山羊口瘡病毒四川株007基因克隆及其編碼蛋白分析

張風雨，楊 璐，姜雯玉，黃 忍

（成都威斯津生物醫藥科技有限公司，四川 成都 610218）

羊口瘡病毒（ORFV）是痘病毒科、脊椎動物痘病毒亞科、副痘病毒屬的典型代表［1］。ORFV具有高度的嗜上皮性，主要通過破損的皮膚及黏膜感染，是一種引起綿羊、山羊及人發病的急性高度接觸性人獸共患?。?］。臨床上主要以感染動物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部位皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征［3］。已有研究表明，羊口瘡病毒為線性雙鏈DNA 病毒，基因組大小為134～139 kb，其中包含末端基因區（ORFs001-008和112-134）和中間核心區（ORFs009-111），編碼134個基因［4］。早有研究報道ORFV 編碼dUTPase［5］，dUTPase 由ORFV中483 bp的基因序列編碼產生，該蛋白常以融合形式表達［6］。dUTPase 是一種普遍存在的酶，它催化dUTP 水解生成脫氧尿苷單磷酸（dUMP）和焦磷酸（PPI），從而降低細胞中dUTP/dTTP 的比值，阻止尿嘧啶進入DNA，降低發生錯配的幾率［7］。dUMP經甲基化變為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸（dTTP），dTTP 是胸腺核苷酸生物合成的前體。研究表明，當胞內dUTPase 酶活性不足以支持病毒進行有效復制時，編碼dUTPase 基因的病毒則可以上調胞內dUTPase 酶活性，確保病毒正常復制［8］。本研究對山羊口瘡病毒四川分離株007基因（dUTPase）進行PCR擴增、克隆，并利用生物信息學軟件對該基因編碼的蛋白結構進行預測，為進一步研究ORFV dUTPase蛋白在ORFV致病中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1和pET-32a（＋）載體由西南民族大學動物醫學實驗室保存；DNA提取試劑盒、PCR試劑、膠回收試劑盒、Plasmid DH5α感受態細胞購至Takara 公司；限制性內切酶BamHI和XhoI購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 ORFV 007基因的擴增 根據GenBank 中ORF strain SJ1（KP010356.1）dUTPase 基因序列，用Primer 5.0 軟件設計一對帶有酶切位點的特異性引物。上游引物：5′-CGCGGATCCATGGAG TTCTGCTGCACG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAG TTAAAGAGCTACATTTTACAATTTTGAT-3′。預期目的基因片段大小為507 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據DNA 提取試劑盒說明提取山羊口瘡病毒四川分離株SCLZ1 的DNA。按以下體系進行基因擴增：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，PreMix 酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，反應體系總體積為25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min；16 ℃保存。

1.2.2 pET-32a（＋）-007重組質粒的構建 將所擴增的目的基因經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，采用膠回收試劑盒對目的條帶進行膠回收。分別用限制性內切酶BamHI 和XhoI 對膠回收產物和pET-32a（＋）進行雙酶切（雙酶切體系見表1）。在37 ℃水浴條件下酶切30 min，酶切產物采用純化試劑盒進行純化回收。將酶切純化產物與pET-32a（＋）在16 ℃金屬浴中連接過夜（連接體系見表2）。連接產物轉化入DH5α感受態細胞，再均勻涂布于含100 μg/mL AMP 的LB 平板上，再倒置于37 ℃恒溫培養箱中過夜。次日，挑取疑似陽性單菌落至含有100 μg/mL AMP的LB液體培養基內，37 ℃160 r/min 增菌培養過夜。采用Plasmid Miniprep Kit質粒提取試劑盒提取質粒，對質粒進行PCR 鑒定和雙酶切鑒定。將鑒定結果為陽性的質粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果為陽性的質粒命名為pET-32a（＋）-007。

表1 雙酶切體系

表2 連接體系

1.2.3 ORFV 007基因序列分析 將測序所得序列在NCBI上進行同源性比較，并利用Mega7.0構建系統進化樹。

1.2.4 dUTPase蛋白結構及功能預測 采用在線軟件ExPasy 服務器上ProtParam 工具對基因編碼的氨基酸序列進行理化性質分析；利用ExPasy服務器的ProtScale工具，計算基于K-D法的蛋白質疏水性；使用TMHMM Server v.2.0進行跨膜區分析；使用Signal P 3.0 server 進行信號肽預測；利用NPSA和CBS在線軟件對該蛋白進行二級結構預測；利用NCBI 在線軟件對蛋白保守域進行分析進而預測其功能；利用SWISS-MODEL 進行同源建模，預測其三級結構。

2 結果

2.1 ORFV 007 基因的擴增 以提取的山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1的DNA為PCR擴增模板，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果成功擴增出約500 bp條帶，與預期擴增條帶大小相符（圖1）。

圖1 ORFV 007 PCR擴增結果

2.2 重組質粒的雙酶切鑒定 由圖2可知，重組質粒雙酶切產物與預期結果相符。

圖2 pET-32a（＋）-007重組質粒的雙酶切鑒定

2.3 ORFV 007基因序列分析

2.3.1 ORFV 007 基因全序列 ORFV 007 基因全長為483 bp，測序結果顯示擴增基因無缺失。

2.3.2 ORFV 007基因的遺傳進化樹 將本研究擴增測序的ORFV 007 基因與NCBI 上收錄的所有ORFV 007 基因進行比對分析，并構建遺傳進化樹。結果該基因全序列與NCBI 收錄的編號為MF4890951 基因的同源性最高，達98.96%；構建的系統進化樹結果顯示本試驗分離毒株 與 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，說明親緣關系較近，但又單獨為一小支，存在一定的變異（圖3）。

圖3 ORFV 007基因序列系統進化樹

2.4 ORFV 007 編碼的dUTPase 蛋白結構預測利用ExPasy 服務器上的ProtParam 工具對該蛋白進行理化性質分析，結果顯示：ORFV 007 編碼161個氨基酸，相對分子量為16 945.11，理論PI值為5.27，消光系數為11 960，不穩定系數為21.53，脂肪系數為82.19，總平均親水性為－0.016；該蛋白包含了除Pyl 和Sec 兩個氨基酸之外的其余18種常見氨基酸，其中Gly 含量最高，為13.1%，Met和Trp 含量最低，均為0.6%，其他氨基酸含量在1.9%～9.4%；帶正電荷氨基酸殘基總數為14 個，帶負電荷氨基酸殘基總數為18 個。利用ExPasy的ProtScale 程序計算基于K-D 法的蛋白質疏水性，結果未發現典型疏水區域。使用TMHMM Server v.2.0進行跨膜區分析，結果未發現典型跨膜區域。使用Signal P 3.0 server 進行信號肽預測，結果顯示此蛋白不存在信號肽，不是分泌蛋白。二級結構預測顯示ORFV 007編碼蛋白主要由無規卷曲和延伸鏈構成，其中無規卷曲含量最多，為60.62%，位于1-7、14-33、35-46、57-61、67-71、80-82、86-90、99-103、107-110、120-124、130-154、160 區域；延伸鏈結構占蛋白質的33.12%，位于8-13、34、47-56、62-66、72-79、83-85、91-98、104-106、125-128、155-159區域；除上述結構外，還有少部分α螺旋結構，占蛋白質的5.62%，位于111-119 區域。CBS 在線預測顯示，此段蛋白質存在12 個磷酸化位點（絲氨酸9 個、蘇氨酸2個、酪氨酸1個）；在第17位氨基酸位置，含有一個潛在的N-連接糖基化位點；NCBI 在線預測顯示，此蛋白質保守域活性位點的保守特征由9個氨基酸殘基組成，這9個殘基分別位于65-75、80-95區域；此段蛋白三聚體界面的保守特征由29 個氨基酸殘基構成，分別位于25-50 和80-115 區域；dUTPase 蛋白氨基酸序列中包含五個保守結構域，分別是PHA02703、dut、dUTPase、Dut、trimeric_dUTPase。用SWISS-MODEL 預 測該蛋白三級結構（圖4），QMQE為0.77，QMEAN為0.31，與模板3ehw.1.A 氨基酸序列的相似性為70.21%，屬于dUTP焦磷酸酶。

圖4 dUTPase蛋白三維結構預測圖

3 討論與結論

3.1 討論 dUTPase 廣泛存在于各類哺乳動物、昆蟲、植物、細菌以及病毒內，對生物體生命發展有重要意義。ORFV dUTPase 是dUTPase 超家族中的常見成員，與參與催化dUTP轉化為dUMP過程中的其他超家族成員相比，dUTPase 與它們具有相同的四級結構，但在合成dTTP 過程中，僅有dUTPase 可以通過轉儲制作將dUTP 轉化為dUMP［9］，并且還能消除過量dUTP，從而降低dUTP與dTTP比例，進一步降低尿嘧啶的DNA合成過程，減少在合成過程中出現錯配［7］。除上述已經確定的功能外，已有研究暗示dUTPase 可調節病毒毒力和基因組完整性［10］；亦有研究表明病毒dUTPase 在調節宿主免疫中起著重要作用，可促進Ι型干擾素（IFN）的生成［11］。

3.2 結論 本試驗以山羊口瘡病毒四川分離株SC-LZ1 的DNA 為模板，采用自行設計的ORFV dUTPase 特異性引物，經PCR 成功擴增獲得dUTPase 完整基因，通過構建pET-32a（＋）-007重組表達質粒并測序分析，發現該基因全序列與NCBI 收錄的編號為MF4890951 的基因同源性最高，為98.96%；構建的系統進化樹顯示該分離毒株 與 MF489089.1、MF489095.1、MF489093.1、MF489088.1、MF489090.1 及MF489094.1 在同一分支，說明親緣關系較近，但其又單獨為一小支，存在一定的變異。利用各類生物軟件對該蛋白結構進行分析，結果編碼蛋白中Gly含量最高，且二級結構中無規卷曲所占比例最大；在蛋白質二級結構中，就結構穩定性而言，α螺旋＞β折疊＞無規卷曲，但就功能而言，無規卷曲往往充當蛋白質和酶的活性中心，綜合對蛋白活性位點的預測分析，推測其酶活性中心位于氨基酸序列65-75及80-95；疏水性區域預測結果顯示此段氨基酸無疏水性區域，氨基酸疏水性預測值越大則此段氨基酸含有跨膜區域的可能性越大，跨膜區預測結果也顯示此段氨基酸無跨膜區域，所以跨膜區分析結果與疏水性區域分析結果一致，進一步證明該蛋白不是細胞信號傳導有關的膜受體蛋白。