miR-145基因多態性與腦梗死的關系及對miR-145水平的影響*

黃艷云,陸青蘭,韋必曉,楊麗娜,黃榮透

廣西壯族自治區百色市人民醫院檢驗科,廣西百色 533000

腦梗死(IS)是一種致殘率高、致死率高的復雜性腦血管疾病,微小RNA (miRNA)在其發病與進展過程中發揮了關鍵性的作用[1]。作為一種基因轉錄后的調控因子,miRNA能夠調控目標mRNA的表達從而介入多種生命活動如細胞生長、分裂、衰退或發育等[2]。miRNA被廣泛視為多種癌癥的抑制因子,其在腫瘤生長發育、凋亡、侵襲和轉移中起著關鍵作用[3-4]。此外,miR-145也被證明是血管平滑肌細胞最豐富的miRNA,其水平相對較小的變化會顯著影響血管穩態,與動脈粥樣硬化相關疾病的發生和發展密切相關[5-7]。以往的諸多研究結果表明,miR-145在IS患者中表達失衡,其異常表達在IS病理學中起著至關重要的作用,或將成為IS的生物標志物和(或)治療目標[8-12]。但導致miR-145在IS中表達失衡的分子機制尚不清楚。單核苷酸多態性(SNP)可能是miR-145調控的重要因素。已有多項研究表明,miR-145基因SNP與多種疾病的易感性有關,并影響miR-145的表達[5,7,9,13]。鑒于此,本研究篩選了miR-145基因中次要等位基因頻率較高且與多種疾病易感性有關的rs41291957、rs353291位點,探討其與IS的關系,并評估miR-145在IS患者中的表達及其與這2個位點SNP之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 從2021年1-12月在本院神經內科住院患者中篩選出253例初次確診為IS的患者,其中男153例、女100例,平均年齡(63.4±11.1)歲。IS診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中的相關診斷標準,并經過臨床、實驗室及射影像學等一系列檢查綜合確診。另選取同期在本院體檢中心體檢的275例健康者作為對照組,其中男147例、女128例,平均年齡(61.9±9.5)歲。兩組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。排除標準:腦出血、顱內感染、腫瘤、自身免疫性疾病和傳染類疾病;患嚴重影響肝、腎、心功能的疾病。這些個體都是非親緣關系的廣西地區人口。本研究經本院醫學倫理委員會批準。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集標本 收集所有研究對象清晨空腹靜脈血3～5 mL(EDTA-K2抗凝),用于基因組DNA提取和單個核細胞的分離。所有標本存儲于-70 ℃冰箱備用。

1.2.2基因組DNA提取和分析 使用由重慶中元匯吉生物技術股份有限公司供應的核酸提取試劑盒(磁珠法)進行全血基因組DNA檢測,并嚴格按照說明書操作。在完成DNA樣本提取后使用紫外分光光度計檢測其質量和濃度。

1.2.3引物的設計與合成 利用NCBI搜索含有rs41291957、rs353291位點的長度適宜的DNA片段,然后使用Prime 3.0軟件為這些片段設計引物,并將其交給北京擎科生物科技公司來生產,而探針引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列信息如表1所示。

表1 rs41291957、rs353291引物序列信息

1.2.4rs41291957、rs353291位點多態性檢測 采用TaqMan探針法熒光定量PCR檢測。PCR擴增反應體系為上、下游引物各0.4 μL,探針引物0.2 μL,2×AceQ qPCR Probe Master Mix(Vazyme)10 μL,DNA模板1 μL,加雙蒸水至總體積20 μL。按照上述體系完成加樣后,把加好樣品的反應板置于德國Analytik Jena qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀中進行反應。PCR循環參數:95 ℃預變性反應3 min,然后40個循環(95 ℃變性15 s,56 ℃復性15 s,72 ℃延伸20 s)。反應結束后根據擴增曲線的峰型和信號強度并結合人工校驗進行基因型判斷,以保證試驗結果的準確性。

1.2.5外周血單個核細胞中miR-145水平的檢測 利用Trizol技術從外周血單個核細胞中提取總RNA,提取產物使用紫外分光光度計評估其純度,如果A260/A280落在1.9～2.1,則該RNA樣本滿足實驗要求。接著,采用由寶生物工程(大連)公司提供的試劑盒來檢測基因mRNA的表達水平。然后采用反轉錄試劑盒(Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit,Takara)將RNA合成為cDNA,再根據cDNA 2 μL、SYBR Advantage Premix 12.5 μL、正向及反向引物各0.5 μL、ROX Dye 0.5 μL、去離子水9 μL的比例進行PCR。使用相對定量分析2-ΔΔCt法計算miR-145相對表達水平。

1.3觀察指標 (1)比較IS組和對照組rs41291957、rs353291位點多態性分布情況。(2)比較IS組和對照組miR-145水平。(3)分析rs41291957、rs353291位點不同基因型研究對象的miR-145水平。

2 結 果

2.1兩組rs41291957、rs353291多態性遺傳平衡評估 IS組和對照組rs41291957、rs353291的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律的要求(P>0.05),具有群體代表性。見表2。

表2 兩組rs41291957、rs353291多態性Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果

2.2不同性別研究對象miR-145基因rs41291957、rs353291多態性分布情況比較 IS組和對照組中,不同性別間rs41291957、rs353291基因型及等位基因的分布頻率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組不同性別研究對象miR-145基因rs41291957、rs353291多態性分布情況比較[n(%)]

2.3IS組和對照組miR-145基因rs41291957、rs353291多態性分布情況比較 rs41291957、rs353291位點的基因型頻率和等位基因頻率在IS組與對照組間比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 兩組間rs41291957、rs353291多態性分布情況比較[n(%)]

2.4IS組和對照組miR-145水平比較 IS組患者外周血單個核細胞中miR-145水平為4.68±1.02,顯著高于對照組的2.70±0.83,差異有統計學意義(P<0.001)。

2.5miR-145基因rs41291957、rs353291位點不同基因型miR-145水平比較 對IS組或對照組進行組內分析,rs41291957和rs353291位點各基因型之間miR-145水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 miR-145基因rs41291957、rs353291位點不同基因型miR-145水平比較

3 討 論

IS被確定為一種復雜的腦血管疾病,受各種環境和遺傳因素的影響。SNP是人類基因組中最常見的遺傳變異類型。位于miRNA中的SNP被稱為miRSNPs,這種miRSNPs可能通過改變自身的轉錄翻譯過程或對miRNA-mRNA的相互作用施加影響來發揮作用,從而影響個體患病的風險[14-15]。目前已有多個miRSNPs被證明與IS風險密切相關[16-17]。近年來的研究發現,miR-145基因rs41291957和rs353291 SNP不僅與慢性腎臟疾病[18]、腹主動脈瘤[19]等多種疾病的易感性相關,而且與動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病的風險相關[5,7]。由于IS的重要病理學基礎是動脈粥樣硬化,因此,miR-145的 rs41291957、rs353291位點SNP可能在IS發生中起作用。為此,本研究在廣西人群中進行了二者之間的相關性研究。本研究結果顯示,miR-145基因rs41291957、rs353291位點在IS組和對照組中均存在AA、AG、GG 3種基因型,且這2個位點在IS組和對照組中的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。這表明所選擇的研究樣本可以有效地反映這2個SNP位點存在于目標人口的情況,具有群體代表性,且這種多態性在群體中不存在性別間的差異。但是rs41291957和rs353291的基因型頻率和等位基因頻率分布在IS組與對照組間比較,差異均無統計學意義(P>0.05),提示miR-145 rs41291957和rs353291多態性不會影響廣西人群IS發病。與上述研究結果相比,本研究結果未發現這2個SNP與IS易感性有關聯,可能的原因是本研究與上述研究的疾病和人群不同。即便同一種疾病,也會因研究人群的不同導致結果不一致。不同的地理、種族群體因遺傳背景相差較大,往往具有獨特的遺傳易感性位點。例如,WEI等[9]報道,miR-145基因rs4705342 TC/CC基因型與中國南方漢族人群IS風險降低相關;然而,ZHU等[20]報道,rs4705342 SNP與中國北方漢族人群IS風險無關。

近幾年多項研究結果發現,miR-145在IS患者中差異表達與IS的發生密切相關,miR-145有望成為一種新的無創的特異性生物標志物來識別IS[8,11]。本研究數據也顯示,IS組患者外周血單個核細胞中miR-145水平顯著高于對照組,這與以往的研究結果一致,支持miR-145可能是新一代IS預測指標的觀點。目前,關于miR-145與IS的研究主要集中在miR-145水平及其調控機制上,但導致其在IS中表達失調的分子機制鮮有研究。SNP可能是miR-145調控的重要因素。已有多項研究表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位點與多種疾病的易感性相關,并影響miR-145的表達。例如,HALL等[5]研究發現,rs41291957 A等位基因的存在與成熟miR-143和miR-145水平顯著增加有關,并影響冠狀動脈疾病的發病風險。另有研究報道,與miR-145 rs353291 TT基因型的個體相比,C等位基因攜帶者對動脈粥樣硬化的易感性增加且miR-145水平降低[7]。這些研究結果表明,miR-145基因rs41291957、rs353291位點與miR-145水平之間存在明顯的基因型、表型相關性。然而遺憾的是,本研究在對IS組或對照組進行組內分析時,這2個位點各基因型之間miR-145水平差異均無統計學意義(P>0.05),提示rs41291957和rs353291位點SNP對miR-145的水平不具有調節作用。本研究結果與其他研究結果相反,這可能是同一個SNP在不同疾病中調控機制不同的原因,miR-145在IS中異常表達可能是其他分子機制引起的。

綜上所述,本研究進一步確認miR-145在IS患者外周血單個核細胞中水平升高,為其作為IS潛在的生物診斷標志物提供了支持。但是,miR-145基因rs41291957、rs353291位點多態性與IS易感性不存在關聯性,且對miR-145水平也不具有調節作用?；蚨鄳B性在不同種族及地理人群間存在異質性,本研究只針對廣西地區人群,該結論可能不適用于其他種族和其他地區群體?，F階段的文獻中幾乎沒有涉及miR-145基因rs41291957、rs353291多態性與IS遺傳風險之間關聯的研究報告,兩者之間是否有關聯,還需要更多的數據支持,包括從更多地域和民族背景的人口或者更大規模的團隊中收集信息。