蓖麻RcNFYA3-1基因的克隆及表達分析

楊躍超，呂世友，何智彪，范慕博，張童劼，張繼星

（1.內蒙古民族大學生命科學與食品學院，內蒙古 通遼 028043；2.內蒙古自治區蓖麻產業協同創新中心，內蒙古 通遼 028043；3.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062；4.通遼市農牧科學研究所，內蒙古 通遼 028015；5.內蒙古民族大學農學院，內蒙古 通遼 028043）

轉錄因子屬于DNA結合蛋白，是植物中最重要的一種調節因子［1］。轉錄因子能夠識別上游基因的順式作用元件，同時，可以把細胞表面的信息傳至細胞核［2］，在植物逆境脅迫中發揮著一定的作用［3］。轉錄因子NF-Y，也稱為CCAAT 結合因子，是一種異三聚體轉錄因子，具有高度保守的核心序列CCAAT［4］。NF-Y 因子包含NF-YA、NF-YB 和NF-YC 等3 個部分［5］，NF-Y 的每個亞基都由多個相似序列編碼［6］。NF-YA、NF-YB 和NF-YC 各自廣泛參與植物胚胎和種子發育、脅迫反應、ABA 信號、固氮、根系伸長、植物與微生物相互作用等過程［7-12］。

NFYAs包含2個結構域，是NF-Y最為重要的亞基，其中一個結構域能夠在N端與NFYB和NFYC相互作用，另一個能夠在C端結合DNA［13］。其中，NFYB與NFYC能夠組合形成二聚體，并識別CCAAT-box，最終與NFYA形成三聚體，使DNA結構更松散，進而更有效結合到RNA聚合酶［14］。NF-YA轉錄因子的家族成員也是microRNA169轉錄后調控的靶標之一［15］。microRNA是一種不參與編碼的RNA，參與調節基因的表達［16］。一般來說，由于NFYAs在3′UTR區域大多存在一段miR169的互補位點，植物miRNA可通過切割mRNA 或者在翻譯水平來負調控基因的表達［17］。miR169/NF-YA 能夠被細胞內信息及外界條件激活，使植物對周圍環境改變的適應性提高［18］。擬南芥NFYAs的成員大多都有與miR169互補的保守序列［19］。玉米共有14 個NFYAs 成員，miR169 可以切割8 個NFYAS成員［20］；油菜中miR169 能夠切割12 個NFYAs成員［21］；葡萄中miR169可以切割21個NFYAs成員［22］；此外，水稻［23］、大豆［24］和日本杏［25］中也有相關報道。

蓖麻是大戟科蓖麻屬草本植物［26］，集中分布在熱帶地區或熱帶至暖溫帶地區，適宜高溫，廣泛種植于我國。蓖麻的應用廣泛，具有極高的利用價值，已受到越來越多的關注［27］。蓖麻根系發達，具有防風固沙作用。蓖麻能夠改良鹽堿地，緩解因土地沙化等造成耕地面積減少的問題［28］。內蒙古通遼市土壤鹽堿化現象比較普遍，該地區是蓖麻種植的主要產區，而鹽脅迫是限制該地區蓖麻產量的主要因素之一。筆者克隆了蓖麻NFYA3-1基因，并分析基因的表達模式，為深入研究蓖麻RcNFYA3-1基因的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為“哲蓖三號”，該品種來自通遼市農牧科學研究所。

1.2 蓖麻總RNA提取及cDNA合成

將大小一致的種子均勻地擺放在發芽盒中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度70%～75%的光照培養箱中培養，至4葉齡。用200 mmol/L NaCl 處理0、2、6、8、12、24 h，分別取根、莖、葉，立即放于液氮，在-80 ℃冰箱備用。采用Trizol法提取蓖麻總RNA，并進行電泳檢測。

1.3 蓖麻NFYA3基因克隆

反轉錄獲得模板cDNA，RcNFYA3-1的上游引物和下游引物（表1）由prime primer5軟件設計，加入載體的酶切位點。進行PCR擴增反應（表2），使用康為世紀Gel Extraction Kit試劑盒對目的條帶進行回收，連接pMDTM19-T Simple Vector，并轉入大腸桿菌感受態中。經陽性菌株篩選后進行菌液PCR，檢測成功后測序。

表1 PCR所用引物序列Tab. 1 Primer sequences used for PCR

表2 PCR反應條件Tab. 2 PCR reaction conditions

1.4 生物信息學分析

對RcNFYA3-1進行生物信息學分析所用的工具見表3。

表3 生物信息學分析所用相關網站、在線軟件Tab. 3 Relevant websites and online software for bioinformatics analysis

1.5 植物表達載體構建

測序正確的菌株進行擴增培養并提質粒，對重組質粒進行雙酶切（表4）。與PCHF-3300 進行連接（表5），將連接產物轉到大腸桿菌中，培養并進行擴搖，對擴搖后的菌液進行PCR檢測，對陽性菌進行雙酶切鑒定。

表4 酶切體系Tab. 4 Enzymatic system

表5 連接體系Tab. 5 Ligation system

1.6 RcNFYA3-1基因的表達分析

以測序得到的RcNFYA3-1序列，通過NCBI設計熒光定量引物（表1）。RcADP和RcSKIP作為內參基因，進行不同鹽處理下蓖麻根、莖和葉中RcNFYA3-1表達量的測定，反應條件見表6。實驗設置3次重復，2-ΔΔCT計算基因相對表達量［29］。

表6 qRT-PCR反應程序Tab. 6 qRT-PCR reaction procedure

2 結果與分析

2.1 RcNFYA3-1全長的獲得與序列分析

蓖麻總RNA經反轉錄得到cDNA，擴增得到NFYA3-1基因，擴增產物大小為984 bp（圖1），編碼327個氨基酸（圖2）。RcNFYA3-1蛋白保守區由NCBI預測（圖3）。結果表明，蓖麻RcNFYA3-1基因有一個CCAAT框架結合轉錄因子（CBFB-NFYA）保守結構域，位于氨基酸位點183～237處。利用DNAMAN軟件對蓖麻RcNFYA3-1氨基酸進行比對，6種植物中一致性較高（圖4）。分別為木薯、山靛、巴西橡膠樹、開心果、麻風樹、胡楊。RcNFYA3-1的氨基酸序列與木薯、山靛、巴西橡膠樹、開心果、麻風樹、胡楊的氨基酸序列相似度超過50%，與木薯的相似度最高，為68.77%。

圖1 PCR擴增產物Fig. 1 PCR products

圖2 RcNFYA3-1 基因核苷酸及氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and amino acid sequences of RcNFYA3-1 gene

圖3 RcNFYA3-1蛋白保守結構域Fig. 3 Conserved structural domains of RcNFYA3-1 protein

圖4 NFYA基因家族多序列比對Fig. 4 Multiple sequence comparison of the NFYA gene family

2.2 RcNFYA3-1理化性質和蛋白結構分析

通過ExPASy 得到RcNFYA3-1蛋白的理化性質，該蛋白編碼327個氨基酸殘基，編碼蛋白質的相對分子質量為36.093 kD，原子總數為4984個；蛋白質由18種氨基酸組成，其中，絲氨酸的數量最多，PI值為9.22。NFYA3-1蛋白的二級結構通過SOPMA預測（圖5），該蛋白質的無規則卷曲占比最高為66.67%，α螺旋為17.13%、延伸鏈為11.39%以及β-折疊為4.28%；利用SWISS-Model進行三級結構預測（圖6）。通過TMHMM分析RcNFYA3-1蛋白的跨膜結構（圖7），該蛋白氨基酸都存在于細胞膜表面，是一種典型的非跨膜蛋白。利用DNAMAN軟件進行的蛋白質親水性分析結果表明，NFYA3-1編碼的蛋白質親水區較大，推測該蛋白為親水性蛋白（圖8）。

圖5 RcNFYA3-1蛋白的二級結構Fig. 5 Secondary structure of the RcNFYA3-1 protein

圖6 RcNFYA3-1蛋白三維結構Fig. 6 Three-dimensional structure of RcNFYA3-1 protein

圖7 RcNFYA3-1蛋白跨膜結構Fig. 7 Transmembrane structure of RcNFYA3-1 protein

圖8 RcNFYA3-1蛋白親水性、疏水性分析Fig. 8 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of RcNFYA3-1 protein

2.3 RcNFYA3-1表達載體構建

對重組質粒進行電泳檢測（圖9），經酶切的表達載體條帶遠小于重組質粒，且目的條帶與RcNFYA3-1序列大小相同（圖10），表明表達載體構建成功。

圖9 質粒電泳檢測Fig. 9 Plasmid electro phoresis detection

圖10 質粒酶切檢測Fig. 10 Plasmid digestion detection

2.4 RcNFYA3-1鹽脅迫下表達分析

RcNFYA3-1鹽處理后的基因表達量顯示，蓖麻RcNFYA3-1基因主要在根中表達，在8 h達到最高，在12 h時差異顯著；莖中的表達量在2 h時達到最高，且差異極顯著；葉的表達量在12 h時最高，超過其他時間點的表達量且差異顯著（圖11）。

圖11 RcNFYA3-1表達量的測定Fig. 11 Determination of the expression of RcNFYA3-1

3 討論與結論

從蓖麻中克隆得到轉錄因子RcNFYA3-1基因，構建RcNFYA3-1過表達載體，并進行生物信息學分析。結果顯示，蓖麻RcNFYA3-1的氨基酸序列與木薯等5種植物的氨基酸序列高度一致。RcNFYA3-1是一種親水性蛋白質，沒有跨膜結構域。RcNFYA3-1基因序列分析發現，RcNFYA3-1基因有CCAAT框結合轉錄因子（CBFB-NFYA）保守結構域。

通常情況下，植物在應對不利環境過程中形成了復雜抗逆機制。在植物中，NF-Y 因子既參與植物的生長和發育過程［30-31］，也參與植物逆境脅迫［32］。RcNFYA3-1作為核轉錄因子，同時也是miRNA-169家族成員的靶基因，在植物耐鹽堿中可能扮演著重要的角色。本研究結果表明，NFYA基因家族中多個成員參與鹽脅迫的調控。NI等［14］過表達GmNFYA3能夠明顯增加GmNFYA3轉基因擬南芥的耐旱性，同時，相比于野生型表現出對鹽更敏感。一項關于大白菜的BpNFYA5研究發現，在干旱環境下，過表達BpNFYA5能夠增加脯氨酸的含量，從而增加植株的耐旱性［33］。此外，在擬南芥中過表達miRNA-169，結果導致AtNFYA2、AtNFYA3和AtNFYA8的表達量降低，使植株對氮的響應能力改變［34］。水稻OsmiR169基因在應對鹽脅迫時高度表達，并通過靶向和抑制特定OsNF-Ya基因家族mRNA的表達來消除ABA信號的阻斷，從而產生對鹽脅迫的抗性響應，使植物存活下來［35］。

本研究經qRT-PCR分析，蓖麻RcNFYA3-1基因存在組織特異性，該基因極大可能在鹽脅迫下在蓖麻中發揮作用，但具體調控機制仍需進一步探索。