高溫瞬時滅菌對開心散有效成分含量及微生物學指標的影響△

李俊瑩，許倩，秦紹剛，汪夢美，汪海宣，杜明松，陳萬青，張功茹，年立忠，單曉曉，彭燦，金傳山，張彩云*

1.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；

2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；

3.安徽省教育廳現代藥物制劑工程技術研究中心，安徽 合肥 230012；

4.安徽省道地中藥材品質提升創新協同中心，安徽 合肥 230012；

5.安徽省中醫藥科學院 藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；

6.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；

7.合肥市食品藥品檢驗中心，安徽 合肥 230094；

8.蚌埠豐原涂山制藥有限公司，安徽 蚌埠 233000

開心散始載于唐代醫家孫思邈所著《備急千金要方》，由遠志、人參、茯苓和石菖蒲4 味中藥組成，具有安神益智、開竅醒腦等功效，是中醫臨床防治健忘、阿爾茨海默病的基礎方劑，也是2018 年國家中醫藥管理局制定的首批百首經典名方之一[1-2]。開心散為中藥散劑，需參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中口服散劑的質量標準進行研究。由于其是生藥入藥，需經滅菌來保證其中微生物限度達到臨床應用的安全標準[3]。

目前，中藥飲片及制劑常見滅菌方法有干熱滅菌、濕熱滅菌、紫外線滅菌、輻射滅菌、臭氧滅菌等，不同滅菌方法對開心散有效成分的影響不同[4-5]。干熱滅菌法的熱穿透力差，須經長時間高溫作用才能達到滅菌的目的，適用于耐高溫及濕熱條件下易分解的藥品[6]。干熱滅菌法不適用于開心散中含有黃酮類成分的遠志和含有揮發油成分的石菖蒲。濕熱滅菌法是藥物制劑生產過程中最常用的滅菌方法，但滅菌后樣品潮濕、水分超標，導致某些中藥藥性轉變，易吸潮或吸潮后物性易改變的中藥不建議使用該法[7]。紫外線滅菌法有滅菌不均勻、不完全、滅菌時間長、會產生臭氧殘留等不足[8]。輻射滅菌法存在輻照劑量超標與輻照源受限制的弊端[9]。臭氧滅菌法易使部分中藥活性成分氧化，且臭氧穩定性差[10]。

高溫瞬時滅菌是近年來興起的新技術，是在加熱條件下使純凈飽和蒸氣迅速達到較高溫度，短時間內破壞病原微生物細胞內的蛋白質、核酸和活性物質，達到滅菌的目的；滅菌后，系統會將物料分離并進行急驟冷卻，藥效成分損失少，滅菌效率高、效果好[11-12]。該法可對含生藥原粉的中成藥進行迅速滅菌與干燥，保持原生藥原粉的藥效特性。開心散中含有易水解和易揮發的成分[13-16]，通過前期不同顆粒尺寸滅菌效果和含量預試驗考察，最終確定對10目以下（優選2～8 目）開心散樣品進行高溫瞬時滅菌研究。本研究選擇遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、茯苓酸、β-細辛醚和α-細辛醚8個活性成分作為滅菌前后的質量控制指標[17-18]，比較不同滅菌條件對8 個有效成分含量變化的影響，以期確定開心散高溫瞬時滅菌最佳滅菌工藝參數。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific 公司）；KS-250TDE 型超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；MS105DU/A型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水系統（默克儀器有限公司）；WC-KLD20 型高溫瞬時滅菌設備（江蘇萬創滅菌設備科技有限公司）。

1.2 試藥

開心散配方中遠志（批號：202201）、人參（批號：202201）、茯苓（批號：202101）和石菖蒲（批號：202201）飲片均購自安徽敬道藥業有限公司，經安徽中醫藥大學俞年軍教授鑒定，遠志為遠志科遠志屬植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根、人參為五加科人參屬植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖、茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核、石菖蒲為天南星科菖蒲屬植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott 的干燥根莖。以上飲片按《中國藥典》2020年版（一部）要求項檢測均為符合規定[19]。

2 方法

2.1 開心散中4味中藥粗顆粒的滅菌

將遠志、人參、茯苓和石菖蒲4 味中藥進行粗粉碎，得到2～8 目的粗顆粒，分別稱取300 g，投入高溫瞬時滅菌設備進行滅菌。依據高溫瞬時滅菌設備的最低工作溫度（160 ℃）、結合開心散方中揮發油類成分的特點，分別設定160、165、170 ℃ 3 個滅菌溫度，滅菌時間分別為5、7、9 s，開啟設備滅菌操作。滅菌物料進入滅菌倉，在攪拌槳快速攪拌過程中與過熱蒸氣充分接觸，借助多角度溫度傳感器精確控制滅菌溫度[（設定溫度±1）℃]，實現高溫、瞬時、均勻滅菌。待滅菌結束后，在出樣口用無菌采樣袋分裝樣品，并依據滅菌溫度和滅菌時間分別將其標記為160 ℃、5 s，160 ℃、7 s，160 ℃、9 s，165 ℃、5 s，165 ℃、7 s，165 ℃、9 s，170 ℃、5 s，170 ℃、7 s，170 ℃、9 s。

2.2 開心散樣品的制備

在潔凈區無菌環境下，分別粉碎9 種滅菌條件的粗顆粒，并通過六號篩進行篩分。最后按照2022年9 月發布的《國家中醫藥管理局辦公室、國家藥品監督管理局綜合和規劃財務司關于發布＜古代經典名方關鍵信息表（25 首方劑）＞的通知》中開心散關鍵信息[20]，將遠志-人參-茯苓-石菖蒲按1∶1∶2∶1 的比例混合均勻，制備開心散散劑。

2.3 微生物限度檢測

參照《中國藥典》2020 年版（四部）中非無菌產品微生物限度檢查微生物計數法（通則1105）、控制菌檢查法（通則1106）和非無菌含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度標準（通則1107），對滅菌前后的開心散進行微生物限度檢測[3]。

2.4 開心散有效成分的含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 精密稱取開心散粉末1 g置塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，超聲提取30 min（250 W，50 kHz）后濾過，濾液過微孔濾膜（0.45 μm）后取續濾液，即得。

2.4.3 高效液相色譜法（HPLC）條件Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～20 min，5%～15%A；20～26 min，15%～16%A；26～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～23%A；42～70 min，23%～40%A；70～90 min，40%～52%A；90～92 min，52%～73%A；92～105 min，73%～80%A；105～115 min，80%～95%A；115～120 min，95%A）；體積流量為1 mL·min-1；進樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為203 nm。

本研究所得混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC 圖、色譜峰歸屬及部分色譜峰局部放大圖見圖1。

圖1 開心散混合對照品溶液、供試品溶液的HPLC圖及局部放大圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 按2.4.3 項下的條件精密吸取混合對照品溶液進高效液相色譜儀檢測，分析色譜圖并指認相應保留時間的色譜峰及對應的峰面積。以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，計算回歸方程（表1）。由表1可知，8個指標性成分在各自質量濃度范圍內線性關系良好。

表1 開心散8個有效成分線性關系考察結果

2.5.2 穩定性試驗 取滅菌條件為160 ℃、5 s 的開心散樣品1 g，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按2.4.3 項下條件測定遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、茯苓酸、β-細辛醚和α-細辛醚8 個有效成分的峰面積，經計算，其RSD分別為1.97%、0.26%、1.68%、1.67%、1.44%、1.32%、0.06%、1.73%，均小于2%，表明開心散樣品在24 h內穩定性較好。

2.5.3 重復性試驗 分別取滅菌條件為160 ℃、5 s的開心散散劑6 份，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下條件進樣測定，記錄色譜峰面積，計算遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、茯苓酸、β-細辛醚和α-細辛醚8 個有效成分的峰面積，計算各成分含量，其RSD 分別為0.48%、1.19%、0.47%、0.13%、0.54%、1.05%、0.16%、0.62%，均小于2%，表明建立的方法重復性較好。

2.5.4 精密度試驗 取滅菌條件為160 ℃、5 s 的開心散樣品1 g，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積，計算遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、茯苓酸、β-細辛醚和α-細辛醚峰面積的RSD 分別為1.80%、0.31%、0.83%、1.67%、1.38%、0.86%、0.09%、0.93%，均小于2%，表明儀器精密度較好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定8個有效成分含量的滅菌條件為160 ℃、5 s開心散粉末約1 g，平行6 份，分別配置質量濃度約為1 mg·mL-1的遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽?、細葉遠志皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、茯苓酸、β-細辛醚和α-細辛醚對照品溶液，通過倍數稀釋后分別精密移取相當于樣品中8 個有效成分等劑量的對照品溶液，按照2.4.1項下方法制備供試品溶液，按照2.4.3項下條件進樣測定，結果見表2?；厥章实腞SD 均小于2%，說明該方法準確度較好。

表2 開心散8個有效成分加樣回收率考察結果

2.6 滅菌前后開心散有效成分含量測定

準確稱取未滅菌開心散及9 個滅菌處理后的開心散樣品，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下條件測定8 個指標性成分的色譜峰面積（平行3次），并根據相應的標準曲線計算各自含量。

3 結果與討論

3.1 微生物限度檢測

對滅菌前后的開心散進行微生物限度檢測，結果見表3。由表3 可知，滅菌前開心散樣品中需氧菌、霉菌和酵母菌嚴重超標，不符合微生物限度要求，不可以直接作為口服散劑使用。經過高溫瞬時滅菌處理后的所有開心散樣品均符合《中國藥典》2020年版微生物限度項下規定。

表3 不同滅菌條件開心散的微生物限度檢測結果

隨著滅菌溫度的升高、滅菌時間的延長，開心散的滅菌效果越來越好。一般大腸埃希菌、沙門菌、霉菌和酵母菌不耐高溫，在70～80 ℃即可殺滅；而需氧菌中存在耐高溫的細菌，需升高滅菌溫度或延長滅菌時間，才能完全殺滅這些細菌的營養體和芽孢。在160 ℃、5 s的條件下滅菌的開心散樣品，需氧菌、霉菌和酵母菌總數均小于《中國藥典》2020 年版通則1107 的限度標準，同時大腸埃希菌、沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌這3種控制菌在開心散滅菌前后的樣品中均未檢出?？梢?，在160 ℃、5 s 的滅菌條件下開心散樣品已滿足中藥散劑的微生物限度要求。

3.2 滅菌前后開心散有效成分含量變化

滅菌前后開心散中8 個有效成分含量變化結果見表4；與未滅菌開心散有效成分含量相比，滅菌開心散樣品中8個有效成分含量的變化率見表5。

表4 不同滅菌條件對開心散有效成分質量分數的影響（n=3） %

表5 開心散8個有效成分在不同高溫瞬時滅菌條件下與未滅菌樣品對比的變化率 %

由表4、表5 可知，開心散在高溫瞬時滅菌過程中，有效成分的含量及變化率會隨著滅菌溫度和滅菌時間變化而變化。高溫瞬時滅菌后開心散中的遠志酮Ⅲ含量均有所降低，且隨著滅菌溫度的升高和滅菌時間的增長，其含量越來越低。從結構上分析，遠志酮Ⅲ的基本母核由苯環與色原酮的2,3位駢合而成，在高能量條件下糖鏈斷裂，碳苷鍵會發生交叉環裂解反應，生成裂解產物，可能導致在高溫瞬時滅菌條件下含量降低[21-23]。同時，滅菌后開心散中3,6?-二芥子?；崽堑暮砍嗽?70 ℃、9 s時有下降，其他條件均稍有升高。作為寡糖酯類化合物，3,6?-二芥子?；崽侵饕哉崽菫榛灸负?，以不同的糖苷鍵連接葡萄糖，少數連接鼠李糖后成為寡糖，寡糖與有機酸類形成酯。3,6?-二芥子?；崽窃谳^高溫條件下不穩定，連接?；鶜埢系孽ユI易發生斷裂，分解生成次級產物[24-25]。細葉遠志皂苷的含量在9 個滅菌條件下均有所升高，可能是遠志中原型皂苷類成分（如遠志皂苷B）性質不穩定，因受熱糖苷鍵斷裂，發生水解反應，轉化成細葉遠志皂苷，導致細葉遠志皂苷含量上升[26-27]。遠志酮Ⅲ、3,6?-二芥子?；崽呛图毴~遠志皂苷均是遠志中安神益智的主要活性成分，具有明顯減輕認知障礙和增強學習記憶能力的功效[28]。人參皂苷類成分都具有相似的基本結構，都含有由30 個碳原子排列成4 個環的甾烷類固醇核，屬于四環三萜類皂苷成分，滅菌后開心散中人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量均稍高于滅菌前，可能是不同皂苷之間相互轉化使兩者含量稍有升高，推測是高溫滅菌過程中對人參進行了炆制處理，與華國棟等[29]炮制研究結果類似。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分，對治療神經退行性疾病和神經系統疾病具有較好的藥理作用，兩者在滅菌過程中含量稍有增加對開心散全方藥效發揮有益[30]。β-細辛醚和α-細辛醚均為石菖蒲中揮發油類成分，在高溫條件下穩定性較差。由表4、表5可知，滅菌后開心散樣品中β-細辛醚和α-細辛醚含量均有降低，且隨著滅菌溫度的升高和滅菌時間的延長其含量越來越低，但整體變化率未超過5%，可滿足滅菌過程有效成分含量變化要求。同時，本研究發現β-細辛醚和α-細辛醚的含量變化存在相反趨勢，可能是在此條件下β-細辛醚發生空間結構的重排，部分轉化為α-細辛醚。β-細辛醚和α-細辛醚能夠快速通過血腦屏障發揮藥理作用[31-34]。茯苓酸是茯苓的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、鎮靜催眠等藥理作用，在高溫瞬時滅菌后含量略有升高，對開心散全方藥效發揮有利[35]。綜上，在160 ℃時滅菌5 s，開心散中有效成分含量無明顯損失，可滿足滅菌工藝要求。

4 結論

滅菌是經典名方開心散制劑生產必不可少的關鍵操作。本研究根據開心散方中4 味中藥的特性和滅菌后樣品中有效成分含量變化情況，選擇了滅菌效率高、滅菌產品無潮濕結塊等優勢的高溫瞬時滅菌法，最終確定遠志、人參、茯苓和石菖蒲粗顆粒為2～8 目、滅菌溫度為160 ℃、滅菌時間為5 s 作為開心散最佳滅菌工藝條件。所得開心散滅菌樣品符合口服散劑的微生物限度要求，有效成分含量損失少，可為經典名方開心散的滅菌方法研究提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。