芳香化濁調氣法對功能性腹瀉大鼠AQP3、5-HT水平及血管活性腸肽表達的影響

馬曉菲 杜艷茹 張曉利 崔建從 吳佳欣

(1河北省中醫院,河北 石家莊 050000;2河北省中醫藥科學院)

功能性腹瀉(FD)是常見的消化系統疾病之一,主要臨床癥狀為排便次數增多和糞便性狀改變,其體現了腸道的動力亢進〔1〕。流行病學研究表明,FP在全世界范圍內發病率相對較高,我國顯著低于歐美國家,但顯著高于亞洲其他國家,嚴重影響了人類健康和生存質量〔2〕。目前臨床常用治療腹瀉的藥物為蒙脫石散,其雖能對消化道黏膜進行修復,改善臨床癥狀,但單一用藥見效較慢〔3〕。與西醫對癥治療相比,中醫通過對患者進行整體調節,在FD治療中優勢顯著。芳香化濁調氣法是從既往臨床研究經驗中總結而來,通過提脾運脾、調暢氣機對患者進行治療,是脾氣健運,達到泄瀉自止的效果〔4〕。研究發現,FD的發病因素中空腸對水運轉的異常是主要原因之一,其中水通道蛋白(AQPs)是影響水液運轉的重要蛋白通道之一,在腸道內廣泛表達,可調控腸道水液代謝,AQP3是AQPs常見的一種亞型〔5〕。5-羥色胺(HT)大部分表達于胃腸消化系統中,介導人體胃腸活動〔6〕。研究發現,5-HT可促進胃腸道運動、參與內臟感覺神經傳導、胃腸道對食物和水的吸收、分泌胃腸道消化液等作用〔7〕。但AQP3和5-HT在FP大鼠中的作用機制目前尚未見文獻報道,本研究通過制備FP大鼠模型,并給予芳香化濁調氣法干預,觀察其對大鼠AQP3、5-HT和血管活性腸肽(VIP)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只雄性Wistar大鼠購自北京維通利華技術有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2017-0003。3周齡,SPF級,體質量190～210 g,飼養于河北省中醫院SPF級實驗動物中心,保持室溫18～25 ℃,相對濕度50%～60%,普通級動物飼料飼養,飼養期間大鼠自由飲水進食,關照周期12 h∶12 h。大鼠均適應性飼養1 w后進行后續實驗。

1.2藥物 芳香化濁調氣法由茯苓15 g、紫豆蔻15 g、百合15 g、白芍15 g、雞內金15 g、藿香12 g、白扁豆12 g、大腹皮12 g、當歸12 g、川芎9 g、砂仁9 g、炒白術9 g、烏藥9 g、木香9 g組成(云南鴻翔一心堂藥液股份有限公司),由醫院制劑室加水煎煮10 min,經紗布過濾,于50 ℃環境下通過旋轉蒸發儀蒸發至終濃度1.5 g/ml,于4 ℃環境保存備用;鹽酸小檗堿片(云南明鏡亨利制藥有限公司);終濃度為0.3 g/ml的番瀉葉煎液(成都中醫藥大學附屬醫院門診中藥房)。

1.3試劑和儀器 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Rapidbio公司);生理鹽水(成都科倫藥業有限公司);SYNERGY H1型多功能全波段酶標儀(英國Bio Tek公司);RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.4分組 將60只大鼠隨機分為正常組(正常大鼠不做任何干預,給藥時給予等量生理鹽水干預),模型組(FD大鼠模型給予生理鹽水灌胃),藥物1組(模型組給予含生藥0.5 g/kg芳香化濁調氣方灌胃),藥物2組(模型組給予芳香化濁調氣法灌胃干預,劑量為生藥1.0 g/kg),藥物3組(模型組給予芳香化濁調氣法灌胃干預,劑量為生藥1.5 g/kg),對照組(模型組灌胃16.2 mg/kg鹽酸小檗堿干預),每組10只,各組均1 d/次,連續7 d,第21天后進行后續實驗。

1.5模型制備 模型組、藥物1組、藥物2組、藥物3組和對照組制備FD大鼠模型。大鼠均單籠飼養,于籠下鋪濾紙,給予大鼠25 ℃番瀉葉煎劑灌胃,計量為每天3 ml/次,均連續灌胃14 d。于第15天停止灌胃,各組均正常飲食進水,觀察第14～28天時大鼠的變化情況。評估造模前后大鼠糞便性狀,包括24 h總便粒數、稀便數、稀便率、稀便級、腹瀉指數,以判斷腹瀉模型制備是否成功。

1.6各組糞便性狀指標觀察 觀察并記錄籠下濾紙上大鼠糞便形狀、總顆粒數、稀便顆粒數及濾紙上污跡范圍,濾紙1 h更換一次,共觀察6 h。

1.6.1Bristol糞便性狀(BSS)評分 BSS評分標準依據Bristol糞便性狀分型判斷圖,共分為7型,依次對應分值為1～7分,1型為分散的干球樣便1分;2型為2分:團塊樣便;3型為3分:干裂的香腸樣便;4型為4分:柔軟的香腸樣便;5型為5分:柔軟的團塊樣便;6型為6分:糊狀樣便;7型為7分:水樣便。

1.6.2稀便率 根據濾紙上的污跡程度判斷稀便率,稀便率=稀便的粒數除以大便的總粒數。

1.6.3腹瀉指數 腹瀉指數=稀便率×稀便級。稀便級的判定方式:以濾紙上污跡直徑確定稀便級數,共分為4級:1級<1 cm;2級≥1 cm且<2 cm;3級≥2 cm且<3 cm;4級≥3 cm,稀便級=該鼠所有稀便級數之和/稀便次數。

1.7血清及組織中VIP含量檢測 糞便性狀指標觀察后麻醉各組大鼠,取腹主動脈血3 ml,于4 ℃環境下3 000 r/min離心20 min,收集上清液,用ELISA試劑盒檢測血清中VIP含量。取血后打開大鼠腹腔,分別取胃竇、十二指腸、結腸和下丘腦組織,生理鹽水沖洗,濾紙吸干表面水分,用生理鹽水制備成組織勻漿,離心組織勻漿收集上清液。用全自動酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度(D)值,計算處對應的濃度值。

1.8腸道組織中5-HT含量檢測 取血結束后,處死各組部分大鼠,開腹后快速取出回腸、近端結腸和遠端結腸(距肛門0.5 cm)各1 cm標本,將組織切碎后用生理鹽水制備呈組織勻漿,離心取上清液。采用ELISA法檢測腸道組織中5-HT水平。

1.9免疫熒光檢測結腸組織中AQP3表達 處死各組部分大鼠,打開腹腔,取距離盲腸3 cm處完整的結腸,將結腸組織固定于10%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋,切片機切成4 μm組織切片,脫蠟后置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復緩沖液中,置于微波爐內進行抗原修復。將自發熒光淬滅劑加入組織周圍反應5 min,沖洗后用血清白蛋白(BSA)孵育30 min。在組織中加入AQP3一抗(1∶200),孵育于4 ℃濕盒內;洗滌后加入二抗孵育50 min。再次加入二異丙醇胺(DIPA)染液中避光室溫孵育10 min。用抗熒光淬滅劑封片劑封片,置于熒光顯微鏡下觀察。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細胞核在紫外線照射下呈藍色,陽性表達為相應熒光素標記的紅色。

1.10統計學方法 采用Graphpad priam8.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況觀察 造模后大鼠出現活動減少,精神萎靡,呈縮肩拱背樣,體質量下降,毛色無澤,糞便濕軟或不成形;藥物干預后各組一般狀態得到明顯改善。

2.2各組糞便性狀指標比較 與正常組相比,模型組BSS評分、稀便率和腹瀉指數均顯著增加(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均不同程度降低,且藥物3組降低最為顯著(P<0.05);藥物3組和對照組較無顯著差異(P>0.05),見表1。

2.3各組腸道組織中5-HT含量比較 模型組回腸和結腸組織中5-HT含量較正常組顯著增加(P<0.05);藥物1組、藥物2組和藥物3組較模型組顯著降低,且藥物3組含量最低(P<0.05);藥物3組和對照組相比較無顯著差異(P>0.05),見表1。

2.4各組結腸組織中AQP3表達比較 模型組結腸組織中AQP3表達明顯低于正常組(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均明顯增加,且藥物3組增加最顯著(P<0.05);藥物3組較對照組無明顯差異(P>0.05),見表1、圖1。

表1 各組BSS評分、稀便率和腹瀉指數、5-HT、AQP3水平比較

圖1 各組結腸組織中AQP3表達比較(免疫熒光染色,×400)

2.5各組血清及組織中VIP含量比較 模型組血清及胃竇、十二指腸、結腸、下丘腦組織中VIP含量較正常組顯著降低(P<0.05);與模型組相比,藥物1組、藥物2組和藥物3組均顯著升高,且藥物3組變化最顯著(P<0.05);藥物3組和對照組比較無明顯差異(P>0.05),見表2。

表2 各組血清及胃竇、十二指腸、結腸、下丘腦組織中VIP含量比較

3 討 論

FD在全球范圍內有較高發病率,是常見的消化道功能性疾病,且在中國的發病率較其他亞洲國家明顯升高。FD不僅病程長且反復發作,不僅嚴重影響患者的生活,且對國家和社會的經濟造成沉重負擔〔8〕。目前現代醫學對FD的治療有一定的短期療效,但停藥后極易復發,使現代醫學在治療FD時有一定限制〔9〕。中醫將FD歸屬為“泄瀉”范疇,脾病濕盛是其主要病機,外邪、內傷以致臟腑虛衰是該病出現的主要原因〔10〕。濁毒辨證理論認為,濕為濁之源,濁為濕之甚,二者相互轉化,積濕為濁,濕遇毒而濁化,濁毒互結,久之則氣機不暢、日久痰濁,從而損傷肺腑,以致胃失和降、脾不升清、氣滯絡阻、氣滯絡阻,由此可知,濁毒為其致病關鍵,治則以化濁解毒、清熱通絡〔11〕。芳香化濁調氣法中的茯苓利水消腫、健脾滲濕,紫豆蔻開胃消食、化濕消痞,百合清心安神、養陰潤肺,白芍養血斂陰、平抑肝陽,雞內金澀精止遺、消食健胃,藿香芳香化濁、解暑止嘔,白扁豆健脾利濕、止瀉淡滲,大腹皮利水消腫、行氣寬中,當歸潤腸通便、補血活血,川芎活血行氣,祛風燥濕,砂仁溫中止瀉、化濕行氣,炒白術燥濕利水、健脾益氣,烏藥溫腎散寒、行氣止痛,木香調中導滯、和胃健脾,諸藥合用共奏燥濕化濁、健脾止瀉效果?，F代藥理學研究顯示,白扁豆中的有效成分能夠起到抗菌、抗病毒效果,能夠改善機體免疫功能,起到解毒、止瀉、止嘔效果。

中醫對FD的診斷標準為糞便清稀,大便次數增加,甚至水樣便;或表現為大便次數不多,糞質清稀;或表現為瀉下完谷不化,有反復發作病史。本研究結果提示芳香化濁調氣法可改善FD大鼠糞便性狀。馬曉菲等〔12〕研究證實,芳香化濁調氣法在FD患者治療中應用可提高臨床療效,降低中醫證候積分和復發率,有效改善生活質量。

研究發現,VIP對胃酸的分泌和胃蠕動均有一定抑制作用,不僅可抑制胃運動,還能有效對胃排空進行減緩〔13〕。本研究結果顯示,芳香化濁調氣法可增加血清中和組織VIP含量,減弱腹瀉大鼠胃蠕動。胡瑩等〔14〕研究證實,可通過降低腹瀉大鼠腸推進率,促進VIP的釋放緩解腸道平滑肌收縮,改善腹瀉。5-HT是一種重要的神經遞質,胃腸道運動和胃腸道分泌功能有一定調節作用,當腸道內聚集大量的5-HT時會導致中毒反應,進而導致胃腸道動力、分泌功能性及內臟高敏感性異常,介導慢性便秘、腹瀉等胃腸道功能性疾病的發生〔15〕。研究發現,腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中5-HT和褪黑素水平均高于空白組,腸道內大量5-HT可以使腸道收縮力增強,收縮幅度降低,通過降低腸道內5-HT水平可控制胃腸道的運動功能〔16〕。本研究結果顯示,芳香化濁調氣法可降低FD大鼠腸道內5-HT水平,進而對腸道的運動功能進行調節,與上述研究結果一致。

研究發現,AQPs可調控胃腸道內的水液代謝,可維持機體內水液含量保持在相對穩定的狀態〔17〕。AQPs家族在空腸黏膜上皮細胞中廣泛分布,其中AQP3是常見的亞型之一,可調節機體水的分泌、吸收及細胞內外水的平衡等。文獻顯示,FD中AQP3表達明顯低于正常大鼠,且腹瀉越嚴重結腸AQP3的表達水平越低〔18〕。由此可見,腸道內AQP3水平降低可導致腸道水液重復吸收功能障礙的發生〔19〕。本研究結果顯示,功能性腹瀉大鼠腸道中AQP3水平顯著降低,芳香化濁調氣法可明顯增加FD大鼠腸道中AQP3水平,進而增加腸道水液的吸收功能,調節水分轉運,進而起到改善腹瀉的作用。張琦等〔20〕研究證實,FD模型大鼠腸道內AQP3、AQP8水平顯著降低,通過增加AQP3、AQP8水平可明顯增加腸道對水的吸收功能,調節腸內外環境失衡。

綜上,芳香化濁調氣法可增加FD大鼠AQP3水平和FD水平,減少5-HT水平,對腸道水液吸收功能和運動功能進行改善,進而改善腹瀉。