枸杞子潛在燥性反應對小鼠特性表征的影響

張予心 楊蘭 靳雯棋 趙一名 孫立偉 劉芳兵

(長春中醫藥大學 1附屬醫院實驗中心,吉林 長春 130012;2藥學院;3東北亞中醫藥研究院)

燥性反應常出現口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫干澀、流鼻血、尿赤、便干等一系列癥狀,時常伴有全身性反應癥候〔1,2〕?，F有研究表明,引起燥性反應的生物機制與體內炎癥反應、氧化應激、激素調節、能量代謝等密切相關〔3～6〕,這一系列生理生化反應的失衡造成了人體亞健康狀態〔4～6〕。導致燥性反應的因素有很多,如環境、飲食、精神狀態等,而其中最關鍵的因素是體質。老年人體質逐漸衰弱,身體代謝能力、抗應激能力均不足,體內微環境長期處于炎癥狀態或自由基過剩,更容易產生燥性反應〔7,8〕。據《本草綱目》記載,枸杞子“能補腎、潤肺、生精、益氣”,其作為藥食同源的滋補佳品深受民眾喜愛〔6〕,特別是老年群體多喜用枸杞子泡水代茶或煲湯等。但確有部分人群服用枸杞子后出現燥性反應癥狀,表現為流鼻血、口干、咽喉腫脹、眼睛紅脹不舒服等癥狀,極大地制約了枸杞子的廣泛應用〔9,10〕。目前,服用枸杞子發生燥性反應現象的描述尚不完全。為更好認識枸杞子產生燥性反應的實質,本研究選擇最具代表性的干姜、肉桂、附子熱性藥方劑作為誘發燥性反應的陽性對照藥,其藥性辛熱燥烈,長期服用會誘發燥性反應癥狀〔11〕。本研文擬分析枸杞子潛在燥性反應對小鼠特性表征的影響。

1 材料與方法

1.1材料 儀器:真空凍干機,SCANVAC,沈陽基因有限公司;離心機,Centrifuge 5810 R,德國Eppendorf AG;酶標儀,Infinite M200 PRO,澳大利亞TECAN;石蠟包埋機,JB-P5,武漢俊杰電子有限公司;組織切片機,RM2016,上海徠卡儀器有限公司;光學顯微鏡,M8,德國PreciPoint。試劑:枸杞子、肉桂、附子、干姜購于北京同仁大藥房;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于江蘇酶免實業有限公司;4%多聚甲醛、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Triton-X-100購于北京索萊寶科技有限公司;羊血清購于美國Thermo Scientific;CD68一抗和二抗購于武漢Proteintech。動物:雄性10月齡C57BL/6小鼠購自沈陽長生生物技術有限公司,飼養于SPF級動物房,恒溫(25±2)℃,恒濕(55±5)%,光照周期12 h,自由攝取食水,適應期7 d。本研究所有動物實驗操作符合長春中醫藥大學動物倫理委員會規定。

1.2枸杞子提取物的制備 將100 g枸杞子以1 L水煮沸1 h,將煎液倒出,再加1 L水煮沸1 h,將兩次煎液合并,以8 000 r/min離心,棄沉淀,將提取物制成凍干粉,稱量后置于干燥處備用。

1.3熱性藥煎液的制備 取肉桂、附子、干姜各30 g,加水900 ml,同1.2中方法制備。

1.4動物實驗 將40只小鼠隨機分為空白組、熱性藥方組(1.5 g/kg)、枸杞低劑量組(1.8 g/kg)、枸杞高劑量組(3.6 g/kg),每組10只,每天上午灌胃給藥,空白組給予等量鹽水。每天灌胃1次,稱體質量、食物重量、飲水量,測量肛溫,連續14 d。第15天處死小鼠,取血液與組織樣本。

1.5糞便含水量 收集各組小鼠新鮮糞便,稱量等量新鮮糞便,經凍干,稱量凍干糞便重量,含水量=新鮮糞便重量-凍干糞便重量。

1.6生化指標檢測 各組血液在37 ℃放置30 min,3 000 r/min離心10 min取血清。按照ELISA試劑盒說明書步驟,于450 nm波長處,分別檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6、CC家族趨化因子配體(CCL)2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)。

1.7脾臟指數 稱量各組脾臟重量,取與第15天各自體質量的比值,脾臟指數=脾質量/第15天體質量×100%。

1.8HE染色 將脾組織放入4%多聚甲醛,浸泡24 h,然后經酒精脫水、二甲苯透明化、石蠟包埋后,制成5 μm厚的冠狀切片,再經二甲苯與酒精脫水,然后進行蘇木素染色,氨水返藍,伊紅染色,最后風干封片,光學顯微鏡下觀察組織結構。

1.9免疫組化 將脫水后的石蠟切片用0.3% Triton-X-100孵育30 min,用5%羊血清封閉2 h,然后在4 ℃孵育CD68一抗過夜,第2天室溫孵育二抗2 h,最后光學顯微鏡下觀察染色結果。

1.10統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行ANOVA檢驗。

2 結 果

2.1枸杞子提取物引起小鼠燥性反應體征變化 從小鼠形態上觀察,空白組毛發順滑油亮,熱性藥方組毛發干燥,枸杞低劑量組毛發未見異常,然而枸杞高劑量組干燥。與空白組比較,熱性藥方組、枸杞子高劑量組體質量顯著下降,飲水量顯著升高,熱性藥方組進食量顯著降低(P<0.05);體溫略有升高但無統計學差異(P>0.05)。各組糞便含水量均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組燥性反應體征及脾臟CD68表達、脾臟指數比較

2.2枸杞子提取物引起小鼠脾臟的病理變化 空白組脾臟紅髓與白髓界限分明,脾小體清晰完整,無巨噬細胞浸潤,脾竇無異常擴張,細胞分布均勻。熱性藥方組脾血竇增多,細胞排列略散亂,但紅髓與白髓較分明,無巨噬細胞浸潤,與空白組相比無顯著差別。枸杞低劑量組無明顯異常,與空白組相比紅細胞更充盈。枸杞高劑量組脾臟紅髓與白髓界限模糊,脾小體輪廓不清晰,有巨噬細胞浸潤(黑色箭頭),有幾處血竇擴張(黃色箭頭)。見圖1?？瞻捉M、熱性藥方組與枸杞低劑量組脾臟中單核/巨噬細胞標志物CD68表達量很低,而枸杞高劑量組較空白組顯著升高(P<0.05)。枸杞高劑量組脾臟指數也顯著高于空白組(P<0.05),陽性藥方組、低劑量組與空白組無統計學差異(P>0.05)。見表1。

圖1 各組脾臟病理

2.3枸杞子提取物引起小鼠體內炎癥反應 熱性藥方組和枸杞高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2水平顯著高于空白組(P<0.05);枸杞低劑量組TNF-α和IL-1β水平顯著高于空白組(P>0.05),見表2。

2.4枸杞子提取物引起小鼠體內氧化應激損傷 與空白組相比,熱性藥方組及枸杞高劑量組SOD、CAT及GSH-px水平顯著降低,MDA水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);枸杞低劑量組CAT水平顯著降低(P>0.05),見表2。

表2 各組炎癥因子及氧化應激反應指標比較

3 討 論

枸杞子作為補品深受老年人喜愛,但過量攝入可能會出現燥性反應癥狀,如口干咽痛、眼睛腫脹、頭疼等〔9〕。本研究顯示,給予老年小鼠低劑量(藥典規定劑量)和高劑量(2倍藥典規定劑量)枸杞子提取物,與經典熱性藥方體征相似。結合現代醫學理論,燥性反應是一種機體穩態失衡的表現,然而老年人機體很容易因為飲食不當而產生穩態失衡〔3,8〕。機體的穩態是由體內各種生理生化反應及各個組織相互維系,任何一個器官或生理反應的異常,都會導致燥性反應證候〔4,6〕。脾是人體重要的免疫器官,脾臟組織的變化可直接影響機體免疫功能,脾胃不和者過量食用枸杞子容易燥性反應〔9,12〕。

炎癥反應是機體進行自我保護的最重要反應之一,當受到異物入侵,多種炎癥因子、趨化因子水平升高,參與抵抗外物侵襲〔13〕。當機體內自由基過多,氧化反應超過抗氧化作用會導致氧化應激,抗氧化酶類活性降低,機體產生大量氧化中間產物,參與多種疾病過程,還促進牙齦腫痛、大便干結等燥性反應癥狀〔14〕。

枸杞子雖滋補,但過量食用會導致脾濕加重,滋生內火,老年人陰液不足者更易引發燥性反應。依據現代醫學理論,過量食用枸杞子引發炎癥反應和氧化應激,然而老年人抵抗應激能力下降,易誘發“燥性反應”證候。本研究通過對小鼠體征變化、脾組織病理變化的觀察及炎癥反應、氧化應激檢測,首次闡釋了過量食用枸杞子引起燥性反應的作用機理。然而,燥性反應的生物內涵十分復雜,更深層的作用機制還有待進一步研究。