雷公藤內酯醇對腦缺血再灌注大鼠小膠質細胞M1/M2型極化的影響

白 雪 王亞博 閆偉嬌 霍好利 邢瑞敏 王雪瑩

(1 河北省邯鄲市中心醫院,邯鄲,056008; 2 河北醫科大學,石家莊,050017)

我國居民缺血性腦卒中發病率約1 256/10萬,是致殘和致死的主要疾病之一,給患者家庭和社會造成沉重負擔[1]?；謴脱茉偻ㄊ桥R床治療缺血性腦卒中的首選方案,但腦缺血再灌注(Cerebral Ischemia Reperfusion,CIR)損傷卻嚴重影響著缺血性腦卒中患者預后。CIR損傷病理機制復雜,有研究證實炎癥反應對CIR損傷進展發揮著重要作用,可作為防治CIR損傷新藥研究的靶點[2]。小膠質細胞是中樞神經系統固有免疫細胞,數量占膠質細胞的10%～20%,有文獻[3-4]報道腦缺血及再灌注過程刺激小膠質細胞極化,對炎癥反應有重要調控作用。

雷公藤衛矛科藤本植物,以根莖入藥,味苦性寒,具有祛風通絡、舒筋活血等功效,常用于風濕關節痛、腰腿痛、麻風等癥的治療。雷公藤內酯醇(Triptolide,TPL)為雷公藤的主要活性成分之一,是一種二萜內酯單體化合物,具有良好的抗炎活性[5]。Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4,TLR4)是定位于小膠質細胞的一種跨膜識別受體,其能夠誘導核因子κB活化而誘導腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、細胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)等炎癥介質表達,加重炎癥損傷[6]。TPL能夠抑制TLR4/核因子κB信號通路對大鼠類風濕關節炎、鼻炎具有一定抑制作用[7-8],但TPL對CIR后小膠質細胞極化以及炎癥反應的影響尚未見文獻報道。本研究旨在探討TPL對CIR大鼠小膠質細胞極化和炎癥反應的影響,以期為TPL應用于CIR損傷防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 192只清潔級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,8周齡,體質量230～260 g,購自河北伊維沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002]?？刂骗h境分籠飼養,飲水和進食不限。本研究經邯鄲市中心醫院倫理委員會審核通過[倫理審批號:HDZXLL(K)2021-013]。

1.1.2 藥物 TPL(純度≥99.0%,上海柘智生物科技有限公司,貨號:38748-32-2);丁苯酞(石藥集團恩必普藥業有限公司,批號:51817104)。

1.1.3 試劑與儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium Chloride,TTC)、抗熒光淬滅劑(北京博奧森生物技術有限公司,貨號:D10513、C02-04003);蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)試劑盒和TNF-α、IL-1β、IL-10、ICAM-1酶聯免疫吸附試驗法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,貨號:G1120、SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0006、SEKR-0030);兔源離子鈣銜接分子-1[Ionized Calcium-binding Adapter Molecule-1,Iba-1(綠光)]、CD86(紅光)、CD206(紅光)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)標記羊抗兔IgG二抗(GeneTex公司,美國,貨號:GT10312、GT12709、GT12725、GT08384);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液(Sigma公司,美國,批號:24894278);兔源TLR4、核因子κB、p-核因子κB、β-actin抗體和辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:19811-1-AP、14220-1-AP、15506-1-AP、81115-1-RR、30000-0-AP);二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)、超敏化學發光(Efficient Chemiluminescence,ECL)試劑盒(上海碧云天生物科技公司,貨號:P0011、P0018S)。組織切片機(上海徠卡儀器有限公司,型號:RM2016);熒光顯微鏡(Nikon公司,日本,型號:Eclipse Ti);顯微鏡(Olympus公司,日本,型號:BX51);電泳儀(無錫久平儀器有限公司,型號:JY300);轉膜儀(Bio-Rad公司,美國,型號:Blot SD);酶標儀(Bio-Rad公司,美國,型號:iMark)。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥與造模 將適應性培養1周后的192只實驗用SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、丁苯酞(6 mg/kg)組和TPL低(0.2 mg/kg)、中(0.4 mg/kg)、高(0.8 mg/kg)劑量組,每組32只。模型組、丁苯酞組和TPL低、中、高劑量組大鼠采用線栓阻斷大腦中動脈2 h的方法復制CIR大鼠模型[9];假手術組行手術通路但不阻斷大腦中動脈。再灌注24 h后檢測各指標。

1.2.2 給藥方法 藥物溶液配制:精確稱量TPL并溶解于生理鹽水中制備濃度0.16、0.08、0.04 mg/mL的TPL溶液,精確稱量丁苯酞并溶解于生理鹽水中制備濃度為1.2 mg/mL的丁苯酞溶液。造模手術前3 d開始,丁苯酞組1次/d腹腔注射濃度1.2 mg/kg的丁苯酞溶液[10],TPL低、中、高劑量組分別1次/d腹腔注射濃度0.04、0.08、0.16 mg/mL的TPL溶液[11],假手術組和模型組1次/d腹腔注射生理鹽水,各組腹腔注射劑量均為5 mL/kg。

1.2.3 大鼠神經功能和腦梗死率檢測 各組隨機取8只大鼠,依照LONGA等[12]報道4分法行神經功能缺失評分:無癥狀記0分;缺血對側前肢不能完全伸展記1分;行走時向缺血對側轉圈記2分、向缺血對側跌倒記3分;行走功能喪失或反正反射消失記4分。麻醉后頸椎脫臼處死,開顱取腦、置-20 ℃冰箱凍存20 min、均勻厚度冠狀切為5片,浸于2% TTC染液中避光37 ℃染色30 min(梗死區呈蒼白色),應用Image Pro Plus軟件計算腦梗死率。

1.2.4 腦含水量檢測 各組隨機取8只大鼠,麻醉后頸椎脫臼處死,開顱取腦稱重為濕重,置烘箱烘干至恒重后為干重,腦含水量(%)=濕重-干重/濕重×100%。

1.2.5 缺血側皮層神經元病理學變化觀察 各組隨機取8只大鼠,麻醉后頸椎脫臼處死,開顱取腦,經4%多聚甲醛處理后,依次行脫水、透明、石蠟包埋后5 μm切片,部分切片按試劑盒說明行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,通過顯微鏡觀察缺血側梗死灶周圍皮層神經元病理學變化。

1.2.6 缺血側皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-10、ICAM-1含量檢測 取各組剩余的8只大鼠,麻醉后頸椎脫臼處死,開顱取腦并分離缺血側皮層組織,加入4 ℃預冷生理鹽水后研磨勻漿,4 ℃、3 000 r/min離心(離心半徑10 cm)10 min取上清液,依照試劑盒說明處理后,通過酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-10、ICAM-1含量。

1.2.7 缺血側皮層小膠質細胞極化表型檢測 取部分腦組織石蠟切片,經脫蠟水化、檸檬酸鈉緩沖液抗原修復和血清封閉處理后,分別滴加CD86/Iba-1(1∶100/1∶100)、CD206/Iba-1(1∶100/1∶100)4 ℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline,PBS)沖洗5 min×3次后加入FITC標記IgG二抗(1∶200)室溫避光孵育1 h,PBS沖洗5 min×3次后加入DAPI復染細胞核,抗熒光淬滅劑避光封片后通過熒光顯微鏡觀察,每張切片選取缺血側皮層梗死灶周圍互不重疊的5個視野計算陽性細胞率(同時著紅、綠、藍色熒光細胞占同時著綠、藍色熒光細胞的百分率)。

1.2.8 缺血側大腦皮質組織TLR4、核因子κB、p-核因子κB蛋白表達檢測 取缺血側大腦皮質組織勻漿上清液,4 ℃、12 000 r/min離心(離心半徑10 cm)20 min取上清,BCA法總蛋白定量后,十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉后,加入TLR4(1∶800)、核因子κB(1∶1 000)、p-核因子κB(1∶1 000)和內參β-actin(1∶1 500)一抗稀釋液4 ℃孵育12 h,洗膜后加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h,洗膜后加入ECL顯影,通過Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 TPL對CIR大鼠神經功能、腦梗死率、腦含水量的影響 與假手術組比較,模型組神經功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,TPL中、高劑量組和丁苯酞組神經功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量顯著降低(P<0.05);與丁苯酞組比較,TPL高劑量組腦梗死率顯著降低(P<0.05)。見圖1,表1。

圖1 TPL對CIR大鼠腦梗體積的影響

表1 TPL對CIR大鼠神經功能、腦梗死率、腦含水量的影響

2.2 TPL對CIR大鼠缺血側皮層神經元病理學變化的影響 假手術組皮層神經元形態飽滿、排列整齊有序。模型組缺血側皮層神經元數量減少、排列紊亂,可見胞漿固縮深染、空泡變性、核膜核仁邊界不清,炎癥細胞浸潤等病理學變化。較模型組,TPL低、中、高劑量組和丁苯酞組缺血側皮層神經元病理學變化不同程度改善,TPL高劑量組改善效果優于其他組。見圖2。

圖2 TPL對CIR大鼠缺血側皮層神經元病理學變化的影響(HE,×400)

2.3 TPL對CIR大鼠缺血側皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-10、ICAM-1含量的影響 與假手術組比較,模型組缺血側皮層組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量顯著升高,IL-10含量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,TPL中、高劑量組和丁苯酞組TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量顯著降低,IL-10含量顯著升高(P<0.05);與丁苯酞組比較,TPL高劑量組TNF-α、ICAM-1含量顯著降低,IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 TPL對CIR大鼠缺血側皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-10、ICAM-1含量的影響

2.4 TPL對CIR大鼠缺血側皮層小膠質細胞極化表型的影響 與假手術比較,模型組缺血側皮層M1型小膠質細胞標志物CD86/Iba-1陽性細胞率顯著升高,M2型標志物CD206/Iba-1陽性細胞率顯著降低(P<0.05);與模型組比較,TPL中、高劑量組和丁苯酞組M1型標志物CD86/Iba-1陽性細胞率顯著降低,M2型標志物CD206/Iba-1陽性細胞率顯著升高(P<0.05);與丁苯酞組比較,TPL高劑量組M1型標志物CD86/Iba-1陽性細胞率顯著降低,M2型標志物CD206/Iba-1陽性細胞率顯著升高(P<0.05)。見圖3,表3。

圖3 TPL對CIR大鼠缺血側皮層小膠質細胞M1/M2型極化的影響(Ⅰ為M1型小膠質細胞標志物CD86/Iba-1熒光圖,Ⅱ為M2型小膠質細胞標志物CD206/Iba-1熒光圖)

表3 TPL對CIR大鼠缺血側皮層小膠質細胞M1型標志物CD86/Iba-1陽性細胞率和M2型標志物CD206/Iba-1陽性細胞率的影響

2.5 TPL對CIR大鼠缺血側皮層組織TLR4、核因子κB、p-核因子κB蛋白表達的影響 與假手術比較,模型組缺血側皮層組織TLR4、p-核因子κB表達顯著上調,p-核因子κB/核因子κB比值顯著降低(P<0.05);與模型組比較,TPL中、高劑量組和丁苯酞組TLR4、p-核因子κB表達顯著下調,p-核因子κB/核因子κB比值顯著降低(P<0.05);與丁苯酞組比較,TPL高劑量組TLR4、p-核因子κB表達顯著下調,p-核因子κB/核因子κB比值顯著降低(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 TPL對CIR大鼠缺血側皮層組織TLR4、 核因子κB、p-核因子κB表達的影響

表4 TPL對CIR大鼠缺血側皮層組織TLR4、核因子κB、p-核因子κB表達及p-核因子κB/核因子κB比值的影響

3 討論

雷公藤系衛矛科雷公藤屬藤本植物,又名震龍根、水莽子、斷腸草、紅紫根等,主要生長于我國臺灣、福建、浙江、湖南、安徽等長江流域以南地區,以根莖入藥,首載于《神農本草經》,具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血等功效,多用于免疫和炎癥疾病的治療。TPL是雷公藤根莖中提取的一種二萜內酯類化合物,具有良好的抗炎、抗凋亡等藥理學作用,能夠改善CIR大鼠神經功能,但其作用機制尚需要深入研究。

線栓法是制備CIR動物模型的經典方法,本研究發現CIR模型大鼠神經功能缺失評分、腦梗死率、腦含水量均明顯升高,缺血側皮層神經元呈現數量減少、排列紊亂、胞漿固縮、空泡變性、核膜核仁邊界不清,炎癥細胞浸潤等病理學變化,與楊瓊英等[13]報道一致;0.4～0.8 mg/kg TPL預處理可明顯降低CIR大鼠神經功能缺失評分、腦梗死率和腦含水量,明顯改善缺血側皮層神經元病理學改變,并且0.8 mg/kg TPL對腦梗死率和缺血側皮層神經元病變的改善作用明顯優于丁苯酞,說明TPL對大鼠CIR損傷具有保護作用。

CIR損傷病理發生非常復雜,其中炎癥損傷發揮著關鍵作用。小膠質細胞是腦神經系統的免疫主體,CIR過程能夠刺激小膠質細胞極化,存在可以相互轉化的M1和M2 2種極化表型,其中M1型小膠質細胞分泌炎癥介質TNF-α、IL-1β等而加重炎癥反應,M2型分泌抑炎因子IL-10而減輕炎癥反應[14-15]。TNF-α能夠刺激小膠質細胞、巨噬細胞等分泌TNF-α及其他炎癥介質,IL-1β可刺激內皮細胞分泌ICAM-1等黏附分子而加重炎癥細胞浸潤,從而加重炎癥損傷[16]。TLR4是定位于小膠質細胞的一種跨膜識別受體,主要在小膠質細胞M1極化表型表達[17]。TLR4能夠誘導核因子κB磷酸化,p-核因子κB核轉位后與DNA特定位點結合而誘導TNF-α、IL-1β等炎癥介質表達,進而加重炎癥損傷[18]。ZHAI等[19]和SHI等[20]發現抑制TLR4/核因子κB信號通路能夠減輕CIR大鼠炎癥損傷和神經元凋亡。本研究發現,0.4～0.8 mg/kg TPL預處理可明顯降低CIR大鼠缺血側皮層組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量并升高IL-10含量,降低M1型小膠質細胞標志物CD86/Iba-1陽性細胞率并提高M2型標志物CD206/Iba-1陽性細胞率,下調缺血側皮層組織TLR4、p-核因子κB表達并降低p-核因子κB/核因子κB比值,并且0.8 mg/kg TPL上述作用優于丁苯酞,說明TPL能夠抑制CIR大鼠炎癥反應,作用機制可能與TPL促進小膠質細胞M1型向M2型極化、抑制TLR4/核因子κB信號通路活化有關。

綜上所述,TPL可抑制大鼠CIR損傷,作用機制可能與促進小膠質細胞M1型向M2型極化,抑制TLR4/核因子κB信號通路活化及炎癥反應有關。本研究結果為TPL用于臨床防治CIR損傷提供了理論依據。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。