木犀草素減輕小鼠潰瘍性結腸炎損傷的作用機制

王瑋 楊淑媚 羅丹 李啟祥 尹合坤

(江門市中心醫院消化內科,廣東 江門 529030)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種復雜的慢性、免疫介導的炎癥性腸病〔1〕。雖然目前針對UC的治療在臨床上具有一定療效,但長期藥物治療(如5-氨基水楊酸、激素等)會引起明顯的副作用〔2〕。木犀草素(Lut)可在金銀花、野菊花等多種植物中提取。Lut作為一種抗氧化劑和抗炎劑,可用于多種疾病治療〔3〕。研究發現,Lut可通過調控細胞凋亡和自噬改善小鼠實驗性結腸炎〔4〕。據報道,蛋白酪氨酸激酶(JAK)2/信號轉導與轉錄激活因子(STAT)3是機體重要的經典炎癥通路,可通過調節巨噬細胞極化來抑制機體炎癥反應〔5〕。推測Lut可能通過JAK2/STAT3信號通路調控巨噬細胞極化從而減輕UC損傷。葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的UC模型已被廣泛使用〔6〕。本研究構建DSS誘導的UC小鼠模型,探討Lut減輕小鼠UC損傷的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1動物和試劑、儀器 80只8～10周齡、體質量21～25 g的SPF級雄性健康C57BL/6小鼠〔SCXK(京)2019-0009〕由北京維通利華公司提供。在(20～25)℃、40%～60%的相對濕度下飼養,自由進食、飲水。本研究經醫院倫理委員會批準。Lut(491-70-3,純度HPLC≥98%)、蘇木素(H104306)、伊紅染色液(E292725)購自上海Aladdin;DSS(42867-25G)購自美國Sigma;小鼠白細胞介素(IL)-6(PI326)、IL-1β(PI301)、IL-10(PI522)及腫瘤壞死因子(TNF)-α(PT512)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海BEYONTIME;抗體:磷酸化(p)-JAK2(ab32101,130 kD)、p-STAT3(ab267373,88 kD)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax,ab32503,21 kD)、胱天蛋白酶(Caspase)-3(ab32351,32 kD)、Bcl-2(ab32124,26 kD)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS,ab178945,131 kD)、精氨酸酶(Arg)-1(ab233548,35 kD)及β-Actin(ab8226,42 kD);TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(SNM535-DUH)購自北京百奧萊博;JAK2抑制劑AG490(SIH-428-25MG-E)購自加拿大StressMarq。實驗中所有涉及的引物均由上海生工合成。RM2125RTS石蠟切片、DMILLED熒光顯微鏡購自德國Leica;CFX 384多通道熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統購自美國Bio-Rad。

1.2小鼠UC模型構建及分組 將80只小鼠分為4組(根據體質量微調,盡量使各組體質量均衡),每組20只,分別為Control組、DSS組、DSS+Lut組及DSS+AG490組。小鼠馴化3 d后開始處理,除Control組外,其余各組連續7 d給予溶于飲用水3% DSS誘導UC模型〔4〕。DSS+Lut組和DSS+AG490組小鼠經口灌胃給予Lut(50 mg/kg)〔6〕和AG490(10 mg/kg)〔5〕,連續7 d,1次/d,Control組和DSS組給予等量生理鹽水。于第8天頸椎脫臼處死小鼠,取結腸測量長度,再進行后續分析。每天對各組小鼠進行稱重〔體質量下降率(%)=(原體質量-下降后的體質量)/原體質量×100%〕,采用疾病活動指數評價各組小鼠病情〔7〕。

1.3組織學分析 結腸組織用4%多聚甲醛固定進行石蠟包埋和連續切片(3.5 μm)。用蘇木素和伊紅染色,并使用Image-Pro Plus5.0系統獲得圖像。測量隱窩深度,對組織的結腸損傷進行評分〔8〕。評分范圍為0～4分,無上皮損傷和炎癥浸潤0分;杯狀細胞輕度減少和炎癥浸潤到隱窩1分;杯狀細胞相對廣泛減少和黏膜肌層炎癥浸潤2分;廣泛杯狀細胞減少,隱窩輕度減少,黏膜肌層廣泛炎癥浸潤3分;隱窩廣泛減少,黏膜下層炎癥浸潤4分。

1.4實時熒光定量(qRT)-PCR檢測巨噬細胞標志物iNOS、Arg-1的表達水平 加入Trizol試劑提取各組結腸組織總RNA并制備cDNA,經qRT-PCR儀檢測iNOS、Arg-1 mRNA相對表達量引物序列(5′-3′)為:iNOS上游GGCAGCCTGTGAGACCTTTG,下游GCATTGGAAGTGAAGCGTTTC;Arg-1上游GGGAA-GACAGCAGAGGAGGT,下游TAGTCAGTCCCTGGC-TTATGG;GAPDH上游CCGCATCTTCTTGTGCAGT,下游GGCAACAATCTCCACTTTGC。

1.5ELISA檢測炎癥因子水平 采用ELISA測定結腸組織中促炎因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)和抗炎因子(IL-10)水平,按照試劑盒說明書操作。

1.6Western印跡檢測JAK2/STAT3通路及凋亡相關蛋白表達 RIPA法提取結腸組織總蛋白,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%脫脂牛奶封閉2 h后添加一抗:iNOS、Arg-1、p-JAK2、p-STAT3、Bax、Caspase-3、Bcl-2及β-Actin,4 ℃隔夜孵育,隔天使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,添加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育2 h,PBS沖洗后添加電化學發光(ECL)顯色液顯影,拍照。使用Quantity One軟件分析灰度值。目的蛋白相對表達=目的蛋白條帶灰度值/β-Actin條帶灰度值。

1.7TUNEL法測定細胞凋亡 結腸組織用4%甲醛室溫固定,洗滌、脫水、石蠟包埋,切成4 μm切片。按照TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒的說明書進行。染色后呈棕色細胞核的細胞為TUNEL陽性細胞(即凋亡細胞),在熒光顯微鏡下對凋亡細胞進行統計。

1.8統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、獨立t檢驗。

2 結 果

2.1Lut對DSS誘導UC損傷的影響 如表1、表2所示,與Control組相比,在飲用DSS第3天后小鼠體質量下降率逐漸明顯升高(P<0.05),DSS組結腸組織長度顯著縮短,疾病活動指數及隱窩深度均顯著增加(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組體質量下降率顯著降低,結腸組織長度顯著加長,疾病活動指數及隱窩深度均顯著降低(P<0.05)。

表1 各組體質量下降率

表2 各組結腸損傷指標

2.2Lut對DSS誘導的小鼠結腸組織病理學的影響 如圖1所示,Control組結腸黏膜上皮細胞排列整齊,結構完整;腸壁黏膜和隱窩結構完好,杯狀細胞齊整;無中粒細胞浸潤,無炎癥表現。DSS組結腸黏膜上皮細胞排列紊亂;隱窩膿腫形成,杯狀細胞耗竭;中性粒細胞浸潤,有炎癥體現;DSS+Lut組和DSS+AG490組結腸黏膜上皮細胞損傷得到一定的恢復;隱窩結構幾乎復原,杯狀細胞增多,結構恢復;中性粒細胞浸潤降低,炎癥得到有效改善。與Control組〔(0.35±0.03)分〕相比,DSS組具有更高的病理學評分〔(7.65±1.15)分;t=29.719,P<0.05〕;與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組病理學評分〔(3.96±0.84)、(3.71±0.62)分〕明顯降低(t=15.022、16.040,均P<0.05)。

圖1 各組結腸組織病理學(蘇木素-伊紅染色,×200)

2.3Lut對DSS誘導的結腸組織中巨噬細胞極化的影響 如圖2、表3所示,與Control組相比,DSS組結腸組織中iNOS、Arg-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05);與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結腸組織中iNOS mRNA和蛋白表達水平明顯下降,Arg-1 mRNA和蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)。

圖2 各組結腸組織中iNOS、Arg、Bax、Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達

2.4Lut對DSS誘導的結腸組織中炎癥反應的影響 如表3所示,與Control組相比,DSS組結腸組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著增高,IL-10水平顯著降低(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結腸組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低,IL-10水平明顯增高(P<0.05)。

表3 各組結腸組織中iNOS、Arg-1 mRNA和蛋白表達及IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10水平比較

2.5Lut對DSS誘導的結腸組織細胞凋亡的影響 如圖2、表4、圖3所示,與Control組相比,DSS組結腸組織中細胞凋亡率顯著增加,Bax與Caspase-3蛋白表達均顯著增高,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結腸組織中細胞凋亡率顯著減少,Bax與Caspase-3蛋白表達均顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著增高(P<0.05)。

表4 各組結腸組織中凋亡細胞與Bax、Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達比較

圖3 各組細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.6Lut對DSS誘導的結腸組織中JAK2/STAT3通路的影響 如圖2、表4所示,與Control組相比,DSS組結腸組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達顯著增高(P<0.05)。與DSS組相比,DSS+Lut組和DSS+AG490組結腸組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

UC是由結直腸黏膜免疫系統功能障礙引起的慢性非特異性炎癥,其發病率呈上升趨勢〔1〕。DSS是一種水溶性硫酸化多糖,可破壞腸黏膜屏障的完整性,誘導UC,主要特征為結直腸潰瘍、炎癥細胞浸潤及隱窩膿腫,是動物模型中誘發UC的理想選擇〔4〕。本研究首次在小鼠模型上證明Lut可以減輕DSS誘導的小鼠UC損傷。Lut是一種多酚類黃銅化合物,可抑制腫瘤細胞的發生發展,還在一定程度上減輕器官性炎癥損傷〔3,4〕。然而,缺乏Lut在UC中的研究。本研究提示,Lut可以減輕DSS誘導的小鼠的UC損傷。大量炎癥因子釋放是UC進一步加重的重要原因〔9〕。本研究結果表明,DSS可促進小鼠UC的炎癥反應,Lut可以減輕DSS誘導的炎癥反應。研究表明,IL-6、IL-1β和TNF-α都是促炎因子,其表達上調表明機體炎癥反應加重〔10〕。IL-10是一種抗炎因子,其表達下調表明機體炎癥不能被抑制〔11〕。

研究表明,大量炎癥介質刺激巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞,是炎癥反應進展的原因之一〔12〕。在機體免疫過程中,巨噬細胞被激活成M1和M2兩種不同的極化表型〔13〕。其中M1型巨噬細胞主要分泌TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子,具有促進炎癥反應的作用;M2型巨噬細胞主要分泌IL-10等抗炎因子,抵抗機體炎癥反應〔14〕。研究顯示,iNOS是M1型巨噬細胞極化標志物,Arg-1是M2型巨噬細胞極化標志物,其表達水平增高表明巨噬細胞出現M1、M2型極化〔15〕。本研究表明,DSS可刺激機體產生炎癥反應,促進巨噬細胞M1、M2型極化;Lut通過抑制DSS誘導UC中M1巨噬細胞的極化,促進M2巨噬細胞的極化傾向,這與炎癥因子表達改變的結果一致。

據報道,腸上皮細胞凋亡是導致腸黏膜屏障損傷和UC的重要病理特征〔16〕。正常情況下,Bcl-2和Bax處于相對穩定的狀態并相互調節,意味著一旦這種穩定狀態被打破,可能會誘導細胞凋亡。Caspase-3被稱為死亡蛋白酶,不僅是哺乳動物的關鍵蛋白酶,還是多種凋亡途徑的關鍵下游效應物〔17〕。另外,已有研究顯示,在UC動物模型中Bax和Caspase-3等凋亡相關蛋白顯著增高,Bcl-2表達顯著降低〔18〕。因此,改善細胞凋亡對UC治療至關重要。本研究結果與前人研究結果一致〔18〕,提示Lut還可以抑制UC小鼠腸上皮細胞的凋亡。

本研究結果提示,Lut可以抑制UC小鼠中JAK2和STAT3的活化,Lut對小鼠UC損傷的保護作用可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來實現的。本研究發現,Lut可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活調控巨噬細胞極化,從而減輕DSS誘導的潰瘍性結腸炎損傷,因此它可能作為未來潛在的治療潰瘍性結腸炎藥物。然而,本研究還存在一些局限性,首先,并未設計單獨Lut組去探究Lut是否對健康小鼠存在影響;其次,由于實驗開始之初并未找到合適的JAK2激動劑,故并未設計JAK2激動劑是否可以逆轉來Lut對UC小鼠的保護作用。后續將針對以上不足重點探究,以完善Lut在UC中的保護機制。