新抗原脈沖樹突狀細胞疫苗在腫瘤免疫治療中的作用

王彤昕，張凡，閆鑫，張雅婷，李玉民*

1甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，甘肅蘭州 730030；2蘭州大學第二醫院腫瘤外科，甘肅蘭州 730030

據國際癌癥研究機構統計顯示，2020 年全球新發癌癥約1930 萬例，癌癥死亡近1000 萬例[1]。我國預計2022 年新發癌癥482 萬例，癌癥死亡321 萬例[2]。近年我國癌癥的發病率總體呈上升趨勢，疾病負擔日益加重，嚴重威脅民眾健康。對于早期實體瘤患者，根治性腫瘤切除聯合全身治療是目前的標準治療方案；但多數惡性腫瘤患者確診時已進展至晚期，失去外科手術治療的最佳時機，預后較差[3]。因此，臨床上迫切需要新的腫瘤治療方法。腫瘤免疫治療主要包括基于抗體的治療、腫瘤疫苗、免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)治療及過繼細胞療法等[4]。近年來，基于新生抗原的個體化樹突狀細胞(dendritic cell，DC)疫苗成為腫瘤免疫治療的又一研究熱點[5-6]。新抗原脈沖樹突狀細胞疫苗(neoantigen pulsed dendritic cell vaccine，Neo-DCVac)是利用腫瘤表面因基因突變產生的具有較強免疫原性和腫瘤特異性的的新生抗原制作，可激活并增強機體的主動免疫反應，產生大量可識別新生抗原的淋巴細胞的新型腫瘤免疫治療手段[7-8]。Neo-DCVac 可在不損傷正常組織的同時殺傷表達此抗原的腫瘤細胞，靶向性更強[9]。Neo-DCVac回輸體內后可活化免疫細胞，激活免疫系統的抗腫瘤反應，還可產生特異性記憶免疫細胞，阻止腫瘤復發。研究顯示Neo-DCVac 是安全、可行的腫瘤免疫治療方法[9-10]，為腫瘤精準免疫治療提供了新途徑。本文綜述近年來Neo-DCVac 的相關研究及臨床應用進展，旨在為腫瘤免疫治療的相關研究提供理論參考。

1 Neo-DCVac概述

1.1 腫瘤新抗原及其篩選 新抗原是指腫瘤細胞中外顯子發生基因突變所表達產生的新的肽段[11-12]，其中基因突變包括非同義突變、基因融合、移碼突變、插入/缺失突變、單核苷酸變異及復雜的空間結構改變等[13]。新抗原屬于腫瘤抗原中的腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)，為腫瘤細胞所特有，不存在于正常組織中，具有較強的腫瘤特異性和免疫原性。因此，基于新抗原的DC 疫苗脫靶效應低[14]，且不受胸腺陰性選擇的限制，可避免中樞免疫耐受，用于治療時不易引起自身免疫性疾病[15]，因此新抗原可作為抗腫瘤靶點。突變基因經翻譯表達的氨基酸序列需加工成短肽片段，以肽-主要組織相 容 性 復 合 體(major histocompatibility complex，MHC)的形式在細胞表面表達，被免疫系統識別，激活機體特異性T 細胞的殺傷作用，從而引發抗腫瘤反應[16]。

突變的DNA序列可在蛋白質水平表達和加工成短肽片段，且短肽與MHC 分子的親和力、短肽-MHC 復 合 物 與T 細 胞 抗 原 受 體(T cell receptor，TCR)的親和力均較強，滿足以上條件的突變基因才可產生有效的個體化新抗原[17]?；蛲蛔兊念愋?、突變的表達程度、抗原提呈細胞的呈遞能力及腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)等因素可決定產生的新抗原能否誘導有效的抗腫瘤免疫反應。

產生新抗原的突變基因可分為“驅動基因”和“乘客基因”?！膀寗踊颉倍酁樵┗蚧蛞职┗虬l生突變，可影響細胞周期、細胞增殖和DNA損傷過程?！俺丝突颉睘殡S機突變產生，占新抗原突變基因的90%。因此，新抗原的產生具有隨機性，加之腫瘤的高度異質性，導致在腫瘤患者間僅有少量新抗原相同。因此，負載新抗原的疫苗需根據患者情況進行個體化定制[18-21]。鑒于實體瘤的異質性和多種抗原的存在，需要開發可靶向多種新抗原的疫苗，以提高抗腫瘤免疫應答的效能[22]。

不同類型腫瘤的基因突變率存在較大差異。突變頻率可用腫瘤突變負荷(tumor mutational burden，TMB)衡量，高TMB 提示腫瘤突變產生的候選新抗原數量多，制備出Neo-DCVac的概率大[14,23-24]。癌癥基因組圖譜( The Cancer Genome Atlas，TCGA)中來自18 種實體瘤的數千個樣本的RNA 測序數據顯示，TMB較高腫瘤的免疫原性也較高，更易被免疫系統識別，使體內T 細胞反應強度增加，免疫治療的效果更好，患者預后也更好[25]。在黑色素瘤、非小細胞肺癌、結直腸癌等多種實體瘤患者中，腫瘤TMB較高與患者生存率增高有關[26-29]；而較低的TMB 常會導致免疫逃逸[3]。

1.2 DC疫苗 1973年，Steinman等[30]首次報告DC。單核細胞-樹突狀細胞祖細胞(monocyte-dendritic cell progenitor，MDP)是普通樹突狀細胞祖細胞(common dendritic cell progenitor，CDP)和單核細胞(monocyte，MC)的直接前體，CDP 和MC 均可分化產生DC。CDP 可在骨髓中成為前體DC(pre-DC)，并分化為成熟和未成熟的漿細胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells，pDC)。pre-DC 離開骨髓通過血液進入次級淋巴器官和非造血組織后可分化為常規DC(CD10 3+cDC、 CD11b+cDC)。 MC 可 在 白 細 胞 介 素(interleukin，IL)-4、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF)、IL-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子(TNF)-α、地諾前列酮存在的情況下誘導分化為成熟的單核細胞來源的髓樣DC(myeloid dendritic cells，mDC)[31]。單核細胞來源的DC 可用于治療性疫苗接種[32]。DC 可有效攝取腫瘤抗原，處理加工后呈遞給CD4+和CD8+T細胞，使其活化[33]。此外，DC 還可產生IL-12 和干擾素(interferon，IFN)，增強共刺激作用，擴增活化的腫瘤特異性CD4+和CD8+T 細胞[34]。DC 還可與體內自然殺傷細胞、B細胞等其他免疫細胞相互作用，啟動腫瘤特異性免疫反應而識別和殺死腫瘤，在抗腫瘤免疫中發揮重要作用

近50年來，DC在T細胞介導的抗腫瘤免疫過程中的作用已得到深入研究[35]。惡性腫瘤常導致機體免疫功能下降，抗原呈遞細胞的功能受到抑制，不能有效激活T 細胞，難以啟動抗腫瘤免疫應答。而腫瘤患者由于免疫系統受到抑制導致自體DC 較少，為了取得良好的臨床療效，腫瘤免疫治療應確保體內的抗原呈遞細胞功能良好[36]。需在體外分離和擴增足夠數量的DC，完成疫苗制備，再回輸至患者體內[37]?；谀[瘤抗原脈沖的DC 制作的疫苗安全性較高[38]，可誘導有效的臨床、免疫反應[39]。

1.3 Neo-DCVac 的制備與給藥途徑 收集患者的腫瘤和正常組織樣本，對樣本中的DNA進行全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)篩選體細胞非同義突變，同時對腫瘤樣本進行RNA測序，確認突變基因的表達狀態；使用生物信息學技術和預測算法鑒定并合成新抗原肽[40]；通過白細胞分離術收集患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并在人GM-CSF 和IL-4 存在下培養誘導分化為成熟DC，負載腫瘤新抗原后回輸至患者體內[41]。相關流程見圖1。

圖1 新抗原脈沖樹突狀細胞疫苗的研發與應用流程Fig.1 Development and application process of the neoantigen pulsed dendritic cell vaccine

Neo-DCVac的治療效果與DC遷移到淋巴結的效率密切相關[35]。目前多數臨床試驗采用皮下注射接種 Neo-DCVac( 如 NCT04912765、 NCT03871205、NCT02956551、NCT04147078)。有研究指出，通過靜脈、皮下、皮內等途徑注射接種Neo-DCVac，僅有極少的DC 到達淋巴結[42-44]。而通過淋巴結內給藥，部分DC可被直接輸送到T細胞致敏部位，故推薦接種Neo-DCVac時采用成熟DC的結內給藥技術[45]。

2 Neo-DCVac動物實驗

2.1 Neo-DCVac 療效優于新抗原佐劑方法 Zhang等[37]研究顯示，Neo-DCVac 和新抗原佐劑疫苗均可誘導肺癌模型小鼠的脾產生強烈的T 細胞特異性反應，致免疫抑制調節性T細胞(regulatory cells，Tregs)顯著減少，所有新抗原表位均產生誘導反應并抑制腫瘤生長；但在激活免疫反應和抑制腫瘤生長方面，Neo-DCVac 優于新抗原佐劑疫苗。此外，Neo-DCVac 還可增加中樞記憶T 細胞和效應記憶T 細胞的數量，誘導效應CD8+T 細胞分泌IFN-γ，防止腫瘤復發。該研究為腫瘤個體化免疫治療中新抗原免疫方法的選擇提供了實驗依據。

2.2 Neo-DCVac可減少TME相關的免疫逃逸 TME與多種免疫逃逸機制相關，如高表達細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1-ligand 1，PD-L1)[46]、產生吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)[47]、募集Tregs[48-49]，從而降低腫瘤免疫治療的療效；而Neo-DCVac 可減少TME 相關的免疫逃逸 。Sun 等[50]使 用 抗CD38 抗 體、CpG 聯 合L82 Neo-DCVac治療LLC1肺癌細胞系模型小鼠[該小鼠對ICI治療——抗程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)、抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)的單克隆抗體均存在耐藥性，其原因可能是T 細胞浸潤缺失和免疫識別功能不足]，結果顯示該療法增加了CD8+和CD4+T細胞浸潤，減少了小鼠腫瘤中的Tregs數量，通過減弱TME中的抑制信號來增強T細胞反應，最終將免疫“冷”腫瘤轉化為“熱”腫瘤，抑制了腫瘤生長。Wang等[51]設計并制備了一種基于DC 的酸性/光敏新抗原納米疫苗治療H22 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)小鼠。HCC常處于免疫“冷”狀態，免疫原性較低，導致HCC 患者對ICI的總體緩解率較低[52]。結果顯示該疫苗通過增強特異性T 細胞免疫應答，重塑TME，有效地將腫瘤免疫“冷”狀態轉化為“熱”狀態，提高了肝癌免疫治療應答率和遠期療效。

上述動物實驗研究結果顯示Neo-DCVac 安全且有效，具有強免疫原性，不僅可誘導效應CD8+T細胞分泌IFN-γ，還增加了記憶T細胞的數量阻止腫瘤復發。Neo-DCVac 還可聯合其他治療手段來增加T細胞浸潤，中和免疫抑制信號，改善TME，從而減弱對免疫檢查點治療耐藥的現象。

3 Neo-DCVac臨床試驗

Neo-DCVac 已用于腫瘤免疫治療的多項臨床試驗。2015 年，Carreno 等[53]設計了個體化Neo-DCVac用于治療晚期黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗，其后基于DC的腫瘤疫苗用于腫瘤免疫治療的臨床研究進展迅速。根據ClinicalTrials.gov 網站的數據，全世界已完成或正在進行20 項已注冊的Neo-DCVac 臨床試驗，其中16 項處于臨床Ⅰ期，3 項為Ⅰ/Ⅱ期，2 項處于臨床Ⅱ期(表1)。已有3項臨床試驗完成并報告了研究結果。其中NCT03300843 研究顯示，患者對治療有部分臨床反應，但存在惡心、疲勞、注射部位反應、頭痛、皮膚硬結等不良事件。NCT04879888 研究顯示，給藥后患者T 細胞對多克隆刺激的反應性功能恢復，接種肽脈沖DC 疫苗后特異性CD8+T 細胞擴增。NCT00923910 研究顯示，給藥后3～12 周患者產生免疫反應，未發生急性移植物抗宿主病(graftversus-host disease，GVHD)，但存在血小板、白細胞、中性粒細胞數量降低和皮疹、皮膚瘙癢等不良事件。中國臨床試驗注冊中心網站數據顯示，目前有11項Neo-DCVac臨床試驗正在開展(表2)。

表1 新抗原脈沖DC疫苗的臨床試驗開展情況(ClinicalTrials.gov)Tab.1 Summary of clinical trials conducted for the new antigen pulse DC vaccine (ClinicalTrials.gov)

表2 新抗原脈沖DC疫苗的臨床試驗開展情況(中國臨床試驗注冊中心)Tab.2 Summary of clinical trials conducted for the new antigen pulse DC vaccine (Chinese Clinical Trial Registry)

(續 表)

3.1 Neo-DCVac 聯合治療 Ott 等[54]針對黑色素瘤患者制備了免疫原性個體化Neo-DCVac，6例患者接種疫苗25個月后，4例沒有腫瘤復發，2例腫瘤復發患者隨后接受了PD-1 抑制劑——派姆單抗聯合治療，結果顯示患者腫瘤完全消退，預后良好；治療過程中患者出現輕度流感樣癥狀、注射部位紅腫、皮疹等不良事件。該研究表明Neo-DCVac 安全、可行，可聯合派姆單抗誘導強烈的T 細胞免疫應答，且不良反應較小，不受先前治療的干擾[55]。

Ding 等[41]采用納武單抗聯合個體化Neo-DCVac的方法治療轉移性晚期肺癌(ChiCTR-ONC-16009100，NCT02956551)；將12 例患者的新鮮活檢組織進行WES、RNA 測序及生物信息學分析以篩選和合成免疫原性新抗原，每例患者選擇12～30 種基于肽的新抗原，給藥后客觀有效率為25%，疾病控制率(disease control rate，DCR)為75%，中位無進展生存期為5.5 個月，中位總生存期為7.9 個月，發生的不良事件程度均較輕且短暫。該研究在單獨使用Neo-DCVac 進行治療時，觀察到患者腫瘤增大；聯合納武單抗治療后，腫瘤發生空洞化，提示腫瘤復發后Neo-DCVac可重新誘導機體對ICI免疫療法產生客觀臨床反應，Neo-DCVac聯合ICI治療可增強T細胞的抗腫瘤能力，為新抗原疫苗治療提供了新證據。

Guo 等[55]使用個體化新抗原脈沖單核細胞來源的DC 疫苗聯合納武單抗治療晚期轉移性胃癌患者，聯合治療后腫瘤體積迅速縮??；結果表明該治療方案可誘導外周血中新抗原特異性的CD4+和CD8+T細胞發生活化，并顯著提高新抗原特異性T 細胞應答率。

Harari 等[56]使用個體化肽(personalized peptides，PEP)-DC疫苗聯合鉑類化療治療1例錯配修復基因完整(proficient DNA mismatch repair，pMMR)、p53 突變的漿液性子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)，成功誘導患者體內產生持久的T 細胞應答，且從患者PBMC 中分離的T 細胞可識別抗原肽，提示該疫苗具有較強的免疫原性。該研究表明Neo-DCVac 聯合化療可治療無法手術及轉移復發的腫瘤患者。

由于腫瘤免疫微環境的抑制作用，作為單一治療手段的新抗原疫苗難以完全清除腫瘤組織。研究顯示ICI 可在大多數TMB 高的患者中引起顯著臨床反應，但持續時間有限；且ICI治療期間發生的適應性耐藥與新抗原的基因突變有關。因此，可考慮將Neo-DCVac 與ICI 聯合應用，以取得更好的治療效果[57-58]。已有多項研究顯示采用ICI(納武單抗)聯合Neo-DCVac 治療腫瘤晚期轉移的患者可取得明顯臨床效果[41,55]。

上述研究提示，目前單獨使用Neo-DCVac 的臨床療效仍不理想，而聯合其他腫瘤療法可取得一定的臨床效果且安全可靠，不良反應可耐受。預計未來Neo-DCVac 的治療應用將趨于多元化，如通過尋找多個新抗原表位、與其他腫瘤療法聯合應用等，以增強治療效果。

3.2Neo-DCVac 適宜人群 上述Neo-DCVac 臨床研究提示，該類疫苗在多種實體瘤治療中安全、有效，可恢復由TME導致的免疫系統無反應性，重建細胞毒性T細胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)的抗腫瘤能力，增強機體自身免疫細胞的腫瘤殺傷效果，且不良反應較輕。腫瘤晚期或術后復發的患者接種Neo-DCVac 后也取得了明顯的治療效果，且不良反應可耐受。因此，目前接受常規治療、治療后無疾病進展、復發風險高或晚期腫瘤患者均可接受Neo-DCVac 治療，以取得更好的臨床效果；而對標準治療無反應或惡病質嚴重的患者則不建議接種Neo-DCVac。

4 總結與展望

目前Neo-DCVac 的應用面臨以下挑戰和阻礙：(1)DC分離技術不完善，制作流程繁瑣、耗時較長，工藝復雜，提取到的DC 細胞數較少；(2)新抗原高度個體化，難以實現批量生產[59]；(3)新抗原可經內吞途徑被大量降解，導致篩選合成的新抗原數量不足；(4)目前只可對部分腫瘤突變產生的新抗原進行測序，而通過基因融合、缺失、插入等產生的新抗原仍難以預測；(5)新抗原篩選技術在轉錄后修飾和蛋白質水平效果不佳，限制了新抗原篩選的范圍；(6)腫瘤免疫微環境中存在的免疫抑制影響疫苗治療效果[3]；(7)缺乏合適的疫苗接種后臨床療效評估指標。以上局限導致Neo-DCVac 的研發處于瓶頸期，發展較慢，限制了Neo-DCVac 的臨床應用。筆者認為，可通過提高新抗原的預測能力，開展聯合治療，使用臨床前模型評估疫苗配方、佐劑、劑量、用藥時間、給藥途徑等方法來進一步推進Neo-DCVac 的治療應用。

腫瘤免疫治療旨在控制疾病進展、改善患者預后、降低腫瘤復發和轉移率[60]。Neo-DCVac 作為腫瘤免疫治療方法之一，可誘導的免疫應答較強，高度靶向異質性腫瘤，減少免疫逃逸，有望解決傳統腫瘤疫苗免疫耐受、引發自身免疫性疾病的缺點。此外，Neo-DCVac 還可聯合其他腫瘤免疫療法發揮協同作用。隨著基因組學、分子生物學及高通量測序的發展與進步，Neo-DCVac 的相關研究也有望取得新的進展?？傊?，Neo-DCVac 為腫瘤免疫治療提供了安全、可行的新途徑，應用前景廣闊。