水仙環素的抗腫瘤活性及機制研究進展

楊 敏 ，林琪琪 ，劉丹丹 ，周宏宇

（1）昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500;2）昆明醫科大學現代生物醫藥產業學院，云南 昆明 650500）

據研究表明，在我國，每年有近300 萬人因惡性腫瘤而死亡，僅次于心腦血管疾病[1]。根據世界衛生組織的數據，每年死于癌癥的人數超過800 萬，約占全球死亡總數的13%。據估計，未來幾十年內，癌癥確診人數將持續上升[2]。但由于腫瘤細胞具有不同亞群，一些亞群憑借其異質性，可以逃避靶向藥物的殺傷[3]；當前的靶向藥物開發不夠；已開發的藥物選擇性差、副作用強，腫瘤的治療面臨多重困難。因此尋找更具選擇性的靶向腫瘤細胞的有效抗癌藥物極為重要。

水仙環素（narciclasine，NCS，圖1）[4]是一種天然植物生長抑制劑，存在于包括水仙在內的石蒜科開花植物中。NCS 于1967 年首次從幾種水仙屬的球莖中分離出來[5]，已被證明具有抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抑制血管生成[8]和抗病毒[9]的活性。美國國家癌癥研究所（national cancer institute，NCI）在 60 種特定人類腫瘤細胞系中進行篩選發現，NCS 對各種癌細胞系具有廣泛的細胞毒性[10]。另有研究顯示NCS 對腫瘤細胞顯示出較高的細胞毒性和選擇性。體內抗腫瘤研究也顯示，口服或注射NCS 均能顯著抑制腫瘤生長，并提高荷瘤小鼠存活率[11]。

圖1 水仙環素的化學結構[4]Fig.1 Chemical structure of NCS

綜上所述，NCS 具有較強的體內外抗腫瘤活性，且相比于其它細胞毒類化合物，具有選擇性好、安全性高的特點[12-13]。NCS 主要通過誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖來實現其抗腫瘤作用，目前這種選擇性的細胞毒作用在臨床腫瘤治療上是最為理想的[14]，因此，NCS 有望成為臨床上預防和治療癌癥的有效藥物。盡管NCS 的抗腫瘤作用顯著，但其潛在的抗腫瘤靶點和機制仍然知之甚少。因此有必要對NCS 抗腫瘤活性與機制進行深入研究，以發現其抗腫瘤靶點，這對NCS 類抗腫瘤新藥的研究具有重要的意義。本文就NCS 近年來的抗腫瘤活性與機制研究進展進行系統闡述。

1 NCS 抑制乳腺癌細胞的作用及其分子機制

1.1 NCS 通過抑制蛋白質合成抑制乳腺癌細胞生長

Ceriotti 等[5]的研究顯示，當以低劑量皮下給藥時，NCS 對S-180 小鼠腹水瘤細胞顯示出有效的抗有絲分裂活性。馬德里生物學研究所的研究人員發現，NCS 的抗腫瘤以及許多其它生物活性與NCS 對真核生物核糖體蛋白合成的有效抑制有關。另外，該研究人員進一步評估了NCS 對HeLa 細胞生長以及對細胞DNA、RNA 和蛋白質合成的影響，結果表明，NCS 對HeLa 細胞表現出強大的生長抑制活性，這是由于NCS 能抑制細胞蛋白質和DNA 合成，而RNA 合成不受影響，并且抑制蛋白質合成所需的濃度范圍與完全抑制HeLa 細胞生長所需的最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值較為一致[15]。

1.2 NCS 通過調節AMPK-ULK1 信號軸以誘導乳腺癌細胞自噬依賴性細胞凋亡

使用MTT 法測定NCS 對MCF-10A 乳腺細胞和一組乳腺癌細胞系（MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-483、BT-549 以及 HCC1937）的細胞毒性作用，結果顯示NCS 不影響MCF-10A 細胞的增殖，但可顯著抑制其它所有乳腺癌細胞的增殖，尤其是HCC-1937 和MDA-MB-231 細胞。這表明NCS 對乳腺癌細胞具有選擇性的細胞毒作用。另外，在HCC-1937 和MDA-MB-231 細胞中，NCS 能夠顯著誘導細胞自噬[16]。

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是預后最差的乳腺癌亞型之一，具有對化療反應差、侵襲性和轉移可能性高的特點。目前的研究發現，NCS 以劑量依賴性方式抑制TNBC細胞增殖并誘導細胞自噬和細胞凋亡。體內外研究結果表明，NCS 通過調節AMPK-ULK1 信號通路從而抑制TNBC 細胞增殖，并誘導自噬依賴性細胞凋亡[16]。

1.3 NCS 通過靶向STAT3 抑制乳腺癌細胞

信號轉導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）被認為是一個潛在的抗腫瘤藥物治療靶點。研究顯示，在廣泛的人類惡性腫瘤中，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、神經膠質瘤和胰腺癌等，STAT3 被持續或過度激活，并且與不良的臨床預后有關[17-18]。研究顯示，NCS 可以靶向MCF-7 細胞中STAT3 并抑制其磷酸化，而不影響STAT3 的總蛋白。然而，在他莫昔芬耐藥的MCF-7/TR 細胞中，NCS 不僅抑制STAT3 的磷酸化，而且還通過蛋白酶體途徑降解STAT3 總蛋白，顯示出更好的細胞毒性。此外，另有研究揭示NCS 靶向STAT3 并抑制其在MCF-7 細胞中的磷酸化和活化，并通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）依賴性蛋白酶體途徑促進STAT3 總蛋白降解[19]。

1.4 NCS 通過下調CDC2 表達抑制乳腺癌細胞

細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）是細胞分裂周期基因（cell division cycle gene 2，CDC2）的表達產物，通過與細胞周期蛋白Cyclin B 結合從而激活自身的激酶活性。在細胞周期進程中，CDK1 與周期蛋白Cyclin B 結合形成有絲分裂促進因子（mitosis-promoting factor，MPF）發揮蛋白激酶活性，促進細胞周期的G2-M 期的轉換。研究結果表明，NCS 對人乳腺癌MDA-MB-231 細胞產生抑制作用是通過抑制CDC2 的表達并阻滯細胞周期于G2/M 期實現的[20]。

1.5 NCS 通過抑制拓撲異構酶（topoisomerase，Topo）Ⅰ抑制乳腺癌細胞

DNA 復制過程中雙鏈被分離，這種分離導致在復制叉之前形成DNA 正超螺旋，并在其后面形成子鏈DNA 相互纏繞[21-22]。如果形成的正超螺旋得不到松弛，復制叉的進展將受到阻礙，而未能重新連接的子鏈則會阻止細胞分裂的必要條件-基因組分離[23]。Topo 是負責控制DNA 拓撲結構的重要蛋白質，它不僅能有效地解決DNA 的拓撲問題，釋放DNA 正負超螺旋的堿基張力，還能讓DNA 復制、轉錄、翻譯等細胞的基本生命活動順利進行。有研究結果表明NCS 可與細胞Topo I的酶活性中心Ⅲ區域結合，阻礙Topo I 與DNA 結合，繼而作為阻遏劑抑制Topo I 功能，導致DNA損傷[20]。

2 NCS 抑制結腸癌細胞的作用及其分子機制

NCS 可抑制結腸癌細胞的黏附與侵襲?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9 和MMP-13是結腸癌預后不良的標志物[24]。這些蛋白質中的每一種都消化細胞外基質的一種成分，促進腫瘤細胞的內滲和外滲[25-26]。具體來說，MMP-1 和MMP-13 是膠原酶，MMP-2 是明膠酶，MMP-7消化多種蛋白質，包括膠原蛋白、明膠、層粘連蛋白、蛋白聚糖、纖連蛋白和彈性蛋白等。MMP-1 還會誘導與EMT 和轉移相關的PI3K/Akt 信號傳導[27]。研究顯示，NCS（0.08μM）顯著減少了兩種細胞系（HCT-116 和LoVo 細胞）中MMP-1，MMP-2 和MMP-7 的分泌[28]。

細胞因子水平是結直腸癌患者總體或無病生存的預測因子，特別是白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8），趨化因子配體-4（chemokine ligand-4，CCL-4），趨化因子配體-22（chemokine ligand-22，CCL-22），Fms 相關酪氨酸激酶3 配體（fms-like tyrosine kinase 3 ligand，FLT3L），γ 干擾素（interferon-γ，IFNγ），血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和五聚蛋白3（Pentraxin 3）。重要的是，除了腫瘤微環境和炎癥外，IL-6 和IL-8 在促進結直腸癌遷移和轉移過程中也起著至關重要的作用[29-31]。數據表明，NCS 會減少與結直腸癌患者預后不良相關蛋白Pentraxin 3 和VEGF 的表達。

3 NCS 抑制胃癌細胞的作用及其分子機制

為了研究NCS 對胃癌細胞的影響，有學者[32]對中等和低分化型的BGC-823 和SGC-7901 胃癌細胞株，高度分化的MGC-803 和MKN28 細胞進行實驗，發現NCS 可抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞的凋亡，并顯示劑量和時間依賴性的特點。進一步的實驗表明，其促進自噬蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ），自噬相關蛋白-5（autophagy related protein-5，Atg-5）和Beclin-1 的水平，降低了自噬轉運蛋白p62 的表達，并增加了自噬流[32]。

細胞自噬是在自噬相關基因控制下使用溶酶體降解受損細胞器和大分子物質的過程，這是細胞的一種自我保護機制[33-34]。一方面，自噬可以更好地幫助腫瘤細胞適應外部壓力并促進癌細胞增殖、侵襲以及增強其耐藥性[35-36]。另一方面，當自噬持續激活時，它可以誘導癌細胞的自噬死亡[37-38]。研究表明，Akt/mTOR 信號傳導通路與自噬密切相關[39-40]。NCS 能顯著抑制胃癌細胞中AKT 和mTOR 的磷酸化，但不影響Akt 和mTOR總蛋白的表達水平；并且NCS 是通過抑制胃癌細胞中Akt/mTOR 通路從而誘導自噬、促進胃癌細胞凋亡，最終抑制胃癌細胞增殖[32]。

4 NCS 抑制黑色素瘤細胞的作用及其分子機制

因為黑色素瘤對促凋亡刺激有內在的抵抗力，所以對輔助治療的反應率很低。有研究表明[41]，NCS 通過靶向真核翻譯延伸因子（eukaryotic translation elongation factor 1A，eEF1A），可以部分地克服這種抗性。在黑色素瘤細胞系中，NCS 對細胞生長抑制的IC50值在30～100 nm 之間，但對正常的非癌細胞的生長影響較小。在無毒劑量下，NCS 可顯著提高大腦中攜帶轉移性抗凋亡黑色素瘤異種移植物的小鼠的存活率。50 nM 的NCS 靶向eEF1A 誘導明顯的肌動蛋白細胞骨架解體，導致胞質分裂受損和蛋白質合成受損（延伸和啟動步驟）[41]。

5 NCS 抑制多形性膠質母細胞瘤細胞的作用及其分子機制

有研究發現，NCS 對人多形性膠質母細胞瘤表現出顯著的細胞抑制作用，這種抑制作用與NCS 對有絲分裂率的明顯抑制以及有絲分裂持續時間顯著增加有關[42]。

研究表明，NCS 處理可增加細胞質中含肌動蛋白的應激纖維的數量和厚度。各項數據顯示，經NCS 處理后的絲切蛋白（Cofilin），其磷酸化的增加至少維持了3 h。Cofilin，是主要LIM 結構域激酶（lim kinase，LIMK）的底物[43-44]，不僅是Rho激酶（rho-associated kinase 1，ROCK1）也是磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的下游效應器。最近的研究表明，Cofilin 途徑的總體活性決定了腫瘤細胞的侵襲性和轉移性表型[45]。蛋白印跡結果表明，100 nmol/L NCS 可顯著并迅速增加GL19 多形性膠質母細胞瘤細胞中磷酸絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、ROCK1 以及磷酸化LIMK1/2 的表達。瞬時激活RhoA 后，可誘導細胞中應力纖維和粘附復合物的形成，而各種Rho 亞型也與細胞遷移有關[46]。Rho GTP 酶家族還參與細胞骨架結構，細胞周期控制和基因表達[47]。因此，通過評估NCS 對RhoA 的影響，發現它明顯增加了RhoA 在人多形性膠質母細胞瘤細胞中的活性。

以上研究證明，NCS 對人多形性膠質母細胞瘤表現出顯著的細胞抑制作用是由于NCS 對Rho/ROCK/LIMK/cofilin 信號通路的調節導致肌動蛋白應激纖維穩定性和增殖灶粘附的增加[42]。

6 NCS 抑制口腔癌細胞的作用及其分子機制

NCS 可抑制人口腔癌細胞的運動，NCS 處理24 h 后的3 種細胞系（SAS、SCC-47、SCC-9）的運動能力降低是呈劑量依賴性的，并且NCS 對SAS和SCC-47 細胞系的影響大于SCC-9 細胞系。一項研究發現，經過NCS 的處理，細胞上皮標志物ZO-1 升高，但間充質標志物β-連環蛋白和N-鈣粘蛋白減少。該研究證明了NCS 通過調節EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）從而抑制口腔癌細胞的遷移以及侵襲[48]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑是將細胞外信號轉換為細胞內反應的關鍵信號級聯。MAPK 相關蛋白參與細胞凋亡、增殖、自噬和轉移的調節[49]。有研究發現，在SAS 和SCC-47 細胞中，用高劑量的NCS 處理后，口腔癌細胞中磷酸化細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）下調，而用不同劑量的NCS 處理后，磷酸化p38和磷酸化c-Jun 氨基端激酶（c-jun n-terminal kinase，JNK）則上調。為研究ERK、p38 和JNK與NCS 抑制細胞遷移之間的相關性，該研究在進一步的實驗中使用ERK 抑制劑（U0126）、p38 抑制劑（SB203580）和 JNK 抑制劑（SP600125）。結果表明，U0126 而非 SB203580 或 SP600125 可與NCS 聯合對抗癌細胞轉移。以上研究表明，NCS可通過抑制ERK 信號通路從而抑制口腔癌細胞的轉移。同時該研究還發現，組織蛋白酶（Cathepsin，CTSB）參與NCS 在口腔鱗狀細胞癌中的抗轉移作用[48]。

7 NCS 抑制原發性滲出性淋巴瘤細胞的作用及其分子機制

原發性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一種侵襲性疾病，屬于非霍奇金淋巴瘤的一種亞型，用常規化療治療時預后極差。Gopalakrishnan R 等[50]發現NCS 在低納摩爾濃度下對PEL 表現出選擇性細胞毒性，并且伴隨著多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adp-ribose polymerase，PARP）的裂解、半胱氨酸蛋白酶-3/7（caspase-3/7）的激活和膜聯蛋白表面表達的增加，NCS 在G1 期阻止細胞周期進程并在PEL 中誘導細胞凋亡。進一步研究發現，NCS 處理既不誘導PEL 中KAPOSI 氏肉瘤相關皰疹病毒（KSHV）反式激活因子RTA（ORF50 ）蛋白（KSHVRTA/ORF50）的表達，也不誘導PEL 中感染性KSHV 病毒粒子的產生。MYC 基因是一種屬于編碼核蛋白的癌基因，調節許多細胞活動，包括信號轉導、細胞周期、增殖、分化和凋亡。MYC 在許多癌癥中失調，并且與幾乎三分之一的癌癥有關[51]。盡管細胞中MYC 基因組位點在PEL 中結構完整，卻存在MYC 的過度表達。有研究已經證明下調 MYC 表達的化合物對PEL 有效且具有選擇性[52]。在Gopalakrishnan R 等[50]的研究中測試了NCS 及其結構類似物對包含5 種血液惡性腫瘤的一組細胞系（BC-1、BC-3、BCBL-1、JSC-1、BCP-1、VG-1、APK-1、UMPEL-1、UMPEL-3、DG-75、L428、L1236、MM1S、U266、RS4-11）的影響，結果表明，雖然以上所有癌細胞系都對NCS 及其結構類似物敏感，但PEL 衍生細胞系（BC-1、BC-3、BCBL-1、JSC-1、BCP-1、VG-1、APK-1、UMPEL-1、UMPEL-3）對NCS 及其結構類似物更加敏感。該研究還進一步證明了NCS 對PEL 的抑制活性與其下調 MYC 的能力有關。

8 小結

作為一種體外強效抗腫瘤藥物，NCS 具有選擇性高、作用廣泛的特點，是理想的抗腫瘤候選藥物。在體外抗腫瘤實驗中，NCS 能阻滯腫瘤細胞周期，同時誘導腫瘤細胞凋亡、自噬，并且抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移等。其抗腫瘤效果是多方面多路徑協同作用的，然而NCS 影響各通路的相關性并未明確闡述。同時，目前其體內抗腫瘤活性及確切的作用靶點還有待深入研究。對NCS抗腫瘤的不同機制以及作用靶點的探索將有利于開拓抗腫瘤藥物研發的新方向。

綜上所述，NCS 具有較強的體外抗腫瘤活性，具備一定的臨床應用價值和潛力，但根據國內外有關NCS 的研究，其體內研究不夠深入。因此，目前仍然需要更多的研究考察NCS 的體內抗腫瘤活性以及安全性。