根據2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），結果見圖3、圖4。采用多點校正后，對共有峰進行Mark匹配，結果顯示15 竹葉柴胡批標準湯劑的相似度為0.951～0.990，3批配方顆粒的相似度為0.973～0.986，3 批竹葉柴胡藥材對應飲片的相似度為0.953～0.979，三者相似度均高于0.90，表明竹葉柴胡飲片、標準湯劑及配方顆粒之間相似度良好。以峰形較好且峰面積較大的峰3（S）作為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD為0～0.17%，且其相對保留時間均在規定值的±10%之內，規定值為0.30（峰1）、0.48（峰2）、1.04（峰4）、1.20（峰5）、1.60（峰6）。比較3 批配方顆粒（S16～S18）及相應3 批標準湯劑（S2～S4）、3 批竹葉柴胡飲片（S19～S21）的指紋圖譜，發現前者（配方顆粒）均呈現與后兩者（即標準湯劑、竹葉柴胡飲片）相同的6 個共有峰，并且相對保留時間基本一致，表明現行生產工藝能使竹葉柴胡指紋圖譜量值得到穩定傳遞，從而確保配方顆粒與標準湯劑、飲片的一致性，結果見表2。

圖3 竹葉柴胡配方顆粒指紋圖譜對照圖譜

圖4 竹葉柴胡飲片、標準湯劑及配方顆粒指紋圖譜

表2 15批竹葉柴胡標準湯劑、3批配方顆粒及對應3批飲片相對保留時間分析結果

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

采用迪馬Endeavorsil C18-A 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈（A）～0.1%甲酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～22 min，10%～48%A），柱溫為30 ℃，流速為0.20 mL·min-1，檢測波長為354 nm，進樣量為1 μL。理論板數按蘆丁峰計應不低于8000。

2.4.2 溶液制備

2.4.2.1 對照品溶液制備 取蘆丁對照品適量，加75%甲醇制成質量濃度為50 μg·mL-1的蘆丁溶液，混勻，即得。

2.4.2.2 供試品溶液制備 取1 批配方顆粒研細混勻約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲（500 W，40 kHz）60 min，放冷，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.2.3 陰性樣品及空白溶劑制備 取輔料麥芽糊精（按竹葉柴胡配方顆粒制備工藝）顆粒（批號：210604）約0.1 g，按2.4.2.2 項下方法制備，即得。取75%甲醇作為空白溶液。

2.5 含量測定方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取配方顆粒及陰性樣品，按2.4.2 項下方法分別制備對照品、供試品、陰性樣品溶液。取供試品、對照品、陰性樣品溶液及空白溶劑適量，按2.4.1項下色譜條件測定，結果見圖5，供試品在與蘆丁對照品相應的保留時間的位置上出峰，且空白溶劑及陰性樣品均無色譜峰流出，對供試品測定無干擾，表明該方法的專屬性良好。

圖5 竹葉柴胡配方顆粒含量測定專屬性試驗圖譜

2.5.2 線性關系考察 分別精密吸取蘆丁對照品儲備液適量，依次稀釋1、2、2.5、5、10、20 倍，即得不同質量濃度的蘆丁對照品溶液，按照2.4.1 項下色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積值為縱坐標（Y）進行回歸，結果顯示Y＝0.199 9X+0.336 6（r＝0.999 3），表明蘆丁質量濃度為0.01～0.20 mg·mL-1時與其峰面積線性關系良好。

2.5.3 精密度試驗 精密吸取2.4.2.2 項下制備的供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件連續進樣6次測定。計算蘆丁質量分數的RSD為0.09%，表明該儀器的精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批竹葉柴胡配方顆粒按2.4.2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.4.1.項下色譜條件進行測定。計算蘆丁質量分數的RSD為1.72%，表明該方法的重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 按2.4.2.2 項下方法制備1 份供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、10、12、24 h 進樣測定。計算蘆丁質量分數的RSD為0.57%，說明該溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.6 耐用性試驗 取竹葉柴胡配方顆粒供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件，采用不同品牌的色譜柱（Dikma Endeavorsil C18-A、Inerstil ODS-3 C18及Acclaim Vanquish C18）對其進行檢測分析，計算蘆丁質量分數的RSD為1.21%，表明該方法對不同類型的色譜柱耐用性良好。取竹葉柴胡配方顆粒供試品溶液2 份，按2.4.1 項下色譜條件，采用Agilent 1290Ⅱ、ThermoVanquish F 不同型號的UPLC 分別對其檢測分析。計算蘆丁質量分數的RSD為0.61%，表明該方法對不同儀器具有良好的耐用性。

2.5.7 加樣回收試驗 取已知含量竹葉柴胡配方顆粒（蘆丁質量分數為6.6 mg·g-1）0.1 g，精密稱定共6份，加入蘆丁對照品溶液適量，按2.4.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件測定，計算回收率（表3）。結果顯示蘆丁的平均回收率為103.19%，RSD為1.10%，表明該含測方法的準確度良好。

表3 竹葉柴胡配方顆粒蘆丁加樣回收試驗結果

2.6 樣品含量測定

分別取15 批標準湯劑、3 批配方顆粒及3 批竹葉柴胡飲片粉末，按2.4.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進行檢測分析，計算各樣品中蘆丁的含量。15 批竹葉柴胡標準湯劑（S1～S15）中指標成分蘆丁的質量分數分別為10.42、8.40、12.31、8.22、10.54、9.91、10.92、7.84、8.23、9.28、7.47、11.02、10.81、12.65、9.10 mg·g-1，平均質量分數為9.61 mg·g-1，SD為1.41，均值的70%～130%為6.73～12.49，均值±3SD為5.38～13.83 mg·g-1，各批次蘆丁含量均符合標準；測定3批配方顆粒中蘆丁的質量分數也在多批次標準湯劑限度范圍之內，且從飲片到配方顆粒蘆丁的轉移率高達60%，表明竹葉柴胡指標成分在飲片-標準湯劑-配方顆粒研究過程中量值傳遞較好（表4）。

表4 3批竹葉柴胡藥材對應飲片、顆粒劑中蘆丁的質量分數及轉移率測定結果

3 討論

3.1 指紋圖譜方法的優化

本研究對提取溶劑（不同質量分數甲醇、乙醇及水溶液）、提取方法（振蕩、超聲及熱回流法）、流動相（乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲醇-水及甲醇-甲酸水）及其初始比例、等度洗脫與梯度洗脫、檢測波長及柱溫等進行考察，以供優選出最佳提取方式和色譜條件。其中，以75%甲醇超聲提取所得竹葉柴胡配方顆粒的色譜圖基線平、出峰數目多、峰形及分離效果好，因此，選擇75%甲醇作為最佳提取溶劑進行后續實驗。指紋圖譜指認了槲皮素和蘆丁2個成分，由于蘆丁質量分數最高，達千分之一以上，而槲皮素成分質量分數低于萬分之一，誤差較大，因此，本研究以蘆丁作為含量測定指標，其槲皮素成分不作測定要求。這與相關文獻報道一致[8-10]。

3.2 含量測定指標的選擇及方法的優化

研究報道發現竹葉柴胡含有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c等30余種皂苷類化合物[12]，經前期預實驗對本研究所用竹葉柴胡飲片中3 個柴胡皂苷化合物進行檢測，發現其含量均低于萬分之一，而蘆丁作為黃酮類成分其含量在竹葉柴胡飲片中高達1%以上，且現代藥理學發現其具有抗氧化、抗炎及保護心血管作用[11]，因此，本研究將蘆丁作為指標成分，并對其建立含量測定方法。

本研究在蘆丁含量測定方法的建立時考察了水、不同體積分數的甲醇和乙醇對其提取效果的影響，結果顯示75%甲醇提取效率最高；對流動相洗脫梯度進行逐步優化發現，采用梯度洗脫色譜峰峰形好、基線平穩、分離度符合分析要求，且蘆丁可實現基線分離，因此，最終選擇梯度洗脫進行色譜分離。同時比較了振蕩、超聲和回流提取3種提取方式對提取效率的影響，結果顯示超聲處理60 min 的提取效果最佳，操作簡單。

3.3 量值傳遞分析

本研究基于傳統中醫藥理論指導，引入標準湯劑的研究理念，對竹葉柴胡飲片-標準湯劑-配方顆粒進行系統研究，以指紋圖譜和配方顆粒中蘆丁指標成分的含量為研究目標和評價指標，15 批標準湯劑中蘆丁指標成分含量實測值均為均值±3SD，未出現離群數值，且3 批配方顆粒中蘆丁含量也在標準湯劑范圍內。竹葉柴胡飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜相似度均大于0.90，表明從飲片至配方顆粒其蘆丁的轉移率高達60%，能夠穩定傳遞，最大限度地保證了竹葉柴胡配方顆粒與標準湯劑的等效性和質量一致性，進而確保臨床療效。

綜上所述，本研究建立了基于標準湯劑的竹葉柴胡配方顆粒指紋圖譜及指標成分蘆丁的含量測定方法，較完整客觀地反映了竹葉柴胡配方顆粒生產過程的相關性及量值傳遞的規律，為指紋圖譜及含量測定用于竹葉柴胡配方顆粒生產過程的監控及質量管理提供研究依據。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。