IDH1 基因在肝內膽管癌細胞HuCCT1 增殖與遷移中的作用及其初步機制

林美佳，雷宇清，葉洲杰，朱麗萍，王心睿，黃雄飛

1福建醫科大學基礎醫學院病理學系，福建福州 350004；2國家衛健委非人靈長類生育調節技術評價重點實驗室/福建省婦幼保健院，福建福州 350000；3福建醫科大學婦兒臨床醫學院，福建福州 350004；4福建省兒童醫院心臟外科，福建福州 350011；5福建省婦幼保健院，福建福州 350001；6福建省兒童醫院，福建福州 350011；7福建醫科大學附屬醫院福建省婦幼保健院醫學研究中心，福建福州 350001；8福建醫科大學消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福建福州 350108

肝 內 膽 管 癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA)是指位于肝內二級膽管至最小膽管分支的被覆上皮及管周腺體發生的具有高度侵襲性的惡性腫瘤，占原發性肝癌的10%～20%[1]。近30 多年來，全球iCCA發病率和病死率皆呈上升趨勢，目前其治愈的首選是根治性手術，但因早期發現困難，僅約35%的患者具有手術治療的機會，5 年生存率＜20%[2-3]。近年來，iCCA的治療已逐漸從單純手術過渡到以手術為基石的多學科綜合治療模式；由于iCCA發病機制尚不明確，晚期患者從綜合治療中的獲益仍存在較多爭議[4]。

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環的關鍵酶，包含IDH1、IDH2 和IDH3三個同工酶。其中IDH1位于細胞質和過氧化物酶體中，IDH2和IDH3位于線粒體中[5-6]。iCCA具有較高頻率的IDH1和IDH2基因突變[7-9]，其中IDH1基因突變更常見，發生率為4.5%～55.6%[8,10-14]。針對IDH1基因突變的靶向藥物治療iCCA的相關臨床試驗正在進行[15]。晚期iCCA患者的藥物治療尚未出現突破性進展，藥物的具體作用機制也不明確。有研究報道，IDH1可能通過誘導乙醛脫氫酶1的表達來促進iCCA細胞增殖、遷移和侵襲[16]。對IDH1基因參與調控的重要基因和信號通路的深入研究，將有助于開發更有效的iCCA靶向藥物。本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術和生物信息學方法探討iCCA 細胞HuCCT1中IDH1基因的生物學功能及可能的分子機制，旨在為揭示IDH1 基因在iCCA 發病中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人iCCA 細胞系HuCCT1 購自河南商城北納創聯生物科技有限公司。CRISPR基因敲除質粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)保存于本實驗 室；RPMI 1640 培 養 基(8121083)、胎 牛 血 清(2138109RP)、 0.25% 胰 蛋 白 酶(2192619)、 Opti-MEM? (2120763) T4DNA Ligase(00276732)購自美國賽默飛世爾科技公司；Trizol(338110)購自美國賽默飛Ambion 公司；反轉錄試劑盒(R323-01)、熒光定量PCR 試 劑 盒(Q511-02/03)、2xPhanta? Max Master Mix(P515-01/02/03)、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit(L/N 7E480H0)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；StbI3 感受態細胞(WD0443143)購自上海唯地生物技術有限公司；細胞周期檢測試劑盒(FKRP9JT6 QT)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Puromycin(QLL-38-03A)購自法國InvivoGen 公司；Matrigengel 基底膜基質(082704)購自上海諾娃醫藥科技有限公司；細胞基因組DNA提取試劑盒(DP304)、DNA 純化回收試劑盒(DP214)、無內毒素質粒小提中量試劑盒(DP118)購自天根生化科技(北京)有限公司；IDH1 抗體(A13245)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；Wnt3a(AF8352)、β-連環蛋白(β-catenin)(AF0066)抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；GAPDH、β-actin、E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HuCCT1 細胞使用含10% FBS 的RPMI 1640進行培養，培養條件為：37 ℃、5% CO2，并保持一定的濕度。

1.2.2 向導RNA(guide RNA，gRNA)的合成與設計

利用CRISPR 設計網站(http://crispr.mit.edu/)針對IDH1 的基因序列(NM_001282386.1)第4 外顯子設計gRNA，在gRNA的上下游5'端分別加上Bbs Ⅰ酶切位點的黏性末端(CACC/AAAC)，由福州尚亞生物技術有限公司合成引物。引物序列為：上游5'-CAC CCATGACGACCTATGATGAT-3'；下游5'-AAACAT CATCATAGGTCGTCATGC-3'。

1.2.3 重組載體PX459-gRNA 的構建 稀釋gRNA 上下游序列濃度至10 μmol/L，反應體系為：gRNA-F 9 μl，gRNA-R 9 μl，10×PCR Buffer 2 μl。退火形成雙鏈，退 火 程 序 為：95 ℃ 10 min，85 ℃ 1 s，25 ℃1 min；降溫至4 ℃。用T4連接酶將退火產物與經Bbs Ⅰ酶切并純化的PX458質粒于22 ℃連接，將連接產物轉化入大腸桿菌StbI3感受態細胞中，均勻涂布于含有氨芐青霉素的TB 固體平板上，37 ℃過夜培養。挑取單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素的TB液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養，將菌液送至福州博尚生物技術有限公司測序。

1.2.4 IDH1敲除細胞株的構建 將HuCCT1細胞鋪入6孔板中，待細胞生長至80%融合時，PEI轉染法將重組載體轉染到細胞中，pLEGFP-N1 質粒作為陽性對照，轉染8 h 后更換新鮮培養基。PX459攜帶嘌呤霉素抗性，轉染48 h 后，使用嘌呤霉素篩選轉染成功的細胞，以未轉染質粒的細胞作為陰性對照。抽提敲除細胞基因組，目的片段PCR 擴增測序鑒定基因敲除情況。根據人IDH1 基因的序列(NM_001282386.1)設計驗證引物，引物序列為：上游5'-ACGACCAAGTCACCAAGGA-3'；下游5'-CCTATT GTGCAGCCAGTGTT-3'。送至福州博尚生物技術有限公司進行一代測序。有限稀釋法獲得單克隆細胞，挑取單克隆細胞進行PCR 擴增測序再次驗證，5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit TA 克隆鑒定敲除株基因型，最后在mRNA和氨基酸水平驗證IDH1的表達情況。

1.2.5 qRT-PCR檢測 Trizol法提取對數生長期的細胞總RNA進行RNA反轉錄。實時熒光定量PCR檢測基因相對表達量，2-ΔΔCt法對 mRNA 的定量結果進行歸一化處理。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blotting 檢測細胞IDH1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9、Wnt3a和β-catenin 蛋白表達水平 收集處于對數生長期的細胞，蛋白裂解液促使細胞沉淀中的蛋白質游離至上清中，吸取上清，蛋白上清與5×上樣緩沖液按照4∶1體積混合，96 ℃變性10 min，得到變性后的蛋白樣品。隨后上樣電泳、轉膜，轉膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜10 min×3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜10 min×3 次，采用ECL 化學發光法顯影。

1.2.7 CCK-8 細胞增殖實驗 收集處于對數生長期的細胞，按2000 個細胞/孔接種于96 孔板，每組重復3 次。細胞培養一定時間后加入含10% CCK-8 試劑的RPMI1640培養基，采用酶標儀在450 nm處檢測吸光度(OD)值，收集數據，根據記錄的數據進行統計分析并繪制細胞生長曲線。

1.2.8 克隆形成實驗 取對數生長期的細胞消化重懸，以1000個細胞/孔均勻鋪于6孔培養板，正常培養9～10 d，待細胞形成肉眼可見的細胞集落后，PBS清洗，甲醇固定30 min，0.4%結晶紫溶液染色后拍照并計算克隆形成數。

1.2.9 細胞劃痕實驗 收集處于對數生長期的細胞，胰酶消化后吹打至單細胞懸液，調整細胞密度為5×105/L，接種于12 孔板上，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養24 h 至細胞基本融合。棄去培養基，用10 μl無菌槍頭在孔板底部中央垂直劃線，PBS沖洗脫落細胞，分別于0、8 h進行拍照，觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕距離-8 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.2.10 Transwell 遷移、侵襲實驗 (1)細胞遷移實驗：收集處于對數生長期的細胞，Transwell 小室中各加入5×104個/孔的細胞及200 μl 1%FBS 培養基，小室外加入500 μl正常培養基。16 h后取出小室，甲醇固定30 min，0.4%結晶紫溶液染色，棉簽擦拭小室內未遷移的細胞，自然風干后拍照計數。(2)細胞侵襲實驗：使用加入Matrigengel 基底膜基質的Transwell 小室，培養時間為48 h，其余操作同遷移實驗。

1.2.11 細胞周期檢測 收集處于對數生長期的細胞各5×105個，在冰冷的PBS中洗滌一次，-20 °C、75%乙醇固定過夜。PBS 洗滌細胞后，加入核糖核酸酶(10 μg/ml)，室溫下用5 μg/ml 碘化丙啶染色30 min。用美國BD 公司的流式細胞儀進行流式細胞術(FCM)，用Modfit 軟件計算細胞周期分布。實驗重復3次。

1.2.12 RNA 抽提與轉錄組測序 收集HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細胞，每個樣品1×106個細胞，PBS 磷酸鹽緩沖液清洗2 次，離心取細胞沉淀，加入1 ml Trizol重懸裂解細胞，將樣品送至上海歐易生物醫學科技有限公司進行RNA抽提、建庫測序。抽提完成的RNA 樣品使用NanoDrop 2000 測定核酸濃度，實驗組與對照組各重復3 次。Illumina 建庫試劑盒TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit 對質檢合格的RNA 樣品進行建庫，構建好的文庫用 Agilent 2100 Bioanalyzer 質檢合格后，使用Illumina HiSeq X Ten 測序儀進行測序，產生150 bp的雙端數據。

1.2.13 差 異 表 達 基 因(differentially expressed genes，DEGs)篩選 將得到的原始測序數據進行過濾篩選，得到高質量的測序數據(clean data)用于后續分析。使用軟件RSEM(http：//deweylab.github.io/RSEM/)分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，獲得基因讀數(read counts)后，進行樣本間基因的表達差異分析。使用edgeR 根據基因讀數進行差異表達水平計算，篩選條件為FDR≤0.01、差異倍數(fold-change，FC)log2|FC|＞2。篩選出DEGs。

1.2.14 DEGs 的GO 和KEGG 富集分析 得到DEG后，通過使用g：Profiler 和Goatools 的功能注釋工具對DEGs 進行GO 注釋，并采用KEGG 數據庫進行信號通路富集分析，Bonferroni 校正的P≤0.05，以判定差異基因主要影響的生物學功能或通路。對差異基因進行非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism9 進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用雙側t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IDH1基因敲除細胞株HuCCT1IDH1-/-的構建 將PX459-sgRNA 載體轉染至HuCCT1 細胞，為檢測細胞敲除效率，抽提嘌呤霉素篩選后的細胞基因組DNA，經PCR擴增后測序，在IDH1基因靶點序列出現套峰(圖1A)。無限稀釋法獲得單克隆細胞株，對單克隆細胞基因組DNA 再次驗證，結果顯示4 號單克隆在sgRNA 序列中插入1 個堿基導致細胞基因組移碼突變(圖1B)。qRT-PCR 檢測結果顯示，與HuCCT1 細胞比較，敲除細胞株IDH1 mRNA 表達水平明顯下降(P＜0.0001，圖1C)。Western blotting 結果顯示，HuCCT1IDH1-/-細胞IDH1 蛋白相對表達量明顯低于HuCCT1WT細胞(P＜0.0001，圖1D)。

2.2 IDH1基因敲除對HuCCT1細胞增殖的影響 與HuCCT1WT細胞比較，HuCCT1IDH1-/-細胞的增殖和克隆形成數明顯減少(P＜0.05，圖2A、B)，阻滯在G2/M期細胞的比例明顯增大(P＜0.01，圖3A-B)，且調控G2/M 周期增殖相關基因Cyclin A2、Cyclin B1 和CDK1的表達水平明顯降低(P＜0.05，圖3C)。

圖3 IDH1敲除對HuCCT1細胞周期的影響Fig.3 Effect of IDH1 knockout on cell cycle of HuCCT1 cells

2.3 IDH1基因敲除對HuCCT1遷移、侵襲能力及上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響 與HuCCT1WT細胞比較，HuCCT1IDH1-/-細胞的劃痕愈合率明顯降低(P＜0.01，圖4A)，遷移細胞數(P＜0.001)和侵襲細胞數(P＜0.05，圖4B)明顯減少；RT-qPCR 檢 測 結 果 顯 示，HuCCT1IDH1-/-細 胞EMT 相關基因Vimentin 和MMP-9 表達水平明顯降低(P＜0.05)，編碼E-Cadherin的CDH1基因表達水平明顯升高(P＜0.01，圖5A)；Western blotting 結 果 顯 示，HuCCT1IDH1-/-細胞中E-Cadherin 表達水平明顯升高(P＜0.05)，而N-Cadherin、Vimentin 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05，圖5B)。

圖4 IDH1敲除對HuCCT1細胞遷移、侵襲能力的影響Fig.4 Effect of IDH1 knockout on the migratory and invasive ability of HuCCT1 cells

圖5 IDH1敲除對HuCCT1細胞EMT的影響Fig.5 Effect of IDH1 knockout on the EMT ability of HuCCT1 cells

2.4 HuCCT1 細胞轉錄組測序的結果及生物信息學分析

2.4.1 DEGS分析 通過對HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細胞的轉錄組測序數據進行對比分析，構建DEGs的火山圖(圖6)。以差異倍數＞2 且P≤0.01 為篩選條件，共篩選DEGS1476個，包括上調基因563個，下調基因913個。對這兩組細胞之間的DEGs進行分層聚類熱圖分析，結果顯示這兩組細胞明顯區分開(圖7)。

圖6 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT 細胞的差異表達基因火山圖Fig.6 Volcanic map of differentially expressed genes betweenHuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.4.2 GO 富集分析 對HuCCT1WT、HuCCT1IDH1-/-細胞進行DEGs的GO功能分析，從基因生物學過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)3 個功能類單獨進行進一步的分類與富集分析。在BP的差異基因主要富集外部封裝結構組織、腎臟系統發育、牙齒發育與發育有關的功能；在CC的差異基因主要富集于含細胞外基質的膠原蛋白、肌膜、高爾基內腔、T-小管、細胞體膜等條目；在MF 的DEGs 則主要富集于信號受體激活劑活性、受體-配體活性、細胞因子活性、糖胺聚糖結合、生長因子受體結合等(圖8)。

圖8 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT細胞的差異表達基因GO功能分類Fig.8 GO functional classification of differentially expressed genes between HuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.4.3 KEGG 信號通路富集分析 對HuCCT1WT與HuCCT1IDH1-/-細胞DEGs 的KEGG 信號通路分類及富集分析結果顯示，顯著富集的信號通路有14 條(P≤0.05)，富集程度最高的前5個信號通路為有絲分裂 原-活 化 蛋 白 激 酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、Rap1 信號通路、Wnt 信號通路、Hippo信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路(圖9)。

圖9 HuCCT1IDH1-/-與HuCCT1WT 細胞的差異表達基因KEGG信號通路分類Fig.9 KEGG biological pathway classification of differentially expressed genes between HuCCT1IDH1-/- and HuCCT1WT cell

2.5 Wnt 信號通路中Wnt3a、β-catenin 蛋白表達情況 隨機選取KEGG 分析排名前3 位的與iCCA 密切相關的Wnt信號通路進行驗證。Western blotting 檢測結果顯示，與HuCCT1WT細胞比較，HuCCT1IDH1-/-細胞的Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05，圖10)。

圖10 HuCCT1WT與HuCCT1IDH1-/-細胞的Wnt信號通路Wnt3a和β-catenin蛋白表達水平比較(Western blotting)Fig.10 Comparison of the expression levels of Wnt3a, β-catenin in Wnt signaling pathway between HuCCT1WT and HuCCT1IDH1-/- cell(Western blotting)

3 討 論

IDH1 和IDH2 可催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸和NADPH，為細胞能量代謝和生物合成提供前體物質[6]；且在葡萄糖感知通路、谷氨酰胺代謝、脂肪生成和細胞氧化還原等細胞信號轉導過程中發揮重要作用[5]。當IDH1 和IDH2 基因發生突變時IDH 的酶活性也發生改變，導致細胞中腫瘤代謝物2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid，2-HG)大量蓄積[7,17-19]，可引起嚴重的表觀遺傳調控紊亂和基因表達失調[7,20]，從而促進腫瘤發生。IDH1 是調控細胞代謝、表觀遺傳調控、氧化還原狀態和DNA修復的關鍵酶[21]；IDH1基因突變常見于膠質瘤、iCCA、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)等腫瘤細 胞[18,22]。IDH1 R132C 是iCCA 中 常 見 的 突 變 位點[23]。有研究報道，突變型IDH1對于膠質瘤、AML的發生發展具有重要作用，IDH1 突變產物2-HG 可抑制氧戊二酸脫氫酶(oxoglutarate dehydrogenase，OGDH)活性，減少琥珀酰輔酶A(succinyl-coenzyme A，CoA)生成，從而損害血紅素的生物合成，阻礙血細胞分化成熟，促進髓系腫瘤發生[24]。Saha 等[9]報道，iCCA中突變的IDH1通過產生D-2羥基戊二酸(D-2-HG)及抑制肝細胞核因子4α(HNF-4α)活性，可阻斷肝臟前體細胞向肝細胞分化，促進細胞增殖。IDH1 R132S基因缺失可降低iCCA細胞人肝膽管癌細胞(RBE)的增殖、遷移、侵襲能力及EMT[20]。目前的研究關注IDH1 基因突變的致病機制較多，而IDH1基因缺失對iCCA生物學行為的影響報道較少。

本研究在iCCA 細胞HuCCT1 中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除IDH1基因。細胞功能試驗顯示，IDH1基因缺失可能通過影響細胞周期的調控和EMT 的過程，抑制HuCCT1 細胞的增殖和侵襲遷移。轉錄組學測序結果顯示，HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細胞之間DEGs有1476個，顯著富集在MAPK、Rap1、Wnt、Hippo、TNF 等與腫瘤細胞增殖與侵襲轉移密切相關的信號通路。隨機選取KEGG 分析排名前3 位、與iCCA 密切相關的Wnt 信號通路進行驗證，Western Blotting檢測結果顯示，與HuCCT1WT比較，HuCCT1IDH1-/-細胞Wnt 通路的Wnt3a和β-catenin蛋白相對表達量明顯降低。這一結果提示，IDH1基因可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與調控iCCA 細胞HuCCT1 的遷移、侵襲及EMT過程。

EMT是一個復雜、可塑、可逆的細胞過程，是指上皮細胞獲得間質細胞的特征，使細胞間的黏附性變弱，遷移能力增強[25]。研究顯示，EMT過程參與調控胚胎發育、組織修復腫瘤的侵襲與轉移、化療耐藥等惡性表型[26]。Wnt 信號通路包括Wnt/β-catenin，Wnt-PCP 和Wnt-Ca2+3 種信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路在調控細胞增殖、遷移侵襲、EMT 過程、細胞凋亡和自噬中發揮重要作用[27]；Wnt3a 為典型Wnt 配體，與腫瘤侵襲轉移密切相關[28]。Wei等[29]報道，真核翻譯起始因子3H(EIF3H)可通過Wnt/β-catenin 信號通路穩定CCND1 蛋白結構，促進iCCA細胞遷移，并抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，HuCCT1細胞中IDH1缺失后細胞的遷移和侵襲能力及EMT受到抑制；轉錄組測序結果顯示HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細胞的DEGs 在Wnt 通路上顯著富集；Western blotting 檢測結果顯示，與HuCCT1WT比 較，HuCCT1IDH1-/-細 胞Wnt 通 路 的Wnt3a和β-catenin蛋白相對表達量明顯降低，以上結果均提示IDH1基因可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與調控iCCA細胞HuCCT1的增殖、遷移、侵襲及EMT過程。

本研究結果顯示，HuCCT1細胞IDH1基因敲除后，細胞增殖受抑制，表現為阻滯于G2/M期。轉錄組測序結果顯示，HuCCT1WT和HuCCT1IDH1-/-細胞的DEGs 在MAPK 通路上顯著富集。MAPK 是一組進化高度保守的絲氨酸-蘇氨酸激酶，常見的MAPK包括細 胞 外 信 號 調 節 激 酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 激酶。MAPK 級聯反應參與多種細胞生物學過程，是調控細胞增殖、分化、凋亡及生理與病理性應激反應的關鍵信號通路[27-29]。已有研究報道，IDH1 基因缺失可通過活性氧激活MAPK包括ERK、JNK和p38信號通路，從而顯著抑制卵巢顆粒細胞的增殖、遷移，阻滯細胞于G2/M期，促進細胞衰老[30]。HuCCT1細胞中IDH1基因缺失后是否通過MAPK 通路影響細胞周期的調控而抑制細胞的增殖能力，仍有待進一步研究。

iCCA 起病隱匿、易轉移，缺乏特異性診斷指標，多數病例確診時已屬晚期，錯過手術時機，加之對常規放化療不敏感，因此該病缺乏有效的治療手段，預后差[30-32]。目前針對IDH1基因突變的靶向藥物已進入臨床Ⅲ期研究，但效果不盡人意，藥物的具體作用機制也不明確。本研究顯示，IDH1缺失可顯著抑制HuCCT1 細胞的遷移、侵襲能力和EMT過程，其機制可能與Wnt/β-catenin 信號通路有關。對IDH1基因功能的深入了解，將有助于開發新的靶向藥物，提高晚期iCCA患者的療效。