調脾安腸方對裸鼠結腸癌肝轉移灶miR-34a-5p、Notch1/NF-κB表達的影響

王玉坤 孫適然 張津鋮 程志強

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球特別是亞洲地區消化系統高發腫瘤之一[1]。肝臟為CRC最常侵犯的臟器[2],結腸癌肝轉移(colorectal cancer liver metastasis,CLM)是導致CRC高死亡率的重要因素,臨床療效尚不理想。微小RNA(microRNA,miRNA)被視為癌癥治療的新興候選者。研究發現異位表達的MicroRNA-34a(miR-34a)能通過抑制CRC細胞增殖、遷移等途徑干預CLM的進程[3]。目前對miR-34a及其下游靶基因在CLM上的基礎研究較少。

Notch1是腫瘤壞死因子超家族的成員,在結腸癌、乳腺癌等腫瘤組織中高表達;核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是Notch1的下游靶點,Notch1/NF-κB信號軸與CRC惡性潛能及CLM進展程度密切相關。筆者通過文獻[4]及TargetScan分析證實miR-34a與Notch1的3’UTR高度同源配對,miR-34a能通過介導Notch1信號通路抑制乳腺癌細胞生長。那么,Notch1是否也是miR-34a在CLM中的潛在靶基因,亟待探索。

CLM中醫歸屬“積聚”“傳舍”等范疇。文獻及前期研究發現CLM患者的中醫證型以脾氣虧虛為主,臨證治宜健脾益氣[5-9]。中日友好醫院院內制劑調脾安腸方以益氣健脾為總法,兼具化濕解毒、疏肝養血之功,臨床療效確切,但作用機制尚不明晰。本研究擬通過構建脾臟注射結腸癌HCT-116細胞法構建裸鼠CLM模型,觀察使用調脾安腸方前后裸鼠肝病理組織中miR-34a-5p、Notch1/NF-κB信號軸的表達變化,探討調脾安腸方防治CLM的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級雄性Balb-c裸鼠30只,5～6周齡,體質量(20±5)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司(動物合格證號:NO.110324221100912737)。動物于中日友好臨床研究所無特殊病菌的SPF級環境飼養[許可證號:SYXK(京)2010-0011],室溫(20±2)℃,相對濕度為(65±5)%,自然光暗周期,正常飲食。動物實驗遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》,并通過中日友好醫院倫理委員會審查批準(zryhyy61-21-03-54)。

1.2 實驗藥物

調脾安腸方藥物組成:黃芪15 g、黨參10 g、茯苓10 g、生薏米10 g、炒山藥10 g、蓮子肉10 g、砂仁6 g、佛手10 g、香櫞10 g、馬齒莧10 g、炒白扁豆10 g、炒山楂10 g、枸杞子10 g、黃精10 g、沙棘6 g、炒雞內金10 g、炙甘草6 g、大棗5 g。中藥飲片購自中日友好醫院,水煎,濃縮至含生藥2 g/mL(按成人和小鼠等效劑量換算,約為成人臨床用量的8倍[10])。

1.3 主要實驗試劑

HCT-116-LUC-tdT細胞株來源于國家生物醫學實驗細胞資源庫。伊紅染色液(批號:MD911477,北京百奧思科),蛋白定量(protein quantification kit,BCA)試劑盒(批號:MD913053,北京百奧思科),聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(批號:ISEQ00010,美國Millipore公司),蛋白質中分子量marker(批號:26617,美國THERMO公司)。目的一抗:兔抗鼠Notch1抗體和兔抗鼠NF-kB p65抗體(批號分別是ab52627、ab16502,英國Abcam公司),內參β-actin抗體(批號:AF7018,美國Affinity公司)。RNA提取試劑盒(TRIZOL,批號:10296028,美國ABI-invitrogen公司),UltraPure Agarose(批號:16500100,美國ABI-invitrogen公司),SuperScript III RT 逆轉錄kit(批號:11752050,美國ABI-invitrogen公司),Sybr qpcr mix(批號:11752050,美國ABI-invitrogen公司)。

1.4 主要實驗儀器

光學顯微鏡(德國Leica公司,型號:DM3000),高速冷凍離心機(美國THERMO公司,型號:LEGEND MICRO 21R),電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設備廠,型號:HWS-24),蛋白垂直電泳儀(北京百晶生物技術有限公司,型號:BG-subMIDI),分光光度計(美國THERMO公司,型號:Nanodrop lite),低溫高速離心機(美國SCILOGBX公司,型號:D3024R),熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號:StepOne Software),全自動化學發光圖像分析系統(上海勤翔科學儀器有限公司,型號:ChemiScope6100)。

1.5 實驗方法

30只裸鼠適應性飼養1周后,采用隨機數表法分為空白組、模型組、中藥組,每組10只。除空白組外,其余各組裸鼠用脾臟原位注射HCT-116-LUC-tdT細胞法建立CLM模型[11]。采用0.3%戊巴比妥鈉溶液0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉裸鼠,約3～5分鐘麻醉成功后,將實驗動物固定在小動物手術臺上。碘酒腹部術前消毒,打開裸鼠腹腔,找到柳葉狀脾臟,牽引出體外,用微量注射器吸取含懸好的HCT-116-LUC-tdT單細胞液0.2 mL(細胞數約為1×107個/mL)輕緩地注射進脾臟內,拔針后用酒精棉簽按壓針口,同時輕壓脾臟使癌細胞經脾靜脈進入肝臟。檢查無出血后,把脾輕緩地移回腹腔內,關閉腹腔,在縫合處抹碘酒消毒,放到保溫毯上等待蘇醒。接種后正常飼養2周。

2周后將模型組與中藥組裸鼠予異氟烷吸入麻醉后,腹腔注射50 μL熒光素鉀鹽(50 mg/mL),固定裸鼠,將活體成像儀調整參數到熒光素酶通道,曝光時間1分鐘,觀察肝轉移模型?；铙w成像結果證實肝轉移瘤模型成模后,中藥組予調脾安腸方(2 g/mL)灌胃給藥0.2 mL,每日一次;空白組及模型組予等體積0.9%生理鹽水0.2 mL灌胃,每日一次,共2周。(因疫情檢測時間延遲,空白組檢測5只;模型組:成模5只,檢測3只;中藥組:成模9只,檢測5只。)

1.6 標本采集

末次灌胃后禁食不禁水24小時,采用脫頸法處死裸鼠,打開腹腔,剪下脾臟,放入10 mL離心管中,固定液固定。取出肝臟,將最大葉剪下放入10 mL離心管,采用4%多聚甲醛固定,用于病理切片制備,剩余肝組織放入1.5 mL凍存管,經液氮桶速凍后-80℃冰箱保存,以備后續分子生物學檢測。

1.7 檢測指標

1.7.1 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肝臟病理組織形態 肝臟組織固定后,經脫鈣和80%、90%、95%、100%濃度乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋、切片,二甲苯脫蠟,100%、95%、90%、80%、70%濃度乙醇梯度順序脫水,蒸餾水洗;蘇木素染色3～8分鐘,伊紅染色1～3分鐘,隨后梯度脫水透明、干燥、封片;于100、400倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態變化,并采集圖片。

1.7.2 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測肝臟病理組織Notch1、NF-κB p65蛋白表達 取肝病理組織0.1 g,液氮勻漿后加入裂解液(PMSF+RIPA)后勻漿、4℃,12 000r/min離心15分鐘后取上清,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,蛋白上樣Buffer將蛋白定量為5 mg/mL;采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白(80 V);通過轉移電泳方式轉移蛋白至PVDF膜上(65 V,2小時);搖床上常溫使用封閉液(TBST+脫脂奶粉)封閉1小時,洗膜(3次,每次10分鐘);孵育一抗(1∶1 000),4℃冰箱過夜,同上洗膜;孵育二抗(1∶5 000),室溫搖床1小時,同上洗膜;ECL試劑盒中兩種發光液等比混合,均勻鋪在PVDF膜表面,室溫作用4分鐘。棄去膜上液體,放入化學發光成像系統,采集數據。

1.7.3 實時熒光定量PCR檢測肝臟病理組織中miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65的mRNA表達 稱取肝組織100 mg加液氮研磨,用1mL trizol室溫裂解5分鐘,4℃下,12 000 r/min離心(離心半徑7 cm)10分鐘,吸取上清液,加入700 μL異丙醇,充分震蕩混勻,室溫孵育3分鐘,4℃下,12 000r/min離心(離心半徑7 cm)10分鐘;棄去上清液,加75%乙醇洗滌沉淀一次,室溫晾干;加入50 μL DEPC水溶解RNA沉淀;洗脫RNA并測純度、濃度跑膠鑒定。取1 μg RNA進行逆轉錄,制備cDNA模板。依照試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測,miR-34a-5p以u6基因(u6)為內部參照基因;Notch1、NF-κB p65 mRNA以β-actin為內部參照基因。引物序列見表1,采用兩步法進行PCR擴增。測定并分析miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65 mRNA相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 肝臟組織病理形態學情況

各組裸鼠肝組織經HE染色后100倍光鏡下觀察,與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織中可見大面積嗜堿性瘤灶,其內細胞排列紊亂,腫瘤細胞呈浸潤性生長,與正常肝組織分界不清;與模型組比較,中藥組裸鼠肝臟組織中瘤灶面積明晰縮小,呈膨脹性生長,與正常肝組織分界較清。400倍光鏡下,空白組裸鼠肝臟病理組織中肝細胞形態規則,細胞核、細胞質著色均一,核分裂像罕見;與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織瘤灶內腫瘤細胞排列紊亂,細胞核及細胞質著色不均一,可見大量病理性核分裂象;與模型組比較,中藥組裸鼠肝臟瘤灶內腫瘤細胞可見少量病理性核分裂象。見圖1。

注:紅色圓圈所示為結腸癌肝轉移灶中腫瘤細胞病理性核分裂象。

2.2 肝臟組織Notch1、NF-κB p65蛋白表達情況

與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織中Notch1、NF-κB p65蛋白表達顯著上調(P<0.05)。與模型組比較,中藥組裸鼠肝臟病理組織中Notch1蛋白表達顯著降低(P<0.05);NF-κB p65蛋白表達降低,但組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2,表2。

注:A 空白組;B 模型組;C 中藥組。

表2 各組裸鼠CLM模型肝臟組織中Notch1、NF-κB p65蛋白表達情況

2.3 肝臟組織miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65的mRNA表達情況

與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織中miR-34a-5p表達顯著下調(P<0.01);Notch1、NF-κB p65的mRNA表達顯著上調(均P<0.01)。與模型組比較,中藥組裸鼠肝臟組織中miR-34a-5p表達升高,但組間差異無統計學意義(P>0.05);Notch1、NF-κB p65的mRNA表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 各組裸鼠CLM模型肝臟組織中miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65 mRNA表達情況

2.4 肝臟組織miR-34a-5p和Notch1 mRNA表達水平的相關性情況

如圖3所示,應用調脾安腸方后裸鼠肝臟病理組織中miR-34a-5p表達上調、Notch1 mRNA表達下調,二者表達水平呈負相關(r2=0.8845,P<0.05)。

圖3 miR-34a-5p和Notch1 mRNA表達水平的相關性情況

2.5 肝臟組織Notch1和NF-κB p65的mRNA表達水平相關性情況

如圖4所示,應用調脾安腸方后裸鼠肝臟組織中Notch1 mRNA表達下調,NF-κB p65 mRNA表達顯著下調,二者表達水平呈正相關(r2=0.9291,P<0.01)。

圖4 Notch1和NF-κB p65的mRNA表達水平相關性情況

3 討論

CLM在歷代古籍中并無明確病名記載,據其中醫證候特點,可納入中醫“黃疸”“積聚”“鼓脹”“傳舍”等病證范疇。誠如張景岳所云“凡脾胃不足及虛弱失調之人多有積聚之病……正氣不行則邪滯得以居之”,CRC患者以脾氣虧虛為病理基礎,脾虛則運化失司,痰濕、瘀血、熱毒搏結,日久而成有形癌腫?；颊哂捎诩膊〉倪M展或手術、藥物治療后,中焦正氣常常會進一步受損,一方面,機體化生精微乏源,肝木枯竭,癌毒易于侵襲此至虛之處;另一方面,濕邪久滯化熱,濕熱膠著,壅遏氣機,加之肝血本虛,導致隨血液入侵的癌毒因肝內血流速度緩慢而易于稽留,形成傳舍。據此,脾虛是CLM發病的重要病機,亦是該病持續進展的關鍵病機。

調脾安腸方以益氣要藥黨參、黃芪為君;茯苓、炒山藥、生薏米、蓮子、炒白扁豆、砂仁健脾化濕,共為臣藥,固守中州,助君藥健后天之本;佛手、香櫞疏肝醒脾,行氣化痰;焦山楂、雞內金消導助運,調暢氣機;馬齒莧解肝經熱毒,清利濕熱;枸杞、黃精、沙棘滋肝陰、養肝血,諸藥為佐;甘草、大棗健脾和中、調和藥物為使。全方用藥平和,攻伐有道,健脾益氣和中以復中焦正氣,行氣化濕兼益肝養血以調理肝臟的病理狀態,符合“肝病實脾,肝脾同調”之道。CLM的臨床預后差,未經治療者的中位生存期僅有6.9個月[12]。目前手術是CLM西醫首選治療手段,但其獲益人群有限。因此,探索CLM發生發展過程中的分子機制,并以此為鑰匙解開中醫學確切療效的奧秘,將對挽救和延長患者生命具有深遠意義。

本研究采用脾臟原位注射HCT-116-LUC-tdT結腸癌細胞法復制裸鼠CLM模型,結果顯示與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織中可見大面積嗜堿性瘤灶,腫瘤細胞呈浸潤性生長,病理性核分裂象多見;與模型組比較,調脾安腸方中藥組裸鼠鏡下瘤灶面積明顯縮小,腫瘤細胞呈膨脹性生長,病理性核分裂象較之減少。這提示調脾安腸方能抑制CRC細胞分裂,降低其侵襲、遷移能力,防止其進一步向外周浸潤,從而延緩裸鼠結腸癌肝轉移進程。此結果與前期文獻結論相契合,即健脾益氣治法在CRC患者肝轉移防治方面發揮積極作用[13-14],健脾中藥能夠從多層面實現抑制結腸癌細胞增殖、遷移,促進凋亡[15-16]。

miRNA是一類高度保守的內源性單鏈非編碼RNA,可通過與靶基因的信使RNA(messenger RNA,mRNA)3'-UTR發生結合,進而在諸多腫瘤中作為原癌基因或腫瘤抑制因子異常表達,并介導下游廣泛靶基因的調控參與疾病的發生、發展[17],被視為近年來腫瘤研究的熱點機制之一。miR-34a定位于染色體1q36.22,是首個被證實由抑癌基因p53直接調控的miRNA,在正常組織中高表達,在眾多腫瘤中受到抑制[18]。臨床試驗發現miR-34a-5p在CRC組織中的表達顯著低于癌旁組織,且隨患者TNM分期和疾病進展呈下降趨勢[19]。進一步的離體實驗證實miR-34a在CRC細胞中的表達缺失引起結腸癌干細胞/祖細胞增多,導致癌細胞侵襲性發展[20];上調miR-34a表達能夠使細胞周期阻滯在G0/G1和S期之間,從而抑制CRC細胞增殖[21]。本研究結果表明,與空白組裸鼠相比,模型組肝臟病理組織中miR-34a-5p表達顯著降低,應用調脾安腸方后中藥組裸鼠miR-34a-5p表達較模型組改善,但組間差異無統計學意義,考慮樣本量較少導致。

Notch蛋白是一種跨膜蛋白,作為細胞膜表面受體在細胞間信號傳導過程中發揮不可小覷的作用[22]。研究表明Notch信號通路為腫瘤細胞中最活躍的通路之一,其介導的相關因子的失調,是腫瘤生長和轉移的重要驅動因素[23]。四個受體中Notch1被報道與CRC最為相關,其能通過決定腸道干細胞的分化方向影響腸道粘膜屏障,進而參與CRC的發生和發展[24]。臨床研究發現,從正常結腸粘膜組織到原發性和轉移性結腸癌患者的病理組織,Notch1的表達呈進行性增加[25]。此結論與細胞層面的結果吻合,即Notch1信號通路在人原發性CRC細胞系中被異常激活,令后者的增殖、侵襲與遷移能力增強,促進遠處轉移的發生[26]。

NF-κB為促炎、誘導免疫反應的經典信號,是Notch1的下游靶點?；罨腘F-κB過度表達,通過結合啟動子和增強子中不連續的DNA序列,調控基因表達,增強炎癥粘附性,加速腫瘤細胞分化、增殖、血管生成,抑制凋亡[27-29],因而作為關鍵炎癥介質參與CRC的起始、進展和轉移。研究數據表明,Notch1和NF-κB在CRC患者病理組織中異常表達,并與患者組織分化程度、淋巴結轉移及Dukes分期相關[30]。Notch1/NF-κB信號通路的異常激活促進CRC細胞的增殖、遷移和血管生成,活化水平與CRC進展程度相關,調控其轉錄與表達能夠促進CRC細胞的凋亡影響CLM的發生[31-32]。

本研究結果顯示,與空白組比較,模型組裸鼠肝臟組織中Notch1、NF-κB p65蛋白及mRNA表達均顯著上調;中藥組裸鼠Notch1、NF-κB p65蛋白及mRNA表達呈不同程度降低。進一步相關性分析發現,中藥組裸鼠肝臟病理組織中Notch1 mRNA與miR-34a-5p表達水平呈負相關,與NF-κB p65 mRNA表達水平呈正相關。

綜上所述,本研究提示Notch1為miR-34a-5p直接靶基因,調脾安腸方可以基于miR-34a-5p,靶向負性調節Notch1/NF-κB通路表達,抑制裸鼠CLM過程。研究不足之處在于未能解釋調脾安腸方具體以何種方式上調CRC細胞表達miR-34a-5p,需大樣本實驗進一步探索。