高效液相色譜法測定阿維巴坦鈉起始物料(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的含量*

劉金林,陳 明

(1.安慶醫藥高等?？茖W校,安徽 安慶 246052;2.安徽中醫藥大學)

阿維巴坦(Avibactam)屬于二氮雜雙環辛酮化合物,其藥理機制為:β-內酰胺酶絲氨酸親核作用于阿維巴坦酰胺鍵,兩者形成共價結合物,即酶-抑制劑復合體,性質穩定難以水解,但可再經環合作用又形成阿維巴坦藥物原型。此過程,一是親核破壞阿維巴坦酰胺鍵的速率遠遠大于環合恢復的能力,可以長時間維持酶-抑制劑復合體;二是阿維巴坦自身結構可通過環合作用恢復,親核可與其重復發生開環反應形成復合體,最終使β-內酰胺酶處于長期抑制狀態,進而喪失水解β-內酰胺環的能力。阿維巴坦本身無明顯的抗菌活性,但與各類頭孢和碳青霉烯抗生素聯合使用時,能顯著抑制A型和C型的β-內酰胺酶,尤其是能明顯增強對含有超廣譜β-內酰胺酶以及AmpC酶的大腸桿菌和克雷伯肺炎桿菌的抗菌活性。目前,阿維巴坦被視為前景較好的非β-內酰胺類抑制劑[1]。

阿維巴坦臨床上用其鈉鹽,阿維巴坦鈉的合成[2-3]是以(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯為起始物料,經過3步化學反應加1步成鈉鹽制備目標化合物阿維巴坦鈉。見圖1。

圖1 阿維巴坦鈉合成工藝路線

起始物料是決定原料藥質量的重要組成部分,完善起始物料選擇準則和嚴格控制起始物料的選擇及質量要求,有助于規范原料藥的生產和提高原料藥的質量。本研究采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[4-5]進行測定,通過驗證確認了方法的可行性,為阿維巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的含量測定提供了依據,適用于阿維巴坦起始物料(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯含量測定。

1 材料和方法

1.1對照品及樣品 (2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯(上海必奕醫藥科技有限公司,批號:200813);(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對照品(QCC,批號:03-MAR-21-52);雜質1(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:20181103);雜質2(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:20181209);雜質3(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:C010-170502-004);雜質4(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:001A20200710);雜質5(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:00642-200811-01);雜質6(珠海優潤醫藥科技有限公司,批號:001B20031101)。

1.2試劑 水(純凈水,娃哈哈)、乙腈(色譜純,Honeywell)、氨水、磷酸二氫銨(分析純,general-reagent)。

1.3儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(真空脫氣裝置、二元泵、ALS、TCC、DAD和Chemstation工作站,Agilent公司)、色譜柱為Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、分析天平(FA305N,上海菁海儀器有限公司)、超聲儀(YM-080ST深圳市潔盟清洗設備有限公司)。

1.4色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)、流動相A為0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,用氨水調節pH至6.0,經0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得);流動相B為乙腈;流動相A到流動相B(50:50),運行時間11 min,流速為1.0 mL/min,波長為210 nm。柱溫為40 ℃,進樣量為10 μL。

1.5溶液的配制 (1)空白溶液(稀釋劑)的配制:量取水和乙腈各500 mL,混勻即得。(2)供試品溶液的配制:取本品約20 mg,精密稱定,置100 mL的量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻即得。(3)對照品溶液的配制:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對照品適量,精密稱定,用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL中約含0.2 mg的溶液,搖勻即得。(4)雜質對照品混合溶液:分別精密稱取雜質1對照品、雜質2對照品、雜質3對照品、雜質4對照品、雜質5對照品和雜質6對照品適量,加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL約含雜質1對照品、雜質2對照品、雜質3對照品、雜質4對照品、雜質5對照品和雜質6對照品各400 μg的混合溶液。(5)混合對照品溶液:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品約20 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷至室溫,加入雜質對照品混合溶液1 mL,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,作為混合溶液。(6)標準工作液:取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對照品50 mg,精密稱定,置25 mL的量瓶中,加稀釋劑適量,超聲使溶解,放冷至室溫,加稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,制成濃度約為2 mg/mL的(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯對照品貯備溶液。臨用前用稀釋劑稀釋成濃度約為0.10、0.16、0.20、0.24、0.30 mg/mL的標準工作液。

2 結果

2.1系統適用性試驗 精密量取對照品溶液10 μL,注入色譜儀,按本研究色譜條件進行測定,記錄色譜圖。在該色譜條件下,對照品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色譜峰的保留時間RSD為0.10%,峰面積RSD為0.18%,理論板數按(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯峰計算>5 000。本方法系統適用性較好,能滿足本品含量測定的系統適用性要求。

2.2專屬性試驗 精密量取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液和混合溶液各10 μL,注入色譜儀,按色譜條件進行測定,記錄色譜圖。相關圖譜見圖2。在該色譜條件下,供試品溶液中出現與對照品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯色譜峰保留時間一致的色譜峰,且該峰峰純度因子≥990,可認為是單一物質峰?？瞻?、(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯的各雜質、供試品均不干擾供試品溶液中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯測定,(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯與相鄰峰間分離良好。本方法專屬性較好,滿足本品的含量測定的專屬性要求。

圖2 空白溶液(A),對照品溶液(B),供試品溶液(C),混合溶液(D)

2.3線性關系考察 按本方法制備的系列濃度標準工作液,注入色譜儀,按本研究色譜條件進行測定,記錄色譜圖,以標準工作液濃度為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y),以最小二乘法作線性回歸,繪制標準曲線,曲線不得強制過原點?；貧w方程為y=12.324x-78.057,r=0.999 9。結果表明,在98.069 2～294.207 7 μg/mL(相當于供試品濃度的50%～150%)濃度范圍內,(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯具有良好線性。見圖3。

圖3 (2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯線性關系圖

2.4精密度試驗 取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品,按本研究方法平行配制6份,按照本研究色譜條件分別測定,記錄峰面積,計算含量,測得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.994 8 mg,RSD為0.04%;另一實驗人員在不同日期取(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯供試品,同樣按本方法平行配制6份,按照色譜條件分別測定,記錄峰面積,計算含量,測得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.995 5 mg,RSD為0.14%;2名實驗者12份供試品溶液,測得每1 mg供試品中(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯平均含量為0.995 2 mg,RSD為0.1%。表明本方法精密度良好。

2.5回收率試驗 取本品適量,精密稱定,加稀釋溶解并定量稀釋,制備成供試品溶液濃度的80%、100%、120%三個濃度水平的溶液,濃度分別為0.16、0.20、0.24 mg/mL,每個濃度平行配制3份。按照1.4項下色譜條件分別測定,記錄峰面積,按外標法以峰面積計算每個濃度水平溶液中的(2S,5R)-5-[(芐氧基)氨基]哌啶-2-羧酸乙酯回收率(回收率%=測得量/實際加入量×100)。低濃度0.16 mg/mL、中濃度0.20 mg/mL、高濃度0.24 mg/mL 3個濃度的平均回收率(n=3)分別為99.36%、100.99%、100.56%,RSD(n=3)分別為0.20%、0.20%、1.50%;總回收率(n=9)為100.34%,RSD(n=9)為1.00%。結果表明本研究方法準確度良好,見表1。

表1 回收率結果

2.6溶液穩定性試驗 按色譜條件,取同一份對照品溶液,按對照品溶液的配制,分別在0、1、5、9、11 h進樣各10 μL,取同一份供試品溶液,按供試品溶液的配制,分別在0、3、5、8、11 h進樣各10 μL,記錄峰面積。對照品溶液,與0 h相比,各時間點主峰峰面積回收率分別為100.8%、100.7%、102.0%、101.7%,均在98.0%～102.0%;供試品溶液,與0 h相比,各時間點含量變化百分比分別為0.9%、0.1%、1.1%、1.4%,均<2.0%。對照品和供試品溶液的穩定性時限滿足測定要求。

3 討論

3.1分析方法色譜參數的選擇 分析方法設置的色譜參數具有分析準確靈敏,所需時間較短,在濃度的范圍內線性良好。實驗結果表明,該分析方法的科學使用能夠高度符合預期性能要求,同時具備良好的測量再現性。

3.2流動相的選擇 本試驗同時采用0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH至4.0)與乙腈以初始比例80∶20等度洗脫方式作為流動相,但試驗結果顯示對照品主峰出現裂峰,峰形較差,且運行時間較長。對比采用0.01 mol/L磷酸二氫銨溶液(取磷酸二氫銨1.15 g,加水溶解并稀釋至1 000 mL,用氨水調節pH至6.0,經0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得)-乙腈(50∶50)等度洗脫方式作為流動相,結果表明樣品峰形最穩定,柱效最佳,保留時間適宜,且運行時間短。

3.3分析方法耐用性 在確定的色譜條件基礎上,對測定條件進行較小的變動,評估測定結果不受影響的承受程度,為所建立的方法用于常規檢驗提供依據。結果顯示。流動相pH在5.8～6.2、流速在0.9～1.1 mL/min、檢測波長208～212 nm、柱溫在38～42 ℃范圍變動,對測定結果沒有影響。

上述驗證結果表明,應用本方法測定阿維巴坦起始物料的含量,系統適用性、專屬性、線性和范圍、檢測限和定量限、精密度、準確度和耐用性等指標均符合含量測定方法驗證各項要求。因此,該方法靈敏、快速、準確、可靠,能夠滿足阿維巴坦起始物料含量測定的日常分析要求。