基于腸道菌群和代謝組學構建潰瘍性結腸炎伴艱難梭菌感染的診斷模型

王 卓，萬 健，張玉潔，賀文芳，吳開春

(1國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，消化系腫瘤整合防治全國重點實驗室，空軍軍醫大學西京消化病醫院，陜西 西安 710032；2西安醫學院基礎醫學部組織學與胚胎學教研室，陜西 西安 710021)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)作為慢性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病的一種，其主要臨床表現為腹痛、腹瀉和便血[1]。在我國，隨著社會的發展、西方化飲食的普及和生活環境的改變，UC發病率逐年提高[2-3]。然而，UC確切發病機制仍不清楚，越來越多的證據表明UC的發病和進展與腸道微生物及其代謝物(如短鏈脂肪酸等)的改變存在密切聯系[4-6]。另有研究表明，UC患者腸道微生態的紊亂，使患者更容易受到多種細菌感染[如艱難梭菌(Clostridioidesdifficile，CD)等][7]。

CD是臨床常見的機會致病菌，CD感染目前已經成為一個全球范圍內嚴重的醫學和流行病學問題[8]。近年來研究發現，CD感染是UC患者最常見的感染性并發癥。目前對于UC患者CD感染的診斷，主要依賴于實驗室檢查，包括產毒性CD菌株的培養，CD毒素檢測以及毒素基因的核酸檢測[9]。然而，產毒性和非產毒性CD均可在UC患者腸道定植，通過臨床癥狀無法準確判斷患者是否存在CD感染。目前的實驗室檢查無法對CD感染患者和定植患者做明確區分，且很少有研究對兩者做區分[10]。本研究基于UC患者合并或/和未合并CD感染患者糞便的差異菌和代謝物，建立UC存在CD感染的協助診斷模型，以期幫助臨床醫生快速準確地發現存在CD感染的UC患者，從而精準制定治療策略。

1 對象與方法

1.1 對象

對2018—2019年在空軍軍醫大學西京醫院就診的58例UC患者進行回顧性研究，其中UC未合并CD感染的患者(UCN組)29例，UC合并CD感染的患者(UCP組)29例。所有參與者均已簽署知情同意，該研究經中國臨床試驗注冊中心倫理委員會(ChiECRT20190106)批準。納入標準：①根據病史和臨床癥狀，結合實驗室檢查、內鏡和組織學檢查確診的UC患者；②CD感染的診斷標準符合《艱難梭菌感染診斷》指南[11]；③近3個月未使用抗生素。排除標準：①處于妊娠或哺乳期的女性；②同時診斷為其他感染性疾病、胃腸道穿孔或嚴重的心臟和肝臟疾病。

1.2 數據收集

由接受過統一培訓的人員收集人口學特征(如年齡、性別)和身體質量指數、UC嚴重程度、近期用藥情況；采集患者外周血，使用全自動血生化儀器檢測白細胞、血紅蛋白、血沉、C-反應蛋白、血小板、D-二聚體、尿素氮和肌酐8項生化指標；采集患者糞便，隨后采用16S rRNA檢測微生物菌種，用氣相色譜-飛行時間譜的非靶標代謝組質譜法檢測糞便代謝產物，課題組前期分析出兩組間存在5種差異菌屬和16種差異代謝物，記錄差異菌屬和代謝物相對豐度。16種差異代謝物分別是十六烷、腐胺、2，4-羥基丁酸、乳酸、氨基丙氨酸、3-羥基正賴氨酸2、4-羥基苯甲酸、3-苯基乳酸、來蘇糖1、麥芽糖、槐糖2、甘露糖、尿苷2、2-脫氧尿苷、5-氫化可的松1和松柏醇。5種差異菌屬包括Aggregatibacter、ClostridiumⅪ、Clostridiumsensustricto、Citrobacter和ClostridiumⅪⅤb。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者臨床一般資料比較

UCP組C-反應蛋白升高者(C-反應蛋白>6 mg/L的研究對象)占比高于UCN組，差異存在統計學意義(P<0.05)；兩組患者身體質量指數差異無顯著性[(19.64±3.45)kg/m2vs(21.49±4.17)kg/m2，χ2=1.840，P=0.071]；其余指標組間差異無顯著性(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較 [n=29，n(%)]

2.2 UC患者存在CD感染的單因素和多因素分析

前期研究篩選的差異代謝物和菌屬合計21種，單因素logistic回歸分析發現，在差異菌屬中ClostridiumⅪ在2組之間有統計學差異。在代謝物方面，十六烷、乳酸、松柏醇、3-苯基乳酸存在顯著差異(P<0.05)，而其他微生物和代謝物，兩組間差異無統計學意義(P>0.05，表2)。以UC是否存在CD感染為因變量，將單因素分析中P<0.05的變量設為自變量納入多因素logistic回歸分析。結果顯示，十六烷低含量、乳酸和ClostridiumⅪ菌高含量是UC患者存在CD感染的獨立風險因素。將三者分別作為協變量X1(十六烷)、X2(乳酸)、X3(ClostridiumⅪ)，得出的模型表達式為：logit(P)=0.724-0.980×X1+1.512×X2+1.298×X3(表2)。

表2 UC患者存在CD感染的單因素和多因素logistic回歸分析

2.3 UC患者存在CD感染診斷模型的評估

根據本研究建立的診斷模型繪制ROC曲線(圖1)，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.873(95%CI：0.782～0.964)，提示該預測模型的區分能力較好；最佳臨界值(0.655)時該模型的診斷閾值為0.411，此處敏感度為79.3%，特異度為86.2%，該模型使用Hosmer-Lemeshow擬合優度檢驗評估擬合效果，結果顯示χ2=5.381，P=0.716，提示該預測模型校準度較好。

ROC：受試者工作特征。

3 討論

近年來研究發現CD的感染能夠誘發和加重UC。感染CD的UC患者藥物治療和醫療費用、緊急結腸切除術比率、住院時間、死亡率均明顯增加[12]。因此，UC患者CD感染的準確判斷對患者短期和長期預后的評估具有重要的臨床價值，然而CD感染與定植的區分，一直沒有很明確的界限，本研究應用logistic回歸模型和ROC曲線建立UC患者存在CD感染的診斷模型，診斷模型ROC的AUC為0.873，靈敏度為79.3%，特異度為86.2%，提示模型區分度好。擬合優度檢驗χ2=5.381，P=0.716，提示模型準確性好，說明基于十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ 3項指標構建的診斷模型對UC患者CD感染有較高的臨床診斷價值，能夠協助實驗室檢查正確診斷CD感染。

既往研究認為UC患者腸道微生物的紊亂，與CD定植和感染的機會增加有關[12-14]。同時，腸道微生物的改變與疾病狀態相關[15]。已有的研究表明CD所屬的ClostridiumⅪ菌屬在健康人體中是普遍存在[16-17]，其中包含多種條件致病菌，如CD、索氏梭菌。該菌屬也被認為是一種能夠促進炎癥和誘導結腸炎的細菌屬[18]，是腸道有害細菌群之一。ClostridiumⅪ數目的增多與人類腸道炎癥的加重相關[19]，也與小鼠肝癌發生進展存在一定聯系[20]。在多種疾病的患者糞便中該菌屬的數量增加[20-21]。因此，UC患者中該菌屬數量的增高對UC患者存在CD感染的準確判斷起到積極的提示作用。

除了腸道微生物外，微生物代謝物的改變在一定程度上也能夠反映患者的疾病狀態。既往研究發現腸道微生物的改變能夠引起代謝物的改變[22]。本研究發現在UC合并CD感染的患者糞便代謝物中十六烷降低和乳酸升高，同時多因素分析發現十六烷和乳酸的含量高低也是UC患者CD感染的獨立影響因素。

十六烷是一種碳氫化合物，烷烴類有機物。既往研究發現，在嚙齒動物體內十六烷可以誘導關節炎、慢性腹膜炎和自身抗體的產生[23]，并作為佐劑誘導動物自身免疫，同時增強動物的特異性和非特異性免疫反應[24-25]。這些結果說明，十六烷可能在腸道炎性疾病的發病機制中起到一定的免疫作用，但其含量降低與UC患者CD感染之間相互聯系的具體機制還有待進一步探索。

本研究診斷模型中還包含一種有機酸——乳酸。乳酸作為一種信號分子，參與葡萄糖代謝、脂肪酸合成、氧化還原穩態和蛋白質的翻譯后修飾，調節人體生理狀態[26]。此外，乳酸也能夠參與炎癥損傷，增強巨噬細胞分泌IL-6，基質金屬蛋白酶1和IL-1β，增強NF-κB活性[26-27]。既往研究發現乳酸是慢性炎癥組織中的信號分子，其在炎癥部位的累積，可抑制T細胞的遷移，將T細胞保留在炎癥部位，通過增加炎性細胞因子的產生和減少細胞溶解來延長慢性炎癥，促進慢性炎癥的進展[28-29]。另外，乳酸通過激活IL-23依賴性和非依賴性途徑，影響腫瘤微環境，進而促進慢性炎癥[30]。乳酸與RAF-ERK信號通路的激活存在一定的聯系，調控炎癥和血管生成[31]。乳酸的升高可能會導致機體整體或局部的炎癥狀態加重。課題組前期研究發現乳酸的含量與Haemophilus菌屬含量有強的正相關[32]，說明乳酸的升高與該菌屬中致病菌增多有關?？紤]到腸道微生物與代謝物之間的聯系，乳酸的改變可能與病原微生物的升高和有益菌的降低有關。乳酸在腸道堆積能夠誘導慢性腸道疾病炎癥加重，加重腸道微生物紊亂，從而給致病菌提供了適宜的生存條件，進一步導致或加重CD感染。本研究初次使用差異微生物和代謝物協助診斷存在CD的感染UC患者，發現差異微生物和代謝物對疾病的協助診斷潛能。

綜上所述，十六烷、乳酸和ClostridiumⅪ相對含量與UC患者是否存在CD感染密切相關，使用3項指標建立UC患者CD感染的診斷模型，有良好的預測效果，為正確判斷UC患者存在CD感染提供了新思路。但本研究具有樣本量較少的局限性，有待未來更大樣本研究加以補充和完善。該研究給予臨床醫師一定的啟發，對于存在CD感染的UC患者在正確診斷的基礎上，給予藥物治療的同時，調整腸道微生物和代謝物的種類和含量可能會有助于加快UC患者CD感染的治愈和UC的緩解。