北蟲草飲品配方優化及其理化特性

趙歡，楊曉靜，賀曉龍，2*，王曉澗，2，趙瑞華，2，高瑜，羅繼分

（1.延安大學 生命科學學院，陜西 延安 716000；2.陜西省區域生物資源保育與利用工程技術研究中心，陜西 延安 716000；3.延安菌艦生物科技有限公司，陜西 延安 716000）

北蟲草[Cordycepsmilitaris（L.exFr.）Link.]屬于真菌門，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬[1]，在許多國家被視為功能性食品[2]。野生的蟲草已被證明可以寄生于鱗翅目昆蟲蛹[3]，為了對其進行馴化，科研工作者利用在蠶蛹中接種子囊菌，成功獲得蛹蟲草子實體（人工培養）[4-5]。北蟲草中含有豐富的營養物質和功能性化合物，如蟲草素、多糖、腺苷、麥角甾醇、D-甘露醇等，具有抗疲勞、抗衰老、抑菌和增強免疫力（防止肺部、肝臟和腎臟的惡化）等功效[6-8]。麥角甾醇是脂溶性維生素D的前體，可以有效減少細胞炎癥并誘導細胞凋亡[9]。蟲草素常被用作蟲草品質控制的有效化學標記[10]，北蟲草中多糖具有廣泛的生物學和藥理學功能，包括免疫活性、抗氧化活性、抗腫瘤活性和抗炎活性等[11]。

以北蟲草、木糖醇、六偏磷酸鈉、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉等為原輔料，通過單因素試驗與響應面試驗對北蟲草飲品進行最優配方確定，通過構建偏最小二乘法判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）模型獲得對北蟲草飲品品質貢獻率較大的差異性成分。研發一款增添北蟲草特有營養成分與色澤香味的飲品，以期為北蟲草的深加工與研發高附加值產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

北蟲草：選育自延安大學生命科學學院食藥用菌實驗室；麥芽糖醇（≥99%）：河南久洲食品有限公司；木糖醇（≥99%）：山東福田藥業有限公司；羧甲基纖維素鈉（≥99%）、六偏磷酸鈉（≥98%）：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸（≥99%）：上海鑫泰實業有限公司；D-異抗壞血酸鈉（≥98%）：河南糖柜食品有限公司；

多功能料理機（JYL-C91T）：九陽股份有限公司；恒溫水浴鍋（HH-80）：常州市億能實驗儀器廠；高壓蒸汽滅菌鍋（BKQ-B50II）：濟南歐萊博科學儀器有限公司；電子天平（BL-220H）：島津企業管理（中國）有限公司；超凈工作臺（BBS-SSC）：山東高芯生物傳感器研究院有限公司；紫外分光光度計（UV-1600B）：翱藝儀器（上海）有限公司；分散均質機（FJ200）：上?？茣钥茖W儀器有限公司；自吸式粉碎機（JYL-C91T）：廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 配方設計

經過前期預試驗，以添加北蟲草粉7%、麥芽糖醇2%、木糖醇2.6%、羧甲基纖維素鈉0.03%、六偏磷酸鈉0.03%、檸檬酸0.15%、D-異抗壞血酸鈉0.06% 為基礎配方。以北蟲草飲品的感官評分為標準，將羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉、北蟲草粉、麥芽糖醇和木糖醇、檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉的添加量設置為4 個因素，通過單因素試驗與響應面法進行配方優化。

1.2.2 工藝流程

北蟲草粉→混料→加入木糖醇、羧甲基纖維素鈉等輔料調配→均質→脫氣→罐裝→殺菌→靜置冷卻→成品。

1.2.3 工藝要點

1.2.3.1 輔料選擇與處理

選用延安大學生命科學學院食藥用菌實驗室選育的北蟲草，符合標準質量要求，將北蟲草除雜后用自吸式粉碎機粉碎5 min（過200 目篩），得到北蟲草粉。

1.2.3.2 北蟲草液制作

將處理好的北蟲草粉與水按照料液比1∶35（g/mL）混合，用多功能料理機攪拌5 min，待其無明顯顆粒時，收集北蟲草液備用。

1.2.3.3 混料

在多功能料理機中緩慢加入麥芽糖醇、木糖醇、羧甲基纖維素鈉、六偏磷酸鈉、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉、60～80 r/s 攪拌2 min 后，緩慢加入處理好的北蟲草液，攪拌均勻。

1.2.3.4 均質

利用分散均質機使混料在25 MPa 壓力條件下進行均質，使混料更加均勻。

1.2.3.5 罐裝殺菌

將均質后的樣品罐裝并放置在高壓蒸汽滅菌鍋，在100 ℃高溫條件下進行滅菌30 min。

1.2.3.6 冷卻

由于滅菌后的北蟲草飲品殘留溫度較高，所以應進行冷卻處理，待其冷卻至50 ℃進行特性指標測定。

1.3 感官評價

參考賈金輝等[12]的方法并稍作修改，選取10 名評價人員對北蟲草飲品的色澤、形態、風味、口感、組織狀態5 個方面進行感官評分，評分標準見表1。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量的確定

北蟲草粉添加量為7%，麥芽糖醇添加量為2%；木糖醇添加量為2.6%；檸檬酸添加量為0.15%；D-異抗壞血酸鈉添加量為0.06%，以感官評分為標準，設置羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉（質量比1∶1）添加量為0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 和0.05%，得出最優羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量范圍。

1.4.2 北蟲草粉添加量的確定

麥芽糖醇添加量為2%；木糖醇添加量為2.6%；羧甲基纖維素鈉添加量為0.03%；六偏磷酸鈉添加量為0.03%；檸檬酸添加量為0.15%；D-異抗壞血酸鈉添加量為0.06%，以感官評分為標準，設置北蟲草粉添加量為7%、9%、11%、13%、15%，得出最優北蟲草粉添加范圍。

1.4.3 麥芽糖醇和木糖醇添加量的確定

北蟲草粉添加量為7%，羧甲基纖維素鈉添加量為0.03%；六偏磷酸鈉添加量為0.03%；檸檬酸添加量為0.15%；D-異抗壞血酸鈉添加量為0.06%，以感官評分為標準，設置麥芽糖醇和木糖醇（質量比1∶1.3）添加量為3%、4%、5%、6% 和7%，得出最優麥芽糖醇和木糖醇添加量范圍。

1.4.4 檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的確定

北蟲草粉添加量為7%，麥芽糖醇添加量為2%；木糖醇添加量為2.6%；羧甲基纖維素鈉添加量為0.03%；六偏磷酸鈉添加量為0.03%，以感官評分為標準，設置檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉（質量比1∶0.4）添加量為0.15%、0.20%、0.25%、0.30% 和0.35%，得出最優檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量范圍。

1.5 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量（A）、北蟲草粉添加量（B）、麥芽糖醇和木糖醇添加量（C）、檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量（D）為4 個考察因素，以感官評分為響應值，通過Design Expert 13.1.0 設計響應面試驗，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.6 北蟲草飲品指標的測定

北蟲草飲品的酸價參考林楊斌[13]的方法測定；過氧化值參考高牡丹等[14]的方法測定；菌落總數、大腸桿菌數、霉菌和酵母數參考劉鳳會[15]的方法測定；氨基酸通過劉芳等[16]的方法測定；酸度依據邢常輝等[17]的方法測定；甜度采用賀璇等[18]的方法測定。

1.7 數據處理

每組試驗重復測定3 次。試驗采用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 22.0 進行數據統計和計算；采用SIMCA 13.0 軟件進行PLS-DA 模型構建與差異化分析；采用Origin 2021 軟件進行繪圖，采用Design Expert 13.1.0 軟件對北蟲草飲品進行響應面試驗及模型構建。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量的確定

羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉（1∶1）添加量對北蟲草飲品的甜度、酸度、感官評分的影響見圖1。

圖1 羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量對飲品的影響Fig.1 Effect of adding sodium carboxymethyl cellulose and sodium hexametaphosphate on beverages

由圖1 可知，羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%時，北蟲草飲品的感官評分最高，在此條件下飲品清澈、無雜質、口感柔和。當羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量高于0.04%時，隨著羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量的增加，北蟲草飲品會有苦味產生。羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量過低時（0.01%～0.03%），北蟲草飲品口感有顆粒感且伴隨雜質產生。因此，選取羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.03%、0.04%和0.05%進行后續響應面試驗。

2.1.2 北蟲草粉添加量的確定

北蟲草粉添加量對北蟲草飲品的甜度、酸度、感官評分的影響見圖2。

圖2 北蟲草粉添加量對飲品的影響Fig.2 Effect of adding amount of Cordyceps militaris powder on beverages

由圖2 可知，當北蟲草粉添加量為9%時，北蟲草飲品的感官評分最高，此時的北蟲草飲品光度飽滿且清晰可見，顏色呈橘色略帶紅，口感香甜。當北蟲草粉添加量低于9%時，北蟲草飲品的口感有粗粒感，當北蟲草粉添加量高于9% 時，北蟲草飲品顏色偏白。因此，選取北蟲草粉料液比為7%、9%、11% 進行后續響應面試驗。

2.1.3 麥芽糖醇和木糖醇添加量的確定

麥芽糖醇和木糖醇（1∶1.3）添加量對北蟲草飲品的甜度、酸度、感官評分的影響見圖3。

圖3 麥芽糖醇和木糖醇添加量對飲品的影響Fig.3 Effect of adding amounts of maltitol and xylitol on beverages

由圖3 可知，當麥芽糖醇和木糖醇添加量為6%時，北蟲草飲品感官評分最高，在此條件下，北蟲草飲品質地均勻，流動性好，黏度適中，無分層現象。當添加量添加量過高時，飲品質地不均勻，流動性差，無黏度，分層明顯，而當添加量添加量過低時，北蟲草飲品有苦味、香味不純。因此，選取麥芽糖醇和木糖醇添加量為5%、6%和7%進行后續響應面試驗。

2.1.4 檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的確定

檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉（1∶0.4）添加量對北蟲草飲品的甜度、酸度、感官評分的影響見圖4。

圖4 檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量對飲品的影響Fig.4 Effect of citric acid and sodium D-isoascorbate addition on beverages

由圖4 可知，檸檬酸和D-異抗壞血鈉的添加量到達0.25%時，北蟲草飲品的感官評分最高，在此條件下飲品呈淺黃色稍偏紅，無雜質、無分層現象，色澤均勻。當檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量高于0.25%時，北蟲草飲品有雜質產生；檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量低于0.25%時，飲品質地不均勻，流動性差，無黏度，分層明顯。因此，選取檸檬酸和D-異抗壞血鈉添加量為0.20%、0.25%和0.30%進行后續響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗基礎上，以A羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量、B北蟲草粉添加量、C麥芽糖醇和木糖醇添加量、D檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為自變量，以北蟲草飲品的感官評分Y作為衡量標準，進行響應面試驗，響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and result of response surface methodology

通過Design Expert 13.1.0 構建Box-Behnken 多元回歸模型，感官評分為響應值，擬合公式為Y=90.58+0.70A+2.00B-1.34C-0.31D-1.13AB-1.02AC-2.50AD-0.98BC+2.05BD+3.13CD-4.47A2-6.25B2-6.41C2-5.56D2。

擬合回歸方程結果分析見表4。

表4 擬合回歸方程結果分析Table 4 Result of fitting regression equation

由表4 可知，響應面模型的F值為41.06，P值小于0.000 1，說明響應面試驗的模型構建極為顯著，通過比較數據中各方差來源的F值可以得出，各因素對北蟲草飲品的感官評分影響由小到大順序為D＜A＜C＜B。失擬項F值為4.74、P值為0.073 5，說明響應面模型具有較高可靠性，響應面模型與純誤差二者之間關聯并不顯著，交互項BD、CD與二次項A2、B2、C2、D2均對北蟲草飲品感官評分產生極顯著影響，決定系數R2為0.976 2，校正系數R2Adj與預測系數R2pred差值＜0.2，說明試驗數據與真實數據有較高擬合度，也說明了試驗有97.62%符合數據模型。

兩兩因素交互作用對北蟲草飲品感官評價的影響見圖5。

圖5 兩兩因素交互作用對北蟲草飲品感官評分的影響Fig.5 Effect of two-factor interaction on sensory evaluation of Cordyceps militaris drink

響應面與等高線圖可以表征各因素之間的交互作用，橢圓形等高線表示兩因素之間的交互作用明顯，圓形則表示兩因素之間的交互作用不明顯[20-21]。由圖5可知，AC、AD、BC之間的響應面較為平緩，說明它們的交互作用對北蟲草飲品感官評分影響不顯著，擬合回歸方程結果分析與響應面所反映的各因素之間的交互作用結果一致。

2.3 驗證試驗

根據響應面試驗，得到北蟲草飲品最佳配方為羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%，北蟲草粉添加量為9%，麥芽糖醇和木糖醇添加量為6%，檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為0.25%，此時感官評分為91.4?；谲浖治雠c實際工藝的可行性，以羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%，北蟲草粉添加量為9.5%，麥芽糖醇和木糖醇添加量為6.4%，檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為0.25%為條件，進行3 次重復試驗，得出感官評分為91.5，與預測結果相近，證實基于該響應面模型分析優化北蟲草飲品工藝的方法有效可行。

2.4 品質分析

根據感官評分標準，以羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%，北蟲草粉添加量為9.5%，麥芽糖醇和木糖醇添加量為6.4%，檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為0.25% 為配方，制作北蟲草飲品并依據GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》進行分析，通過4 次平行試驗驗證，北蟲草飲品酵母≤8 CFU/g；酸價≤3 mg/g；過氧化值≤0.16；菌落總數≤18 CFU/g；大腸桿菌數≤1 CFU/g；霉菌數≤9 CFU/g，各項理化指標與微生物指標均符合國家安全質量標準的各項規定。

2.5 北蟲草飲品品質成分的PLS-DA 分析

北蟲草飲品品質成分的PLS-DA 得分圖、交叉驗證結果圖、變量投影重要值（variable important in projection，VIP）條形圖見圖6。

圖6 北蟲草飲品品質成分分析Fig.6 Analysis of quality components of Cordyceps militaris beverages

由圖6（a）可知，為獲得北蟲草飲品差異化合物，通過PLS-DA 分析北蟲草粉含量與飲品品質成分間的關系，旨在獲取對北蟲草飲品品質貢獻率較大的差異性化合物。其中最優配方羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%，北蟲草粉添加量為9.5%，麥芽糖醇和木糖醇添加量為6.4%，檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為0.25%。累計方差貢獻率=1.902＞0.8，其中自變量擬合指數R2X=0.907，因變量擬合指數R2Y=0.995，表明模型數據能夠解釋95% 的自變量與92%的因變量。由圖6（b）可知，交叉驗證次數為200 次，模型預測指數Q2=0.962，說明模型對北蟲草飲品的預測能力達到96.2%。VIP 值表示變量對模型的貢獻率，值越大貢獻越大[22]。由圖6（c）可知，蟲草素、蘇氨酸、甲硫氨酸等品質指標對北蟲草飲品的品質差異貢獻較大，通過控制差異性物質進行北蟲草飲品研制，對北蟲草飲品加工應用具有重要的現實意義。

3 結論

由擬合回歸方程結果分析可知，對北蟲草飲品感官評分的影響由小到大分別為檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量＜羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量＜麥芽糖醇和木糖醇添加量＜北蟲草粉添加量。北蟲草飲品的最佳配方為羧甲基纖維素鈉和六偏磷酸鈉添加量為0.04%，北蟲草粉添加量為9.5%，麥芽糖醇和木糖醇添加量為6.4%，檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量為0.25%。在此配方下制得的飲品感官評分為91.5，各項理化性質均符合飲品的質量和衛生指標，北蟲草飲品的差異性化合物主要有蟲草素、蘇氨酸、甲硫氨酸。北蟲草的利用目前主要集中在北蟲草茶、蟲草湯、蟲草酒等，利用其生產飲品的研究為北蟲草的深加工提供新的理論依據，也為北蟲草產業多樣性開發提供參考依據，北蟲草飲品具有廣闊市場前景。