烏梅丸及拆方對潰瘍性結腸炎模型大鼠炎癥因子和神經肽表達的影響

許宗穎 張冬梅 張雪麗 王文雅 張迪 陳萌

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種腸道非特異性炎癥性疾病,常見臨床表現為腹瀉、粘液膿血便及腹痛,病變主要涉及直腸、結腸黏膜和黏膜下層。UC在任何一個年齡段均可發病,且發病率呈上升趨勢[1]。UC的腸黏膜屏障改變及腸道免疫紊亂是UC的主要發病機制,神經肽分泌合成和釋放的異常存在于UC結腸組織的不同解剖層次,與疾病活動及結腸炎癥相關,神經—免疫網絡異常被認為是UC的病理機制之一。

烏梅丸在《傷寒論》原著中主要用于治療蛔厥、久瀉久利和厥陰病提綱證,多用于治療肝脾胃腸的功能失常,包括UC。烏梅丸中烏梅味酸澀性,斂肺澀腸;黃連、黃柏味苦,解煩治利;干姜、附子、肉桂、細辛、蜀椒味辛性溫熱,溫中祛寒;黨參、當歸味甘性平,健脾養肝,氣血雙補。在經方中烏梅丸這種四種不同藥味的配伍方式僅此一例,因此烏梅丸配伍研究具有很高的價值。

UC屬于中醫“久痢”“痢疾”“腸澼”等疾病范疇,寒熱錯雜是UC的主要證型之一[2]。UC病程長,病機復雜,與烏梅丸適應癥相符合。臨床及實驗室研究均證實烏梅丸對UC具有較好治療前景,烏梅丸能夠調節腸道免疫,減輕腸道炎癥。烏梅丸及其拆方能否通過神經—免疫網絡的途徑干預UC尚不明確。因此,本研究以烏梅丸四味獨特配伍形式進行拆方,通過觀察烏梅丸及拆方對UC模型大鼠炎癥因子、神經肽的作用,為烏梅丸治療UC的作用機制和配伍規律提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級雄性SD大鼠83只,體質量(220±20)g,合格證號:SCXK(京)2020-0033,由斯貝福(北京)生物技術有限責任公司提供。飼于SPF級動物房,室溫控制在(25±0.5)℃,相對濕度控制在50%～60%,采用12/12明暗光照,自由攝食飲水飼養。本研究遵循實驗動物倫理,并獲得北京中醫藥大學倫理委員會的批準(BUCM-4-2020092905-3119)。

1.2 實驗藥物

烏梅肉(批號:2005001)購于安國市聚藥堂藥業有限公司;黨參(批號:2002012)、干姜(批號:1911002)、當歸(批號:D2005028)購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司;黃連(批號:20200101)、黃柏(批號:20191201)、細辛(批號: 20191201)、肉桂(批號:20203001)、黑順片(批號:20200201)購于安徽桐花堂中藥飲片科技有限公司;花椒(批號:200401)購自廣東聯豐中藥飲片有限公司。中藥經鑒定均符合《2020中國藥典》一部各品種項下規定。

陽性藥柳氮磺胺吡啶腸溶片(Sulfasalazine,250 mg×60片,批號:09190605)產自上海信誼天平藥業有限公司。

各組藥物按照以下劑量配制:全方組:烏梅肉(醋制)25 g、炮附子6 g、干姜10 g、肉桂6 g、細辛6 g、花椒4 g、黃連16 g、黃柏6 g、黨參6 g、當歸4 g;酸味組:烏梅肉(醋制)25 g;苦味組:黃連16 g、黃柏6 g;辛味組:炮附子6 g、干姜10 g、肉桂6 g、細辛6 g、花椒4 g;甘味組:黨參6 g、當歸4 g。將各組生藥及陽性對照藥打成細粉,過五號篩,備用。

1.3 主要實驗試劑

造模試劑乙酸(acetic acid,AA)購自Alfa Aesar(中國)化工有限公司;麻醉劑戊巴比妥鈉購于Sigma化學試劑有限公司;大便隱血試劑盒(聯苯胺法)購自上海源葉生物技術有限公司;胃饑餓素、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、 P物質(substance P,SP)、五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)ELISA試劑盒購自RayBiotech生物技術有限公司;白介素(interleukin,IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、神經肽Y(neuropeptide Y,NPY)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRY)購自北京冬鴿生物有限公司。

1.4 主要實驗儀器

全自動組織脫水機(萊卡,ASP300S),半自動輪轉式切片機(萊卡,RM2245),多功能染色蓋片工作站(萊卡,ST5020-CV5030),超低溫全自動組織研磨儀(CLINX 6300),臺式高速冷凍型離心機(Eppendorf,5424R,5810R),酶標儀(BIO-RAD,iMark),光學顯微鏡(OLYMPUS-BX53)。

1.5 動物分組、造模與給藥

采用區組隨機法將實驗大鼠分為空白對照組、模型組、全方組、酸味組、苦味組、辛味組、甘味組、陽性藥組。其中,模型組13只,其余各組每組10只。

通過乙酸灌腸法復制潰瘍性結腸炎大鼠模型[3]。各組大鼠造模前24小時禁食不禁水。以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)劑量腹腔注射麻醉大鼠,將石蠟油浸潤嬰兒10 cm圓頭灌腸管,由肛門緩慢插入6～8 cm,將4%乙酸-生理鹽水溶液2 mL于1分鐘內緩慢推注入內,保持2分鐘后用4 mL生理鹽水沖洗干凈?？瞻讓φ战M灌以等量生理鹽水。每只大鼠使用新灌腸管,灌入乙酸后抬高大鼠臀部,夾閉肛門,防止乙酸漏出。造模24小時后,模型組隨機抽取3只大鼠進行造模效果評價。

4%乙酸造模24小時后,給藥組給藥劑量參考人(默認60 kg)和動物間按體表面積折算的等效劑量比值6.3折算,全方組大鼠每日給藥量為900 mg/kg,酸味組270 mg/kg,苦味組235 mg/kg,辛味組340 mg/kg,甘味組110 mg/kg,陽性藥組300 mg/kg,以10 mL/kg大鼠體質量的容量灌胃給藥,每日2次,連續7天。模型組和空白對照組每天給予等量的蒸餾水灌胃。實驗結束后模型組、辛味組大鼠死亡3只,全方組、酸味組、甘味組、陽性藥組死亡2只,苦味組死亡1只。

1.6 樣品采集與處理

末次給藥后,各組大鼠禁飲禁食12小時后取材。麻醉方式同前,腹主動脈取血,1 200 g離心10分鐘分離血清。取遠端結腸6～8 cm,觀察潰瘍并拍照,取一段10%多聚甲醛中固定,剩余結腸用預冷PBS沖洗表面污物,濾紙吸干,-80℃凍存備用。

1.7 指標檢測

1.7.1 疾病損傷指數(disease damage inde,DAI)評分 DAI評分包括體重減輕、大便質地、便血[4]。根據糞便潛血檢測試劑盒的使用說明進行大便出血檢測。造模后每隔一天觀察DAI,動態觀察結腸損傷程度和給藥組的干預效果。

1.7.2 結腸組織病理檢查 組織病理學觀察取固定的結腸組織,常規程序化梯度脫水,乙醇二甲苯混合溶液、二甲苯程序化透明。處理好結腸組織后進行石蠟包埋,常規化修塊、4～5 μm切片、展片、貼片、烤片。制片完成后進行蘇木素—伊紅染色,光學顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化。比較各組大鼠結腸粘膜層、黏膜下層和肌層的結構完整程度,大腸腺結構、隱窩形態、及炎性細胞的變化。

表1 DAI評分標準

1.7.3 血清炎癥細胞因子和結腸組織神經肽水平檢測 采用ELSIA法檢測各組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α及結腸組織5-HT、胃饑餓素、VIP、SP、NPY、CGRY水平。具體操作按照說明書進行。

1.8 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠DAI評分

在飼養期間,空白對照組大鼠精神狀態良好,食欲、活動正常,體重逐漸增加,大便質地軟硬適中。乙酸造模后,大鼠糞便不成形,可見肉眼血便,體質量明顯下降(P<0.05)。實驗過程中,模型組大鼠少動,食欲減退,飲水量減少,體重增長緩慢,毛色灰黃無光澤,脫毛,炸毛,大便質地偏軟,不成形。各給藥組大鼠體重逐漸增加,精神狀態較好,進食和飲水量減少,毛發黃,無光澤,大便質地偏軟。

與空白對照組比較,模型組、全方組、酸味組、苦味組、辛味組及陽性藥組大鼠體質量增量明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較,模型組大鼠大便質地、便血及DAI評分明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。全方組、酸味組、苦味組DAI評分明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較,甘味組大鼠體質量增量增加(P<0.05),全方組、酸味組、苦味組及陽性藥組大鼠便血減少(P<0.05),各給藥組DAI評分均降低(P<0.05),差異有統計學意義。見表2。

表2 各組UC模型大鼠體質量增量及DAI評分結果

2.2 各組大鼠結腸組織病理學變化

結腸組織大體觀察結果表示,經4%乙酸造模后,結腸組織大面積充血潰爛,提示造模成功。給藥7天后,模型組結腸組織仍可見0～2 cm2大小的潰瘍,結腸壁增厚明顯,與周圍組織粘連,肉眼可見充血。各給藥組大鼠存在局部充血,部分大鼠結腸組織與周圍組織粘連。

經蘇木素—伊紅染色后,空白對照組結腸組織結構相對完整,固有層內有許多腸腺。黏膜下層和肌層結構完整。乙酸造模后結腸結構破壞,局灶區廣泛的黏膜扭曲、脫落,腸腺大量減少,隱窩消失、萎縮;可見大量炎性細胞浸潤,炎癥細胞浸潤粘膜下層。模型組大鼠結腸組織中結腸上皮細胞部分丟失,隱窩結構改變、分支、扭曲、萎縮,基底部增厚,粘膜基底部漿細胞增多。各給藥組大鼠結腸上皮結構存在部分缺失,隱窩較模型組增加,保留大量黏液,可見淋巴細胞組和隱窩形態改變。見圖1。

注:A 空白對照組;B 模型組(造模結束);C 模型組(實驗結束);D 全方組;E 酸味組;F 苦味組;G 辛味組;H 甘味組;I 陽性藥組。

2.3 各組大鼠血清組織炎癥表達水平

與空白對照組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平升高(P<0.05),差異具有統計學差異意義。

與模型組比較,全方組、酸味組、苦味組、辛味組、甘味組、陽性藥組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低(P<0.05)。各給藥組之間存在統計學差異,其中,酸味組、苦味組、辛味組IL-6水平較甘味組降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組UC模型大鼠血清炎癥因子水平

2.4 各組大鼠結腸組織神經肽表達水平

與空白對照組比較,模型組大鼠結腸組織VIP、SP、胃饑餓素、5-HT、NPY水平顯著增加(P<0.05),CGRY水平顯著降低(P<0.05)。

與模型組比較,全方組、苦味組、陽性藥組大鼠結腸組織VIP、SP、胃饑餓素、5-HT、NPY水平顯著降低(P<0.05),CGRY水平顯著升高(P<0.05)。與模型組對比,酸味組大鼠結腸組織VIP、SP、胃饑餓素、5-HT、NPY降低(P<0.05);辛味組大鼠結腸組織VIP、胃饑餓素、5-HT降低(P<0.05),SP、CGRY水平顯著升高(P<0.05);甘味組大鼠結腸組織VIP、SP、胃饑餓素、NPY降低(P<0.05),CGRY水平顯著升高(P<0.05)。辛味組大鼠結腸組織SP水平較其余給藥組大鼠結腸表達水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組UC模型大鼠結腸組織神經肽表達水平

3 討論

五味理論是藥性理論的核心之一,通過五味與功效的關系指導臨床遣方用藥。五味本身也體現了陰陽的消長,如辛甘發散屬陽,酸苦涌泄屬陰。經方中僅烏梅丸一例通過四味合法配伍從運動和數量兩方面協助人體的開闔消長過程。烏梅丸四味配伍同時實現了溫陽滋陰、補虛瀉實、寒熱并調、氣血兼治,可用于治療證候錯雜、反復發作性疾病,尤其適合肝脾胃腸功能失常。因此,本研究基于四味配伍方式對烏梅丸進行了拆方,從酸、苦、辛、甘四味來觀察對UC大鼠的治療具有協同或獨特的作用。

UC的病理機制比較復雜,神經—免疫網絡在UC病理過程中發揮雙向調節作用。腸道免疫屏障改變誘導炎癥反應發生,炎性介質刺激神經肽分布和表達水平異常[5],神經肽又能參與炎癥反應。促炎細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α是UC的炎癥標志物,TNF-α誘導其他促炎細胞因子如IL-6的分泌和結腸腺癌的轉化,TNF-α單抗英夫利昔已經被用于UC的治療[6]。IL-6是早期結腸炎相關癌發生的關鍵腫瘤啟動子,UC患者中呈增高表達[7]。IL-8能夠吸引中性粒細胞、T細胞,研究表明上調與內鏡檢查嚴重程度正相關[8]。本課題組前期研究證實了烏梅丸能夠減輕UC大鼠的炎癥反應和UC的嚴重程度[9]。此次結果表明烏梅丸抗炎作用可能與抑制促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的表達有關,各拆方組DAI評分均降低,對UC具有初步的改善作用,酸、苦、辛、甘組能抑制IL-6,IL-8,TNF-α的水平,說明四味可能通過協同作用抑制炎癥反應。

神經肽是神經—免疫網絡的中間物質,多種神經肽參與UC的炎癥免疫反應。VIP能夠促進結腸修復和內穩態,抑制促炎細胞因子如IL-2、IL-6、γ干擾素的分泌來保護粘膜炎癥[10]。炎癥相關的水腫與VIP表達有關,VIP能調節粘膜水和電解質的分泌[11]。結腸VIP過度分泌會導致水樣腹瀉,UC出現的便溏及大便次數改變有關與該神經肽有關[12],部分研究表明患者結腸組織和血漿VIP增加[13]。本研究表明乙酸誘導的潰瘍性結腸炎大鼠模型中結腸組織的VIP升高,烏梅丸及拆方組對VIP水平具有明顯的降低作用,烏梅丸四味配伍可能通過VIP共同發揮止利作用。烏梅丸及其拆方可能直接調控和間接通過VIP抑制IL-6的釋放。

SP是一種神經肽和疼痛傳遞介質,大量SP會對腸動力起抑制作用[14]。SP濃度與UC的疾病活動程度呈正相關,UC乳糜瀉患者尤其明顯[15]。神經末梢SP釋放可以激活血小板釋放5-HT,共同影響腸道分泌、運動[16]。本研究發現UC模型大鼠SP顯著升高,模型處于UC活動期,全方組、酸味組、苦味組、甘味組均能降低SP,全方改善SP的效果更明顯。辛味是五味中特殊的氣味,辛味與痛覺相關,辛味藥具有增加血流,血管通透性和強鎮痛的藥理作用,這種作用可能與辛味藥刺激SP大量釋放有關。研究發現附子、丁香這兩位辛味藥的配伍也能導致便秘大鼠血清P物質水平的升高[17],這與本文的研究結果類似。

胃饑餓素是一種潛在的UC神經肽指標,具有促進食欲和增加生長激素分泌、影響細胞的增殖和生存、顯著的抗炎活性的作用,相關研究表明UC血漿和結腸黏膜胃饑餓素水平升高[18]。本研究發現UC模型大鼠胃饑餓素水平升高,表明給藥組能降低模型組高水平胃饑餓素水平,其中,苦味組、辛味組似乎能更好發揮調節作用。

NPY刺激水和電解質的吸收,引起血管收縮,參與腸道應激反應[19]。NPY被認為具有促炎作用,在UC患者和DSS大鼠結腸炎模型中均發現免疫細胞激活后能夠表達NPY,NPY以自分泌的形式調節免疫細胞[20]。UC患者自主神經系統亢進,患者心理壓力增大,外周NPY水平增高,而進一步刺激腸道炎癥[21]。本研究表明UC模型大鼠結腸組織NPY水平升高,全方組、酸味組、苦味組、甘味組均能降低NPY水平,表明烏梅丸及其拆方可能通過減輕炎癥和壓力發揮作用。

CGRY是感覺神經的主要成分,是UC診斷和治療的靶點,CGRY能調節巨噬細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞,抑制T細胞的增值,降低巨噬細胞抗原提呈和活化淋巴細胞[22]。在UC患者和動物模型中可見CGRY mRNA水平明顯降低,與UC疾病程度相關[23]。本研究認為CGPY的水平與模型選擇可能有一定的關系,乙酸化學灼燒能夠直接損傷神經叢,降低CGPY的表達。全方組、苦味組、辛味組和甘味組升高CGPY水平,可能通過刺激CGPY修復神經存在的保護和促進黏膜愈合作用,或通過神經—免疫網絡途徑發揮作用。

5-HT參與調控腸道分泌、蠕動、內臟敏感性[24],研究表明5-HT還參與單核細胞/巨噬細胞中細胞因子的釋放、T-淋巴細胞的激活和中性粒細胞的招募[25]。UC患者和動物模型可見結腸黏膜5-HT釋放量增加,炎性浸潤的結腸黏膜能夠誘導釋放更多的5-HT,且釋放量與UC疾病活動程度呈正相關[26-27]。5-HT的增加也是導致UC患者腸分泌增加和內臟高敏感的原因之一,還能影響腸道分泌和吸收NPY[24]。異常高水平的5-HT也是造成UC患者發生情感障礙的危險因素之一[28]。本研究表明乙酸模型5-HT水平顯著高于對照組,烏梅丸全方及其拆方能夠降低5-HT水平,可能通過調節5-HT水平發揮改善內臟敏感和便溏癥狀的作用。烏梅丸及其拆方對UC炎癥的抑制作用可能也能通過降低5-HT水平實現,這種調節作用是烏梅丸各拆方的協同作用。

本研究還觀察了陽性藥SASP對UC標志性神經肽的作用,SASP對神經肽和細胞因子均具有較好的調節作用。綜上,烏梅丸及其拆方能夠通過調節結神經—免疫網絡中神經肽和細胞因子這一機制來干預UC,全方作用神經肽范圍更為廣泛,其余各拆方組對部分神經肽具有調節作用,各拆方組能夠通過協同作用發揮抗炎作用。