甘草酸對高糖誘導的腎小球系膜細胞炎性因子及纖維化因子的影響

李媛，王珍，曹雪，侯紹章*

1寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏銀川 750004；2寧夏醫科大學護理學院，寧夏銀川，750004

近年來，由于飲食方式的改變和人口老齡化趨勢的加劇，糖尿病及糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1-2]。據文獻報道，DN 患者約占糖尿病患者的40%[3-4]，全世界30%～50%的終末期腎病(ESRD)是由DN 引起的[5-6]，到2030 年，DN 患者將超過6.43 億[7]。DN 進展的關鍵因素包括系膜細胞數量的異常及細胞因子表達水平的異常[8]。DN有多種病理特征，較為關鍵的是系膜區細胞外基質(ECM)積聚及腎小球硬化[9-10]。此外，系膜細胞還分泌多種炎性因子參與腎小球纖維化過程[11]，炎癥在DN 的發展過程中起重要作用[12-13]，DN 患者血清中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的過度表達[14]也支持這個理論。因此，有效抑制腎小球系膜細胞炎癥和纖維化是DN的重要治療手段[13]。課題組前期研究結果表明，甘草酸具有抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞活性的功效[15]，也能夠在一定程度上減輕糖尿病小鼠腎組織氧化應激損傷[16]。然而，甘草酸對高糖條件下腎小球系膜細胞炎性因子的影響尚不明確。因此本實驗探討甘草酸對高糖條件下腎小球系膜細胞炎性因子的影響，旨在為DN的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 小鼠腎小球系膜細胞(SV40 MES13)購自武漢普諾賽公司；BCA 蛋白測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；6 cm 培養皿購自無錫耐思生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司；青霉素-鏈霉素混合液、甘草酸(GA)購自北京索萊寶公司；IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)購自美國Proteintech公司；BSA 購自中山金橋公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-共軛二級抗體購自亞科因(武漢)生物技術有限公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液、DMEM 高糖培養基(PM150210)、DMEM 低糖培養基(PM150220)、胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone 實驗室；D-葡萄糖粉末購自美國Sigma 公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF)購買自美國Millipore公司。

1.2 細胞培養及實驗分組 將小鼠腎小球系膜細胞分為對照(NG)組(5.6 mmol/L 葡萄糖)、高糖(HG)組(30 mmol/L 葡萄糖)及HG+GA 組(30 mmol/L 葡萄糖+200 μmol/L GA)，分別干預培養48 h。小鼠腎小球系膜細胞分別于細胞培養基(DMEM 低糖及DMEM高糖培養基)中培養，并補充10%的胎牛血清及1%的抗生素(100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素)，將細胞置于37 ℃，5%CO2培養箱中生長培養。

1.3 Western blotting 檢測炎性因子及纖維化因子的表達水平 將貼壁的小鼠腎小球系膜細胞干預48 h后，棄去培養基，PBS洗3次，加入適量胰酶消化系膜細胞，室溫消化2～5 min 后加入培養基終止消化，并于室溫下1500 r/min的低速離心機中離心5～10 min。BCA 法測定蛋白濃度。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參蛋白，配制SDS-PAGE凝膠，12%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣10 μl蛋白液，80 V條件下行凝膠電泳實驗，恒流200 mA濕轉1 h，10%脫脂牛奶封閉2 h，采用兔抗IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及α-SMA 多克隆抗體于4 ℃冰箱孵育過夜，第2 天37 ℃孵育30 min，1×TBST溶液漂洗10 min×3次，采用山羊抗兔HRP 抗體室溫搖床孵育2 h，1×TBST 溶液漂洗10 min×3 次。最后于黑暗的環境下滴加ECL化學發光HRP底物反應液進行化學發光。

1.4 細胞免疫熒光檢測各組細胞炎性因子的表達變化 在24 孔板內進行細胞爬片，干預48 h 之后，用4%的多聚甲醛溶液固定，PBS 清洗3 次，將細胞爬片取出，置于載玻片上，滴加山羊血清于37 ℃溫箱封閉2 h，然后采用兔抗IL-1β、TNF-α 及α-SMA 多克隆抗體孵育，于4 ℃冰箱過夜，第2天在室溫下與異硫氰酸熒光素(FITC)-共軛二級抗體常溫避光孵育1 h，DAPI 封片，隨后在熒光顯微鏡下觀察熒光圖像。

1.5 ELISA 檢測細胞培養上清液中炎性因子的表達變化 在顯微鏡下觀察培養皿中的細胞生長密度至80%時，用胰酶消化細胞，再分別加入NG 組、HG組、HG+GA組干預的培養基終止消化。以1500 r/min離心10 min，在6 cm 培養皿中接種1×105個細胞，待細胞貼壁，干預48 h 后，提取各組細胞培養上清，根據ELISA試劑盒說明書，通過酶標儀測定的吸光度(OD)值來測定細胞培養上清中相關因子表達量的變化。

1.6 統計學處理 采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析。各實驗獨立重復3 次，所有數據均以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 甘草酸對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞炎性因子表達水平的影響 Western blotting 檢測結果顯示，與NG 組 比 較，HG 組 的IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA和TNF-α蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)，而HG+GA 組則無明顯變化(P＞0.05)；與HG 組比較，HG+GA 組IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA 和TNF-α 蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)(圖1)。

2.2 免疫熒光檢測各組腎小球系膜細胞IL-1β、TNF-α、α-SMA 的表達水平 免疫熒光檢測結果顯示，與NG 組比較，HG 組細胞IL-1β、TNF-α 及α-SMA 熒光強度明顯增強(P＜0.05)；而與HG 組比較，HG+GA 組的IL-1β、TNF-α 及α-SMA 的熒光強度明顯減弱(P＜0.05)(圖2)。

2.3 甘草酸對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞炎性因子分泌的影響 ELISA檢測結果顯示，與NG組比較，HG組IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-6分泌水平明顯升高(P＜0.01 或P＜0.05)，而HG+GA 組無明顯變化(P＞0.05)；與HG 組比較，HG+GA 組IL-8、IL-1β、TNF-α及IL-6分泌水平降低(P＜0.05)(表1)。

表1 甘草酸對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞炎性因子分泌水平的影響（n=3, ±s）Tab.1 Effects of glycyrrhizic acid on high glucose-induced secretion of inflammatory cytokins in mouse glomerular mesangial cells （n=3,±s）

表1 甘草酸對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞炎性因子分泌水平的影響（n=3, ±s）Tab.1 Effects of glycyrrhizic acid on high glucose-induced secretion of inflammatory cytokins in mouse glomerular mesangial cells （n=3,±s）

IL-1β.白細胞介素-1β；IL-6.白細胞介素-6；IL-8.白細胞介素-8；TNF-α.腫瘤壞死因子-α；NG.對照；HG.高糖；HG+GA.高糖加甘草酸處理；與NG組相比，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01；與HG組相比，(3)P＜0.05

TNF-α(ng/L)607.44±48.01 891.57±32.09(2)737.50±70.5(3)組別NG組HG組HG+GA組IL-1β(ng/L)39.58±4.53 99.62±4.06(2)62.86±3.21(1)IL-6(pg/ml)25.70±1.75 44.20±7.45(1)27.62±6.82(3)IL-8(pg/ml)32.32±3.86 76.41±6.04(2)46.64±3.54(3)

3 討 論

DN的發病機制復雜，進展過程中的促炎癥和促纖維化過程往往源于代謝改變、超濾過、反應性氧化應激(ROS)、免疫和炎癥激活及隨后的纖維化[17-23]。DN絕大多數集中在以糖尿病為主的患者和腎臟功能發生減退的患者中，這類患者的腎臟因糖尿病的影響而發生形態學或病理結構的變化[24]，最終導致腎臟出現一系列的臨床癥狀[25]。發揮主要過濾功能的腎小球基膜主要由腎小球系膜細胞及系膜基質共同構成，在病理條件下，系膜細胞被激活，導致其過度增殖及分泌細胞外基質和多種炎性因子，所有這些都參與了腎小球纖維化的過程[11]。許多證據表明，炎癥作為DN 的重要致病機制[26]，在高糖的刺激下，小鼠SV40 MES13細胞在形態學及相關蛋白因子的表達發生了一系列變化[27]，IL-1β、IL-6、TNF-α 炎性因子的蛋白表達水平明顯升高[28]，且在臨床DN 患者血清中也發現IL-1β、IL-6 和TNF-α 存在過度表達情況[14,29]。此外，本研究也發現，腎小球系膜細胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8 及TNF-α 在高糖條件下表達增高；甘草酸干預誘導后，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 表達降低。以上研究均提示促炎細胞因子分泌過多很可能與腎損傷加劇有關[30]。

甘草酸是從豆科植物甘草的根、莖中濃縮提煉所得，甘草的根、莖中含有甘草酸，即三萜皂甙，為甘草中最主要的活性成分[31]。本課題組前期研究發現，甘草酸在一定程度上可減輕DN 的進展[15-16,32-33]，但有關GA 保護DN 的具體機制尚未闡明。有研究發現，Smad3 的高表達可促進糖尿病小鼠腎纖維化的發展，這一過程可通過敲除Smad3 被抑制[34]；本課題組前期研究發現，TGF-β1和P-Smad2、3在高糖處理的腎小球系膜細胞中高表達，甘草酸干預組可以減少高糖誘導的腎小球系膜細胞TGF-β1和P-Smad2、3的表達，提示甘草酸抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞細胞外基質的產生[15]可能與TGF-β1-Smads 信號通路有關[15]。本課題組前期構建了糖尿病小鼠動物模型，發現甘草酸可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路從而預防DN 的進展，且甘草酸可抑制α-SMA 的表達從而發揮減緩腎纖維化的作用[16]。本研究也驗證了在高糖條件下腎小球系膜細胞纖維化因子α-SMA 的表達升高，甘草酸干預誘導后α-SMA 的表達降低。目前，有多種傳統的中草藥用于DN的研究。胡蘆巴堿(TRL)是胡蘆巴種子提取物中的一種活性成分，可通過調節Wnt 信號通路逆轉高糖誘導的系膜細胞增殖和纖維化[35]。祛風通絡方可通過抑制p38 MAPK信號通路降低高糖誘導的人腎小球系膜細胞炎性因子的表達，從而減輕炎癥反應[28]。這些藥物對DN 炎癥的抑制作用提示長期的炎癥會促進腎纖維化過程，可導致發生終末期腎病[36]，而服用適當的藥物可減緩這一病變的進展，也為研究甘草酸對于DN 的預防作用提供了理論思路。

綜上所述，甘草酸作為有效的中草藥，可通過逆轉高糖誘導的腎小球系膜細胞炎性因子的表達，從而逆轉細胞纖維化因子的表達，最終起到保護腎小球系膜細胞的功效，為甘草酸作為DN 的治療藥物提供了理論支撐，可作為進一步探究DN 發生機制的關鍵環節。但是，本研究尚存在不足之處，僅在細胞層面進行研究，未在DN 的動物模型中進行實驗，因此，后續將進一步在DN 動物模型中驗證甘草酸對腎炎癥及纖維化的影響，以為甘草酸防治DN的臨床應用提供參考。