miRNA-589-5p調控氧糖剝奪人腦微血管內皮細胞損傷的機制

王欣麗 甄娜 楊海龍

(衡水市人民醫院,河北 衡水 053000)

腦小血管病發病隱匿,輕者可表現為認知功能障礙,重者可發展為腔隙性腦梗死、腦出血、腦卒中〔1,2〕,其發病機制與各種原因引起的內皮或血-腦屏障功能受損有關〔3～5〕。微小核糖核酸(miRNA)是一種廣泛參與人類多種疾病的內源性穩定單鏈非編碼小分子〔6〕,而miRNA-589-5p是新發現的參與內皮細胞損傷的miRNA,關于其對人腦微血管內皮細胞(HBMEC)功能的研究較少。本研究旨在探究miRNA-589-5p對氧糖剝奪誘導的HBMEC損傷的調控機制及其與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)3、核因子E2相關因子(Nrf)2/血紅素加氧酶(HO)-1信號通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1材料 HBMEC購自中國上?？茖W研究院細胞庫;改良Eagle培養基(DMEM)培養液購自美國Invitrogen;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;Lipofectamin3000轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)公司;真核表達載體pcDNA3.1均購自Promega公司;RNA抽提試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒均購自日本Takara公司;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術研究所;膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海百賽生物技術股份有限公司;封閉專用脫脂奶粉購自北京普利萊基因技術有限公司;空白對照的miRNA序列(miRNA-con)、miRNA-589-5p模擬物的miRNA序列(miRNA-589-5p mimics)、沉默空白對照序列(si-con)、沉默HDAC3序列(si-HDAC3)、陰性對照組的miRNA抑制劑序列(anti-miRNA-con)、miRNA-589-5p抑制劑的miRNA序列(anti-miRNA-589-5p)及引物的設計合成均委托上海吉瑪制藥技術有限公司。鼠抗HDAC3單抗、兔抗裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3 單抗、兔抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)多抗、兔抗Bcl-2多抗、兔抗NRF2多抗、兔抗HO-1多抗、HRP標記的二抗購自上海艾博抗貿易有限公司;Varioskan LUX型多功能酶標儀購自美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Bio-Rad ZE5型智能流式分析系統購自美國伯樂生命醫學產品有限公司。

1.2HBMEC的培養 10%胎牛血清+1%雙抗混合的DMEM培養液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細胞培養箱中常規培養,2 d更換1次新鮮培養液。

1.3細胞轉染與分組 將正常培養的HBMEC分為對照組(不做任何處理的HBMEC細胞)、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組、氧糖剝奪+si-con組、氧糖剝奪+si-HDAC3組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組、miRNA-con組、miRNA-589-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-589-5p組。氧糖剝奪組細胞的處理〔7〕:將10%胎牛血清+1%雙抗混合的DMEM培養液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養的HBMEC更換為無糖DMEM,94%N2、1%O2、5%CO2的37 ℃恒溫細胞培養箱中培養30 min。使用5倍DNA或質粒質量的Lipofectamin3000脂質體與DNA或質?；旌?將miRNA-con、miRNA-mimics、si-con、si-HDAC3、miRNA-589-5p+pcDNA、miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3依次轉染至HBMEC,轉染12 h,更換培養基進行氧糖剝奪處理。使用RT-PCR或Western印跡實驗檢驗轉染的效果。

1.4RT-PCR檢測細胞中miRNA-589-5p、HDAC3表達 用RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA,反轉錄試劑盒將其合成cDNA,做模板。用RT-PCR試劑盒,取2 μl cDNA與上游引物、下游引物、水及SYBR Premix Ex TaqTM在Mx3005P RT-PCR儀上進行擴增,記錄循環數(Ct)值。以U6、GAPDH為內參,2-ΔΔCt法計算miRNA-589-5p、HDAC3相對表達量。ΔCt目的基因=Ct實驗組目的基因-Ct對照組目的基因,ΔCt內參=Ct實驗組內參-Ct對照組內參,-ΔΔCt=-(ΔCt目的基因-ΔCt內參)。反應程序為95 ℃,2 min;95 ℃,30 min;58 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,4 min,45個循環。miRNA-589-5p上游引物5′-CGAGGTCAGCGTGATTTCATGG-3′,下游5′-TGTGTCCAAGTCCCAGCCAGAG-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′;HDAC3上游引物5′-GGAGCTGGACACCCTATGAA-3′,下游5′-TATTGGTGGGGCTGACTCTC-3′;GAPDH上游引物5′-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′,下游5′-GTGGCAGTGATGGCATGGA-3′。

1.5Western印跡檢測細胞中HDAC3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、NRF2和HO-1蛋白表達 將細胞放在冰上用RIPA裂解液處理30 min,提取總蛋白。檢測蛋白濃度,100 ℃沸水浴10 min變性,用上清做蛋白電泳樣本。取50 μg上清至于上層分離膠梳子孔,低壓溫流電泳至分離膠低端,換成高壓繼續電泳直至蛋白到達濃縮膠底端。使用轉膜儀將膠上的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,整個裝置維持在0 ℃。結束后,封閉液(含2.5%脫脂奶粉)37 ℃,2 h封閉膜。電泳液充分洗膜,滴加稀釋的一抗(鼠抗HDAC3單抗,1∶1 000;兔抗Cleaved Caspase-3 單抗,1∶2 000;兔抗Bax、Bcl-2、NRF2、HO-1多抗,1∶1 000),37 ℃,搖床孵育3 h,充分洗膜。滴加稀釋的二抗溶液〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,1∶500〕,37 ℃孵育2 h。洗膜后滴加ECL發光液,顯影定影曝光。使用Image J軟件分析蛋白的灰度值,目的蛋白灰度與內參蛋白(GAPDH)灰度之比表示目的蛋白相對表達水平。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清LDH 將細胞4 ℃低溫12 000 r/min離心10 min,取上清。按照LDH試劑盒要求操作,檢測細胞上清中LDH的相對表達情況。

1.7Annexin Ⅴ-FITC檢測細胞凋亡 將細胞先用PBS洗滌5次,再用結合緩沖液懸浮細胞,待用。取500 μl的懸浮細胞,加入10 μl的Annexin Ⅴ-FITC避光孵育15 min,再加入10 μl的PI避光孵育20 min,結束后,將細胞用300目篩過濾,立即置流式細胞儀檢測分析細胞的凋亡情況。細胞總凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)〔8〕。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗 在線預測網站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測miRNA-589-5p的靶基因發現,HDAC3是miRNA-589-5p的一個靶基因。根據預測到的結合位點化學合成含有結合位點的片段(HDAC3-WT)和不含結合位點的片段(HDAC3-MUT),插入熒光載體,構建熒光報告基因。將熒光報告基因與miRNA-con、miRNA-589-5p共轉染至細胞。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作,檢測分析細胞的熒光活性。用海參熒光素酶的活性與熒火蟲熒光素酶的活性的比值表示細胞的熒光活性。

1.9統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miRNA-589-5p和HDAC3在HBMEC細胞中的表達 與對照組相比,氧糖剝奪組細胞中miRNA-589-5p表達水平顯著降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達均顯著升高(均P<0.001)。見圖1、表1。

圖1 HBMEC細胞中HDAC3的蛋白表達

表1 檢測HBMEC細胞中miRNA-589-5p、HDAC3的mRNA和HDAC3蛋白的表達

2.2過表達miRNA-589-5p對氧糖剝奪誘導HBMEC細胞損傷、凋亡的影響 與對照組相比,氧糖剝奪組細胞中miRNA-589-5p表達、Bcl-2蛋白表達顯著降低,LDH、Cleaved Caspas-3、Bax蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-con組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p組細胞上述指標均反向變化?？梢?過表達miRNA-589-5p減輕氧糖剝奪誘導HBMEC細胞的氧化應激和凋亡。見圖2、圖3、表2。

1～4:對照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組

圖3 各組HBMEC細胞凋亡

表2 過表達miRNA-589-5p的HBMEC細胞中LDH表達及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達和凋亡率的影響

2.3miRNA-589-5p靶向HDAC3 通過靶基因在線預測軟件預測到HDAC3的3′UTR存在與miRNA-589-5p互補的8個核苷酸序列(圖4)。雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果如表3所示,miRNA-589-5p組HDAC3-WT細胞的熒光活性顯著低于miRNA-con組(P<0.05)。見表3。與miRNA-con組(0.41±0.08)相比,miRNA-589-5p組細胞HDAC3蛋白表達顯著降低(0.24±0.05,P<0.05),與anti-miRNA-con組(0.44±0.05)相比,anti-miRNA-589-5p組細胞HDAC3蛋白表達顯著升高(0.68±0.07,P<0.05)。見圖5,可見miRNA-589-5p靶向負調控HDAC3。

圖4 miRNA-589-5p 與HDAC3互補的結合位點

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4:miRNA-con組、miRNA-589-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-589-5p組

2.4沉默HDAC3對氧糖剝奪誘導HBMEC細胞損傷、凋亡的影響 與對照組相比,氧糖剝奪組細胞中HDAC3、LDH、Cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高,Bax-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與氧糖剝奪+si-con組相比,氧糖剝奪+si-HDAC3組細胞的上述指標發生顯著的反向調控。見圖6、圖7、表4。

1～4:對照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+si-con組、氧糖剝奪+si-HDAC3組

圖7 沉默HDAC3對氧糖剝奪誘導HBMEC細胞凋亡的影響

表4 沉默HDAC3對氧糖剝奪誘導HBMEC細胞中LDH表達及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達和凋亡率的影響

2.5過表達HDAC3部分逆轉過表達miRNA-589-5p對HBMEC細胞的保護作用 與氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組細胞miRNA-589-5p表達顯著降低,Bcl-2蛋白表達、細胞凋亡率、HDAC3、LDH、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖8、表5。

1,2:氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組

表5 沉默HDAC3部分逆轉過表達miRNA-589-5p對HBMEC細胞LDH表達及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達和凋亡率的影響

2.6miRNA-589-5p和HDAC3表達對HBMEC細胞NRF2/HO-1信號通路的影響 與對照組相比,氧糖剝奪組細胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-con組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p組細胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達均顯著升高(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組細胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖9、表6。

1～6:對照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組

表6 沉默HDAC3部分逆轉過表達miRNA-589-5p對HBMEC細胞NRF2和HO-1蛋白表達的影響

3 討 論

miRNA-589-5p在人類癌癥中的功能研究比較豐富,其在肝癌、前列腺癌、喉癌、腎癌等實體瘤中均扮演抑癌基因的角色〔9〕。但是miRNA-589-5p在血管內皮細胞中的作用研究甚少。Yu等〔10〕發現,miRNA-589-5p在高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞中低表達,作為環狀RNA UBAP2的下游吸附因子和EGR1的上游靶基因調控高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞的氧化應激、增殖和遷移。Yu等〔11〕通過氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的HBMEC細胞構建腦血管細胞損傷模型發現,miRNA-589-5p的表達明顯上調,抑制miRNA-589-5p能夠抵抗ox-LDL對HBMEC細胞的損傷作用。miRNA-589-5p在血管內皮細胞中的功能尚處于研究初期,其具體的功能仍有待繼續探究。本研究與Yu等〔11〕研究結果相悖,與Yu等〔10〕研究結果相吻合。進一步研究通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗發現,miRNA-589-5p能夠靶向負調控HDAC3的表達,猜測這可能與miRNA-589-5p抵抗氧糖剝奪誘導的HBMEC細胞損傷有關系。

有研究報道,抑制HDAC3能夠通過提高PPARγ的活性明顯改善氧糖剝奪-復氧誘導的HBMEC細胞的跨內皮通透性增加〔12,13〕。Lin等〔14〕研究發現,HDAC2在發生卒中后表達上調,而環境富集(EE)有益于腦卒中的恢復,并抑制HDAC2的上調,過表達HDAC2則可部分逆轉EE的恢復卒中功能,敲除HDAC2增強神經營養素和神經可塑性,說明HDAC2對于EE的功能恢復至關重要,精準靶向HDAC2可能成為中風恢復的新療法。Liao等〔15〕報道,小膠質細胞中HDAC3的缺失可以減輕缺血再灌注(I/R)誘導的神經炎癥和腦損傷,究其原因為HDAC3/p65/cGAS/STING信號通路參與I/R誘導的神經炎癥的發展,為缺血性腦卒中的治療提供新方向。本研究結果也顯示,過表達HDAC3部分逆轉了過表達miRNA-589-5p對氧糖剝奪誘導HBMEC細胞的保護作用。內皮細胞的損傷離不開氧化應激引起的細胞凋亡,而對氧化應激具有保護作用的藥物多數是通過Nrf2/HO-1信號通路的激活抑制內皮細胞的氧化應激和凋亡〔16,17〕。Yang等〔18〕研究發現,高糖能夠顯著降低Nrf2和HO-1的表達,降低線粒體膜電位,增加細胞內和線粒體活性氧(ROS)的生成,誘導BMECs的細胞骨架損傷和凋亡,線粒體ROS清除劑處理顯著上調HG誘導的BMEC中Nrf2和HO-1的表達,這伴隨著線粒體膜電位的提高和ROS的減少,表明線粒體ROS清除劑通過激活Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導的BMECs損傷具有保護作用。本研究說明,NRF2/HO-1信號通路參與miRNA-589-5p的改善氧糖剝奪誘導HBMEC細胞損傷的過程。本研究結果僅在體外得到初步證實,缺乏體內的動物實驗研究。

綜上,miRNA-589-5p改善氧糖剝奪HBMEC的損傷,產生這種作用的機制可能與靶向HDAC3,激活NRF2/HO-1信號通路的活性有關,為腦小血管病的治療提供新思路。