溫度影響下Anammox-DAMO 系統N2O 產消機制及調控

韓夢茹,樓菊青,徐 帆(浙江工商大學環境科學與工程學院,浙江 杭州 310018)

反硝化厭氧甲烷氧化(DAMO)過程可以在厭氧條件下同步實現脫氮和CH4減排.該過程是一種獨特的反硝化反應,當硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體被還原為N2的同時, CH4作為唯一電子供體被氧化為CO2[1].研究表明,DAMO 過程對海洋沉積物中CH4的消耗減排占據了主導地位,且在濕地[2]、河流[3]、深水湖泊[4]等自然生境以及農業土壤和廢水中均存在,該過程在全球碳氮循環的過程中起關鍵作用.DAMO 微生物最早在淡水沉積物培養物中富集而得,起主導作用的功能微生物可以分為兩大類:NC10 門細菌的 Candidatus ‘Methylomirabilis oxyfera’(M. oxyfera)[5]和隸屬于 ANME(anaerobic methanotrophic archaea,厭氧甲烷氧化古菌)中的一個簇ANME-2d 的Candidatus ‘Methanoperedens nitroreducens’(M. nitroreducens)[6].其中,DAMO 古菌通常被認為只能將硝酸鹽(NO3-)還原為亞硝酸鹽(NO2-),因此需要與其他微生物協同作用以達到理想的脫氮效果.目前的研究表明,DAMO 古菌可以與DAMO 細菌協同進一步將NO2-還原為N2[7];同時,也已有研究發現在污水處理廠中DAMO 微生物與厭氧氨氧化(Anammox)細菌共存現象[8],因此可以共培養DAMO古菌與Anammox 細菌形成耦合系統,通過Anammox細菌進一步利用DAMO 古菌產生的NO2-作為電子受體?污水中的NH4+作為電子供體產生N2,從而實現總氮的高效去除和溫室氣體的減量排放[9].

將硝酸鹽型-DAMO與厭氧氨氧化聯合應用,能夠在兩類優勢菌種的協同作用下將各種形式的氮轉化為N2,同時實現總氮去除和CH4減排[10].然而,在對Anammox-DAMO 耦合系統的研究過程中檢測到了N2O,這說明并不是所有的氮都能轉化為N2被去除,而是在脫氮過程中生成了N2O 這一中間產物.迄今為止的研究結果沒有證據表明厭氧氨氧化細菌在正常代謝過程中會產生N2O[11-13].N2O 作為反硝化過程的中間產物,一般認為在DAMO 過程不會出現,這是因為DAMO 微生物的代謝途徑特殊,DAMO 細菌利用NO 歧化酶將NO 轉化為N2和O2,產生的O2再對CH4進行氧化,略過了中間體N2O的生成[14].雖然DAMO 微生物中存在編碼N2O 生成及降解的基因,但相關研究的實驗結果表明DAMO系統中有少量N2O 的產生,然而降解N2O 的基因卻未能表達[15].目前關于廢水處理過程中N2O 產生的研究大多集中在傳統反硝化工藝,鮮少有人將研究聚焦于DAMO、Anammox 等新型脫氮技術.

溫度變化會影響與N2O 產消相關的微生物及酶的活性,從而引起N2O 積累量的波動.有研究者利用A/O SBR 反應器探究N2O 隨溫度變化的產消情況,發現在15℃的低溫條件下N2O 排放量比25℃時增加了1.9 倍[16].Anammox 與DAMO 耦合脫氮過程中N 代謝途徑較為復雜,不同溫度影響下該系統N2O 的產消規律如何變化還有待探究.目前關于污水脫氮工藝中N2O 排放的研究多集中在中低溫條件,然而在某些特定的氣候條件下高溫也會顯著影響廢水處理效果.本文以Anammox-DAMO 系統為研究對象,探究中、高溫影響下該系統的性能與N2O產消變化規律,通過分子生物學手段及動力學機制探明N2O 產消的代謝途徑,并提出N2O 減排策略.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

批次試驗使用內徑7.0cm、高14.0cm,有效容積為250mL 的厭氧子反應器(圖1);連續試驗使用內徑16cm、高30cm、容積為3.5L 的厭氧母反應器[17].反應器所有取樣口均設有閥門,閥門關閉時,反應器呈全封閉狀態,維持反應器內厭氧狀態,整個反應過程中使用磁力攪拌器進行連續攪拌,保證反應器內泥水混合均勻.

圖1 試驗裝置Fig.1 Test device diagram

1.2 接種污泥與營養液

試驗系統為以Anammox 菌和DAMO 古菌為優勢菌種的Anammox-DAMO 系統,以西湖底泥?杭州西溪河底泥與農田水稻土壤的混合污泥為接種物,在厭氧條件下供給CH4?NO3-和 NH4+,試驗期間系統運行穩定.

營養液新鮮配制,使用前氮吹30min 以排除O2,組成如下:KH2PO40.05g/L;CaCl2·2H2O 0.3g/L;MgSO4·7H2O 0.2g/L;NaHCO31.05g/L;微量元素含量為1.25mL/L.微量元素包括(g/L):15 EDTA,0.43 ZnSO4·7H2O,0.24 CoCl2·6H2O,0.99 MnCl2·4H2O,0.25 CuSO4,0.22(NH4)6MoO24·4H2O,0.19 NiCl2·6H2O,0.067 SeO4,0.014 H3BO3, 0.05 Na2WO4·2H2O[18].營養液以去離子水為溶劑配制.

1.3 試驗方法

1.3.1 批次試驗 為了研究溫度對系統的短期影響,并建立溫度影響下N2O 產消動力學模型,進行為期10d 的批次試驗.從母反應器中各取 200mL 泥水混合液注入厭氧子反應器中,各子反應器的 NO3-和NH4+起始濃度為 20mg/L,CH4濃度為 80mg/L,pH=7.0,試驗溫度分別設置為20, 25, 30, 35, 40℃,每組設 3 個平行.試驗期間,每 24h 取氣樣3.0mL,水樣3.0mL,經 0.22μm 微孔濾膜過濾后測定NO3--N?NO2--N 及NH4+-N 濃度,同時監測系統中CH4含量以及N2O 濃度變化.

1.3.2 連續試驗 基于批次試驗結果,篩選出反應效率最優以及N2O 積累量最多的兩組具有代表性的溫度條件進行連續試驗,以揭示溫度對Anammox-DAMO 系統的長期影響.以DAMO 微生物倍增周期25d 為一個實驗周期進行3 個周期實驗,保持各系統pH 值為7.0～7.2.每48h 取各反應器水樣5.0mL,氣樣4.0mL,利用紫外分光光度計和氣相色譜儀分別測定NO3--N、NO2--N、NH4+-N、CH4、N2O的含量.以7d 為一個加藥周期,每7d 補充一次NO3-、NO2-、CH4.在試驗前中后期分別取泥水混合物30mL,熱提法提取EPS 提取液后測量含蛋白質(PNs)和多糖(PSs)的胞外聚合物(EPSs)的組成以及濃度變化.在連續試驗前、中、后期分別取5mL 污泥樣品進行高通量測序分析.

1.4 分析方法

NO3--N、NO2--N 和NH4+-N 濃度使用雙束紫外-可見分光光度計(TU1901)按照標準方法測量.使用氣相色譜儀(GC2030,島津)測量頂空N2O 含量以及CH4含量[19].采用pH 計(梅特勒FG2)監測反應器內pH 值的變化.采用熱提法分離EPS[20].PNs 和PSs的測定方法分別為福林酚試劑法和蒽酮法[21].通過Usearch 軟件和Gold 數據庫將剩余序列聚集到操作分類單元(OTU)中.利用E.Z.N.A. ?土壤DNA 試劑盒(Omega Bio-tek,美國)進行樣品DNA 抽提進行后續宏基因組測序.Illumina NovaSeq 測序平臺用于宏基因組測序[22].

1.5 動力學模型

采用酶動力學方程[23]模擬NO3-、NH4+的還原以及N2O 的產生和還原,如式(1)所示.

式中: RER為酶活性函數; Vmax,R為相應還原酶反應的最大比合成/活化速率,d-1; KE,i為酶誘導的半飽和常數,mg/L; KI,R為相應還原酶抑制系數,mg/L; Ci為底物的水相濃度,mg/L; R 為還原酶(即Nar、Nir、Nos); i 為相應底物(即NO3-、NH4+、N2O); CT為溫度變化因素.

2 結果與討論

2.1 溫度對Anammox-DAMO 系統性能及N2O 產消的影響

2.1.1 溫度對Anammox-DAMO 系統性能的影響根據厭氧氨氧化微生物和DAMO 微生物的最適生長溫度條件[24-25],選擇20～40℃進行短期試驗,對試驗結果進行單因素方差分析.從圖2 可見,NO3-、NH4+、CH4的降解速率均隨溫度的升高先增大后減小,而N2O 的濃度峰值整體呈現先下降后上升的趨勢.系統在溫度為40℃時,N2O 的濃度峰值達到最大.對溫度影響下的批次實驗結果進行單因素方差分析,發現40℃溫度條件對N2O 排放量的影響最大,另外對各環境因素進行正交實驗,結果顯示30℃為該系統脫氮性能最優的溫度條件,因此將30℃作為對照組,40℃作為實驗組進行長期試驗研究,以探明不同溫度條件下Anammox-DAMO 系統性能及N2O 產消規律.

圖2 短期試驗溫度對Anammox-DAMO 系統污染物降解及N2O 峰值影響Fig.2 Effect of temperature on contaminant degradation and peak concentration of N2O in the Anammox-DAMO system in a short-term test

圖3(a)和圖3(b)表明, Anammox-DAMO系統在40℃高溫條件下的脫氮性能要低于30℃,但隨著時間的推移,R2 系統的脫氮性能較前期有提升,這說明該體系可以逐漸適應高溫的脅迫,這主要歸因于微生物會在極端環境下產生特殊的蛋白質和酶來幫助細胞抵御脅迫.有研究表明[26],瞬時高溫沖擊會對Anammox 菌的活性產生抑制作用,但長期運行下系統的性能逐漸恢復,這說明Anammox 菌具有緩解高溫抑制的內部機制.R2 系統受到高溫的影響,在反應過程中出現了亞硝酸鹽的積累,平均積累濃度為(1.43±0.47) mg/L.從圖3(c)可知,R2 系統中的硝酸鹽、氨氮、CH4降解速率均低于R1 系統,說明高溫對系統中微生物活性產生了抑制作用,影響了其正常代謝.有研究表明,Anammox 活性(SAA)會隨著溫度的升高呈現先升高再降低的趨勢,溫度對Anammox 菌群蛋白質變化情況的影響也說明了Anammox 菌的活性在高溫下受到抑制[27].有研究探究了溫度對Anammox-DAMO 共培養系統的影響,結果表明溫度對耦合系統的影響同樣呈先上升后下降的趨勢,在高溫下微生物活性降低[28-30].

圖3 長期試驗溫度對Anammox-DAMO 系統中污染物降解影響Fig.3 Effect of temperature on contaminant degradation in the Anammox-DAMO system in a long-term test

在兩個系統的長期運行過程中均檢測到了硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)反應,DNRA 是一個特殊的生物反應過程,使用亞硝酸鹽作為中間物將硝酸鹽還原成銨[31-32].在R1 系統中,硝酸鹽降解速率為0.08mmol/(L·d),氨氮降解速率為 0.05mmol/(L·d),CH4降解速率為0.04mmol/(L·d),CH4降解速率與硝酸鹽降解速率實際比值(1:2.00)與DNRA 反應的理論比值(1:2.10)[33]相符,說明在R1 系統中同時存在DAMO、Anammmox、DNRA 反應.R2 系統中硝酸鹽降解速率為 0.06mmol/(L·d),氨氮降解速率為0.04mmol/(L·d),CH4降解速率為0.03mmol/(L·d),也觀察到了相同的結果,證明了DAMO、Anammmox、DNRA 反應的共存.

2.1.2 溫度對Anammox-DAMO 系統N2O 產消的影響 由圖4 可知,2 個系統均觀察到了明顯的N2O產消,且R2 系統中N2O 的總體累積量大于R1 系統,其中R1 系統 N2O 平均峰值濃度為(4.86±0.30)mg/L,R2 系統為(6.85±0.59) mg/L.

相比于R1 系統,R2 系統產生了更多的N2O,研究表明,在N-DAMO系統中,nrfA的轉錄水平隨亞硝酸鹽濃度的增加而顯著上調[34],推測在R2 系統中DAMO 古菌為了應對亞硝酸鹽的脅迫加劇了DNRA 反應的發生.在高濃度亞硝酸鹽影響下DNRA 過程會生成NO,出于對NO 的解毒作用,DNRA將NO轉化為N2O[34].Pereira[35]在研究操作條件對厭氧氨氧化系統N2O 產生的影響過程中發現亞硝酸鹽是N2O 生成和積累的關鍵,這主要歸因于AOB 中由細胞色素P460(CytL)催化的厭氧羥胺(NH2OH)解毒途徑[36].Ding 等[37]也發現N2O 釋放率與亞硝酸鹽濃度呈正相關,這是因為亞硝酸鹽和N2O 會競爭電子,當用于亞硝酸鹽還原的電子通量高于用于N2O 還原的電子通量時,N2O 就會積累.同時,在亞硝酸鹽和硝酸鹽共存的情況下,亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶之間對電子供體的競爭也可能導致N2O 的不完全還原[38].另外,由于受到高溫影響,Anammmox 細菌活性受到抑制,易造成中間產物NO 的積累,為了防止NO 對微生物造成毒害作用,Anammox 細菌將NO 轉化為N2O[39],因此在R2 系統中產生更多的N2O.

2.2 溫度對Anammox-DAMO 系統N2O 產消過程中EPS 的影響

2.2.1 溫度對Anammox-DAMO 系統EPS 變化的影響 EPS 是一種高分子量聚合物,主要由多糖(PS)和蛋白質(PN)組成,可用作保護層,以減弱惡劣環境對微生物的脅迫[40].此外,EPS 在微生物的生物膜形成??；头€定性中起重要作用[41].由圖5 可知,兩個系統中PN 含量的變化占主導地位,PS 含量整體變化幅度并不明顯,PN 含量隨著時間的推移先升高后降低,這是由于該體系在試驗前期需要通過增加PN含量來維持穩定性.與R1系統不同,在R2系統中,PN含量在中、后期都較初期有更大的增加幅度.

圖5 Anammox-DAMO 系統中EPS 含量變化Fig.5 Changes in EPS content in the Anammox-DAMO system

總體而言,R2 系統在中后期PN 和PS 的含量都高于R1系統,隨著溫度的增加,蛋白質和多糖溶解并從污泥中釋放出來.R2 系統中PN 的量要比R1 系統顯著高很多(P<0.05),這是由于高溫脅迫下導致R2系統產生更多的PN 以適應環境條件.在整個過程中,各組PN 均高于PS,這與其他研究相似[40,42].結果表明,R2系統中期的EPS與初期對比起來有所增加,PS含量穩定在4.9mg/L, PN 含量由6.6 增加到11.3mg/L,可見,相較于PS,高溫沖擊對PN 的影響程度更大,這主要歸因于微生物對惡劣環境的自我保護機制.作為影響細胞表面電荷和疏水性的一個因素,較高的PN 提高了Anammox-DAMO 系統中微生物的粘附性,并減輕了溫度沖擊對Anammox-DAMO 系統微生物的損傷[43].

R2 系統在高溫脅迫下產生更多的EPS,導致N2O 擴散進入細胞內部的傳質阻力增加,N2O 還原酶的作用時間縮短使得N2O 排放量升高,這與Sabba等[44]的研究結果一致.

2.2.2 溫度對Anammox-DAMO 系統可溶性蛋白影響 圖6(a)和6(b)為初期(0d)的三維熒光圖,發現發射峰位于300～350nm 處,激發峰位于250～300nm處,通過與其他研究中熒光組分的激發和發射最大值位置進行比較,該范圍內顯示熒光激發峰的物質為蛋白質[45-47],其中激發峰在250～340nm,發射峰在280～380nm 處主要包含物為酪氨酸和色氨酸[52].激發峰在220～340nm,發射峰在380～520nm 處主要包含物為腐殖酸[47-50].根據實驗結果可知初期實驗測得的主要物質是酪氨酸/色氨酸.

圖6 溫度對Anammox-DAMO 系統可溶性蛋白影響Fig.6 Effect of temperature on soluble proteins in the Anammox-DAMO system

從圖6(c)中可知,R1 系統三維熒光發射峰位于300～400nm 處,激發峰位于250～350nm 處,主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖.圖6(d)顯示R2 系統三維熒光發射峰位于300～450nm 處,激發峰位于200～350nm 處,主要物質為酪氨酸/色氨酸、微生物代謝物、多糖以及富里酸.由圖中可得出EPS 中蛋白質的熒光強度明顯大于多糖?腐殖酸,說明系統中微生物更多的產生蛋白質來適應溫度變化對其影響.且R2 系統中期的熒光信號要明顯強于初期,并且強于同時期的R1 系統的熒光信號,表明高溫會對反應器中的微生物活動產生影響,從而干擾有機物的分泌,產生更多的酪氨酸/色氨酸.有研究表明色氨酸類和酪氨酸類蛋白質物質與N2O 的排放量呈顯著正相關關系[51-52],因此R2 系統中更高的N2O 產生量可歸因于更多酪氨酸/色氨酸的生成.

從圖6(e)可知R1 系統三維熒光發射峰位于300～400nm 處,激發峰位于200～350nm 處,主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖.圖6(f)顯示R2 系統三維熒光發射峰位于300～400nm 處,激發峰位于250～350nm 處,主要物質為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物?多糖.R2 系統末期的熒光信號與中期相比逐漸減弱,逐漸恢復到初期水平,并與R1 系統的熒光信號無顯著性差異,表明R2 中的微生物逐漸適應高溫環境,這與系統性能的惡化與恢復趨勢一致.

2.3 溫度影響下Anammox-DAMO 系統N2O 產消的生物學機制

2.3.1 溫度對Anammox-DAMO 系統微生物群落變化的影響 如圖7(a)所示,R1 和R2 的優勢菌門均為Proteobacteria,且分別占比33%和40%,它是厭氧氨氧化系統常見的一大門類,且有研究表明Proteobacteria 大多數是反硝化細菌, 并且Proteobacteria 中的大部分菌可以參與甲烷氧化過程,普遍存在于污水處理廠脫氮除磷工藝中[53].第二優勢菌門是Chloroflexi,分別占比14%和17%,它的作用是在細胞生長過程中降解有機分子或分泌可溶性化合物.在溫度的影響下,R2 系統中的Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidetes 和Euryarchaeota 等嗜熱微生物豐度上升.相反在高溫脅迫下Actinobacteria和Ignavibacteriae 的豐度相比R1 有所下降,說明高溫環境不利于其生存.

圖7 微生物相對豐度分布Fig.7 Relative abundance distribution of microorganisms

圖7(b)顯示2 個系統中均發現了芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonad)、食酸菌屬(Acidovorax)、陶厄氏菌屬(Thauera)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、Methanoperedens nitroreducens、叢毛單胞菌屬(Comamonadaceae)、特呂珀菌屬(Truepera) 、 Kuenenia 、 甲 烷 微 菌 屬(Methylomicrobium).Acidovorax 是常見的反硝化菌,Thauera 是自養型反硝化細菌[54-56],相比于R1 系統,這兩種菌屬豐度在R2 系統中均有所下降,表明高溫環境會抑制其生長.Tanikawa 等[57]認為Acidovorax和Thauera 是反硝化過程中主要的N2O 還原劑,Zhao等[58]在Thauera 中檢測到了大部分N2O 還原酶編碼基因,證明了Thauera 在N2O 還原過程中的巨大貢獻,R2系統中Thauera豐度的下降是N2O積累量更多的原因.另外,有研究證明Bacillus 可能在N2O 排放方面發揮巨大作用[34],本文在R2 系統中檢測到了該屬更高的豐度,這也是導致N2O 排放量更高的重要原因.Methylomonas 中存在亞硝酸鹽還原酶,其在R2 系統中的豐度明顯低于R1 系統,導致R2 系統亞硝酸鹽大量積累.Methanoperedens nitroreducens 已知為進行硝酸鹽驅動的厭氧甲烷氧化的n-DAMO 古菌,在R1系統中的占比為23.22%,在R2 系統中的占比為16.40%,由此可見高溫抑制了DAMO 古菌的生長,造成脫氮速率下降.Ca.Kuenenia 和Ca. Brocadia 與脫氮直接相關,是常見的Anammox 細菌,在R1 系統中兩者的占比分別為17.64%和12.47%,在R2 系統中兩者的占比分別為19.01%和16.65%,可以看出Anammox兩個菌屬在R2 中占比升高.這可能是因為DNRA 反應產生的銨促進了Anammox 微生物的生長.在兩個系統中均未檢測到能夠進行DNRA 反應的典型微生物,因此推測DAMO 古菌利用甲烷厭氧氧化產生的電子發生了DNRA 反應.

2.3.2 溫度對Anammox-DAMO 系統微生物功能基因豐度變化影響 反硝化過程主要由4 種酶催化,即硝酸鹽還原酶(narGHI/napAB)、亞硝酸鹽還原酶(nirK/nirS)、NO 還原酶(norBC)和 N2O 還原酶(nosZ).nrfA 是DNRA 的分子標志物[59],由圖8 可見,其在R2 系統中相對豐度較高,對高溫條件表現出明顯的偏好性,Lai 等[60]將溫度從10℃提升到40℃時,nrfA 基因豐度增加,DNRA 反應過程增強,說明DNRA 反應與nrfA 基因豐度呈顯著正相關.對于硝酸還原酶基因,相較于R1 系統,R2 系統中的napAB轉錄明顯上調,顯示了對DNRA 的主要貢獻(硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽),然而narGHI 的表達水平與R1系統幾乎一致,表明對部分DNRA 的貢獻較小.對于亞硝酸還原酶基因,nirSK 在R2 系統中的相對豐度低于R1 系統,減弱了R2 系統對亞硝酸鹽還原能力進而導致亞硝酸鹽積累,這主要歸因于高溫會顯著降低nirK 基因的豐度[61].另外,在R2 系統中,NO 還原酶基因(norB)相對豐度更高,而N2O 還原酶基因(nosZ)相對豐度較低,說明高溫條件抑制了nosZ 酶的生成,進而阻礙了N2O 被還原.hdh 和hzs 是參與Anammox 反應的酶,其中hzs 在R2 中的相對豐度高于R1 系統,且與nrfA 的變化呈正相關關系,表明DNRA 反應產生的銨為Anammox 提供了底物,從而促進Anammox 過程的發生.

圖8 不同溫度下氮代謝和碳代謝功能基因豐度Fig.8 Nitrogen and carbon metabolism functional gene abundance at different temperatures

在R2 系統中,Anammox 基因豐度高,但脫氮性能卻比R1 差.這種現象可以通過不利的溫度和FNA對轉錄、翻譯和酶活性的抑制來解釋[62].以亞硝酸鹽還原酶與N2O 還原酶的比值(Σnir/nos)作為N2O 產生潛力的指標,其中Σnir/nos是由nir基因(nirS+ nirK)之和除以nos 基因測定的[63].結果表明R2 系統中Σnir/nosZ(1.95)高于R1 系統(1.49),說明Anammox-DAMO 系統在高溫脅迫下更易積累N2O.

2.4 溫度影響下Anammox-DAMO 系統動力學機制及N2O 減排調控策略

2.4.1 溫度影響下Anammox-DAMO 系統動力學機制 如圖9 及表1、2、3 所示, NO3-、NH4+和N2O 酶動力學方程中Vmax均隨著溫度的升高先增大后減小,在35℃時最大,40℃時最小,意味著硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O 還原酶均在 35℃時擁有最大比合成/活化速率,酶活性最強.KI,R為對應還原酶的抑制系數,3 種酶動力學方程的 KI,R隨溫度的升高先降低后升高,同樣在35 ℃時最大, 40℃時最小,表明35℃的溫度條件對3 種酶的抑制作用最小. 3 種酶動力學方程的半飽和常數KE,i隨著溫度的升高先減少后增加,在35℃時最小, 40℃時最大.

表1 不同溫度下NO3-降解酶動力學參數Table 1 Kinetic parameters of NO3- degrading enzymes at different temperatures

表2 不同溫度下NH4+降解酶動力學參數Table 2 Kinetic parameters of NH4+ degrading enzymes at different temperatures

表3 不同溫度下N2O 消耗酶動力學參數Table 3 Kinetic parameters of N2O consuming enzymes at different temperatures

圖9 酶動力學擬合曲線Fig.9 Enzyme kinetics fitting curve

硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O 還原酶的活性均隨著溫度的升高呈現先增強后減弱的趨勢,且在35℃時活性達到最大,意味著在此溫度下Anammox-DAMO 系統的脫氮性能最好,N2O 還原效果最好,能夠實現最大程度減少N2O 排放量.低于或高于35℃的溫度條件都會對酶的活性產生不利影響,造成系統性能的惡化以及N2O 的積累,擬合結果印證了短期試驗結果.Hu 等[16]利用實驗室規模的缺氧/好氧間歇式反應器探究了溫度對N2O 排放的影響,結果表明在10～35℃的溫度條件下,N2O 排放量隨溫度的升高而降低,該系統主要是通過溫度變化影響硝化和反硝化的總體過程速率來影響N2O 的排放,本研究在該溫度范圍的基礎上繼續擴大溫度范圍,發現在20～40℃的范圍內,系統在35℃時出現N2O 排放低谷.此外,Qian 等[64]在TDD-Anammox 耦合工藝中發現35 ℃時系統 N2O 排放量最少,這主要歸因于Anammox 微生物(其特征是不產生N2O)在此溫度下發揮最大作用,而本研究酶動力學擬合結果證明了參與Anammox 過程的亞硝酸鹽還原酶在35℃下活性最大,與其實驗結果相符.

綜上所述,動力學模型可以很好地預測系統在不同溫度下N2O 排放情況,根據酶動力學擬合結果推測出N2O 排放量最少的溫度條件為35℃,在此溫度下該系統可以最大程度地實現N2O 減排.

2.4.2 Anammox-DAMO 系統代謝途徑及N2O 調控策略 根據檢測到的功能菌和基因,通過比對KEGG 數據庫的注釋對溫度影響下 Anammox-DAMO 系統特殊氮代謝途徑進行分析(圖10).

圖10 Anammox-DAMO 系統特殊氮代謝途徑Fig.10 Special nitrogen metabolism pathways in the Anammox-DAMO system

在Anammox-DAMO 系統中,除已被證實的Anammox-DAMO 氮代謝基因,還檢測到了與DNRA 反應相關的nrfA 基因,且在高溫脅迫下其豐度顯著增加.研究表明DAMO 古菌有編碼nrfA 的基因,因此具有發生DNRA 反應的潛力.高溫抑制了Anammox-DAMO 系統中nir 酶的活性,造成亞硝酸鹽積累,基于nrfA 的解毒機制,此時nrfA 會將NO2-還原為NO,nrfA 與活性位點血紅素c 基團A 結合的晶體結構將NO 轉化為N2O[65].在本研究中還檢測到了與N2O 產消相關的norB、norC 和nosZ 基因.有研究表明,Anammox 細菌會生成中間產物NO,norB 和norC 基因可能會對外部亞硝化應激做出快速反應,為了將NO 維持在毒性水平以下會把NO 轉化為N2O[39].高溫影響下,Anammox 細菌產生的NO 促進了norBC 基因豐度增加,進而將更多的NO 轉化為N2O.與此同時,Anammox-DAMO 系統中的nosZ 基因豐度降低,說明高溫抑制了N2O 還原酶的生成,導致無法及時將產生的N2O 還原,造成N2O 凈排放量升高.綜上所述,N2O 產生和消耗途徑可作如下解釋: Anammox-DAMO 系統中檢測到的N2O 由DNRA 反應及Anammox 細菌對NO 解毒作用產生,而N2O 的消耗大部分由編碼nosZ 基因的微生物完成.

基于Anammox-DAMO 系統中N2O 特殊的產消代謝途徑,本研究發現高濃度亞硝酸鹽脅迫是導致Anammox-DAMO 系統N2O 積累的主要原因.高溫通過影響系統氮代謝過程中的關鍵功能基因酶的活性,導致亞硝酸鹽濃度升高,進而觸發DNRA 反應及Anammox 細菌的解毒作用.反硝化過程中4 個還原步驟之間的電子競爭以及不同還原酶的活性決定了N2O 的積累程度,本研究中,對系統性能不利的高溫條件會顯著降低N2O 還原酶的活性,導致N2O 的凈排放量升高.因此,盡可能控制系統在運行過程中維持在中溫條件,豐富具有較強N2O 還原能力的微生物群,可以促進N2O 的還原.在后續研究中,還需要優化pH 值、C/N、DO、FNA 等其他操作條件,避免運行過程中亞硝酸鹽的積累,并研究不同操作條件下N2O 還原酶的活性,以最大限度地減少廢水處理中N2O 的產生.

3 結論

3.1 高溫顯著降低了Anammox-DAMO 系統的脫氮性能,且在高溫脅迫下系統中亞硝酸鹽積累進而導致N2O 的凈排放量升高,根據甲烷與硝酸鹽降解速率比值可知該系統在長期運行過程中還存在DNRA 反應.

3.2 Anammox-DAMO 系統中微生物在高溫脅迫下產生更多的蛋白質以緩解惡劣環境造成的損傷,三維熒光光譜結果顯示其主要為色氨酸類和酪氨酸類蛋白質物質,該類物質的分泌與N2O 的排放量呈顯著正相關.

3.3 高通量測序結果表明,在高溫影響下系統中與N2O 還原相關的Acidovorax 和Thauera 屬豐度降低,而與N2O 產生相關的Bacillus 屬豐度則上升.宏基因測序結果表明高溫降低了nirSK 豐度,造成亞硝酸鹽積累,此外在高溫條件下norB 豐度增加而nosZ 豐度減少,加速了N2O 生成的同時抑制了其還原,導致N2O 積累.

3.4 在不同溫度下對Anammox-DAMO 系統進行酶動力學擬合,發現低溫和高溫均會增加N2O 的凈排放量,而在35℃時可以最大程度地實現N2O 減排.