龍膽苦苷對果糖誘導小鼠高尿酸血癥的作用

李 靜 尚平平 楊 洋 何 姣 喬博靈

(1 西北大學生命科學學院,陜西省生物醫藥重點實驗室,西安,710016; 2 陜西師范大學生命科學學院藥用植物資源與天然藥物化學教育部重點實驗室,西安,710119)

隨著生活物質的極大豐富,人們的飲食結構發生了巨大的變化,高尿酸血癥成為現代人的高發疾病之一[1]。高尿酸血癥是患者體內嘌呤類物質代謝紊亂,尿酸生成過多或排泄減少,導致血清尿酸濃度升高的一種代謝性疾病。當血清尿酸濃度高于正常范圍,處于超飽和狀態時,尿酸可以尿酸鹽的形式沉積在關節、軟骨或臟器中,導致痛風,甚至發生尿酸性腎病。高尿酸血癥與心血管疾病、高血壓、肥胖、高血脂等也存在廣泛的關聯性[2-3]。因此,有效控制高尿酸血癥具有重要臨床意義。臨床上常用別嘌呤醇、丙磺舒等藥物,通過抑制尿酸生成或促進尿酸排泄,降低患者血清尿酸,進而減少相關疾病的發病。然而,這些藥物對患者的胃腸道和腎臟均有一定的刺激性和不良反應[4]。非布索坦雖然降尿酸作用顯著,但臨床試驗發現其有增加心源性死亡的風險[5],因此,研發新型高效抗高尿酸血癥的一線治療藥物十分必要。龍膽苦苷是存在于龍膽GentianascabraBunge.、秦艽GentianamacrophyllaPall.等中藥中的環烯醚萜苷類化合物,具有多種藥理作用,比如對胃黏膜損傷有保護作用、對炎癥性腸病、膽汁淤積型肝炎和肝功能失常有預防和治療作用等[6]。秦艽提取物在腺嘌呤和乙胺丁醇誘導的高尿酸血癥模型中,龍膽苦苷在氧嗪酸鉀制備的高尿酸血癥模型中均可通過調節尿酸轉運蛋白發揮降尿酸的作用[7-8]。本研究以果糖誘導的高尿酸血癥小鼠模型,進行龍膽苦苷降尿酸功效的評估,并考察其對肝臟尿酸生成關鍵酶-黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級昆明種小鼠60只,雄性,4周齡,體質量(20±3)g,西安交通大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(陜)2017-003。在研究過程中,所有動物均在12 h光照-黑暗周期、溫度(22±2)℃和相對濕度(55±5)%的條件下飼養。動物飼養和實驗操作均符合西北大學動物福利和倫理原則,審查批準編號:NWU-AWC-20181109M。小鼠適應性飼養1周,狀態良好。

1.1.2 藥物 龍膽苦苷為自行提取分離制備,經高效液相色譜測定,純度≥98.0%。別嘌呤醇(重慶科瑞制藥有限公司,國藥準字H50020455)。果糖(德國MP公司,批號20180518)。

1.1.3 試劑與儀器 谷丙轉氨酶(Glutamic Pyruvic Transaminase,GPT)和谷草轉氨酶(Glutamic Oxaloacetic Transaminase,GOT)檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司,貨號:R21819,R21814);尿酸(Uric Acid,UA)、肌酐(Creatinine,Cr)和尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)檢測試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司,批號:180161,180481,180321);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,貨號:JYM0390Mo,JYM0345Mo);腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)和白細胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)酶聯免疫吸附試驗(Elisa)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,貨號:JYM0218Mo,JYM0012Mo);XOD測定試劑盒(abcam公司,貨號ab102522);XOD抗體(abcam公司,貨號:ab133268);β-肌動蛋白(β-actin)(santa公司,貨號:sc-1616r)。全自動生化分析儀(美國Beckman coulter公司,型號:AU5800);離心機(上海雙旭電子有限公司,型號:TG16W);Western blot轉膜儀(美國Bio-Rad公司,型號:1703930);電泳儀(北京六一儀器廠,型號:DYY-6C);一體式化學發光成像儀(上海勤翔科技有限公司,型號:ChemiScope 5300 Pro)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 動物隨機分為6組,正常對照組、模型組、別嘌呤醇組(5 mg/kg)、龍膽苦苷高、中、低劑量組(80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg),每組10只,正常對照組給予新鮮的飲用水,其余組給予10%果糖溶液(果糖溶于飲用水),每2天更換飲用水,持續8周誘發高尿酸血癥模型。

1.2.2 給藥方法 各給藥組動物每天上午9:00至11:00之間測量體質量,按體質量灌胃給藥,正常對照組和模型組灌服等體積生理鹽水,持續果糖喂養。喂養期間每天觀察小鼠的毛色,食量和死亡情況。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 標本采集及處理 給藥干預4周,小鼠禁食12 h,末次給藥1 h后麻醉小鼠,眼球取血,靜置,離心得血清待做生化分析,摘取新鮮肝、腎組織,凍存、固定、檢測相關指標。

1.2.3.2 血清生化指標測定 取血清,于全自動生化分析儀檢測血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平。

1.2.3.3 肝、腎組織病理學觀察 將肝、腎組織用4%的多聚甲醛固定24 h后,用石蠟包埋,切片(5 μm),置于干凈的載玻片上,以二甲苯脫蠟,梯度乙醇處理,蒸餾水洗,用蘇木精和伊紅染色后置顯微鏡下進行觀察。

1.2.3.4 腎臟氧化應激水平和炎癥介質檢測 準確稱取一定質量腎組織,制成腎臟勻漿,嚴格按照Elisa試劑盒說明測定腎組織中SOD,MDA,TNF-α和IL-6水平。

1.2.3.5 肝臟XOD活性檢測 取小鼠肝臟組織于玻璃勻漿器中,按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下,制備成10%的組織勻漿,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,取上清液,按照試劑盒說明書進行XOD活力測定。

1.2.3.6 XOD蛋白表達水平檢測 取小鼠腎臟組織,加入裂解液后進行勻漿,按BCA蛋白定量試劑盒說明書測定濃度,蛋白樣品經12%凝膠分離后,轉至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluorie,PVDF)膜上。PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉后,加入相應一抗,4 ℃孵育過夜,加入二抗孵育并顯影檢測。以β-Actin為內參,采用ImageJ圖像分析系統分析蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 龍膽苦苷對果糖誘導高尿酸血癥小鼠體質量和肝、腎功能的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠體質量,血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,給藥4周后,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中劑量組小鼠體質量顯著降低(P<0.05),別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組小鼠血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 龍膽苦苷對各組小鼠體質量,血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平的影響

2.2 龍膽苦苷對果糖誘導高尿酸血癥小鼠肝、腎組織病理形態的影響 正常對照組小鼠肝細胞大小均一,細胞核分布均勻,形態穩定。與正常對照組小鼠比較,模型組小鼠肝組織中發現較多肝細胞空泡,判斷為脂肪空泡,同時有細胞核萎縮發生。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組以上病理特征改變得到明顯緩解,肝細胞空泡樣變性和細胞核萎縮的程度明顯減輕,小鼠大部分肝細胞形態恢復正常。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化(HE,×200)

正常對照組小鼠腎小球大小、形態正常,邊界清晰。腎小管內部刷狀緣結構完整,無明顯異常。與正常組比較,模型組小鼠腎組織結構紊亂,腎小球萎縮,腎小管管腔擴張。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組上述病理學改變明顯減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠腎臟組織病理變化(HE,×200)

2.3 龍膽苦苷對果糖誘導高尿酸血癥小鼠腎臟SOD、MDA、TNF-α和IL-6水平的影響 與正常對照組比較,小鼠經12周果糖喂養,腎臟SOD水平顯著降低,MDA,TNF-α和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組SOD水平顯著升高(P<0.05或P<0.01),龍膽苦苷各劑量組MDA水平顯著降低(P<0.01),別嘌呤醇組和龍膽苦苷各劑量組TNF-α和IL-6水平均顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 龍膽苦苷對各組小鼠腎臟SOD,MDA,TNF-α和IL-6水平的影響

2.4 龍膽苦苷對肝臟XOD活性的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠肝臟XOD活性顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,給藥4周后,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組肝臟XOD活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖3 龍膽苦苷對各組小鼠肝臟XOD活性的影響

2.5 龍膽苦苷對肝臟XOD蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠肝臟XOD表達顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,別嘌呤醇組和龍膽苦苷高、中、低劑量組肝臟XOD的表達水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組小鼠肝臟XOD蛋白表達水平

3 討論

當今社會高尿酸血癥和痛風發病率逐年上升且呈現年輕化趨勢,其發病機制與不健康飲食密切相關[9-10]。含糖飲食,特別是高果糖玉米糖漿的生產及使用,使果糖攝入量大大增加,實驗和流行病學研究表明,長期高果糖飲食有引發高尿酸,導致腎小球硬化、腎臟功能障礙,以及肝臟脂肪堆積的風險[11-12]。果糖喂養動物已成為被廣泛應用的高尿酸血癥建模方法[13-14]。本實驗中,果糖連續喂養導致小鼠體質量顯著增加,UA水平顯著升高,血清肝功能損傷指標GPT和GOT及腎功能損傷指標Cr和BUN水平均顯著升高,小鼠肝細胞脂肪蓄積,腎小球萎縮、腎小管管腔擴張,說明本研究中的高尿酸小鼠造模成功。龍膽苦苷連續給藥4周后,血清中以上指標的水平均顯著下降,肝、腎組織病理學改變明顯減輕。結果表明,龍膽苦苷可以保護果糖導致的肝、腎受損。

眾所周知,肝臟是果糖代謝的主要器官。高濃度果糖被實驗動物吸收,到達動物肝臟后,代謝需要消耗大量的ATP,高果糖攝入可促進ATP向AMP的降解,因此也誘導嘌呤代謝相關酶的合成,包括XOD的大量合成,提升XOD活性,進而增強嘌呤降解和肌苷的產生,促使更多嘌呤代謝終產物尿酸的產生[15-16]。存在于肝臟的XOD是嘌呤代謝途徑的限速酶,催化黃嘌呤生成尿酸,是調控尿酸生成的最終環節,在高尿酸血癥的發病中占主導地位,抑制XOD的活性和表達可有效地減少尿酸的生成[17-18]。與已有的研究報道一致,小鼠經果糖喂養,肝臟XOD活性和表達水平明顯上升[16],本研究發現,龍膽苦苷可顯著抑制XOD的活性和表達,這些結果提示龍膽苦苷可通過抑制肝XOD的活性和表達減少尿酸的生成。

60%～75%的尿酸通過腎臟排泄,血尿酸升高,易使其停留于腎臟,誘導血管管壁發生氧化應激反應,SOD是機體對抗自由基的酶促體系,保護機體免受氧自由基的損傷,可直接反映機體抗氧化能力[19],而MDA是氧化應激的標志物,可以反映機體內脂質過氧化程度,MDA的增加會加劇機體的氧化損傷。另外尿酸的停留,還可刺激單核細胞生成IL-1β、IL-6以及TNF-α,誘導炎癥反應,進一步加重腎功能損傷,表現出血清Cr和BUN的升高[20-21]。本研究中龍膽苦苷可有效升高高尿酸小鼠腎臟SOD水平,抑制了尿酸引起的腎臟MDA、TNF-α及IL-6水平的增加,并使異常的Cr和BUN恢復正常水平,且其對Cr和BUN的降低作用優于陽性對照物別嘌呤醇。據此推測,龍膽苦苷可通過早期干預,降低血尿酸水平,并降低腎臟氧化應激和炎癥水平,保護腎功能。

綜上所述,本研究證實了龍膽苦苷可有效降低血清GPT、GOT、UA、Cr和BUN水平,對肝腎具有保護作用,可減輕腎臟氧化應激和炎癥反應,并表明其降尿酸作用與抑制肝臟XOD的活性和表達相關,作為潛在的天然降尿酸化合物應進一步研究。

利益沖突聲明:無。