農田土壤中鄰苯二甲酸酯降解功能細菌及其應用

李鵬飛,周 賢,王 建,高彥征(南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類具有內分泌干擾特性的環境雌激素,即便在極低的濃度下也會干擾人和動物的內分泌系統,從而影響有機體的繁殖、新陳代謝、成長等生物過程,并產生致突變、致畸和致癌等效應[1].為了有效保護生態環境和人類健康,美國環保署和歐盟已將 DMP、DEP、DnOP、DBP、DEHP、BBP 列入優先控制污染物.2018 年,我國生態環境部頒布的《土壤環境質量建設用地土壤污染風險管控標準(試行)》已經將DnBP、DEHP、DnOP 作為優先污染物列入控制名單.我國農田土壤中PAEs 主要來源于農用地膜、肥料、污泥農用、污水灌溉等,由于PAEs 具有較高的辛醇-水分配系數,進入土壤后容易吸附于土壤顆粒物上,從而導致農田土壤污染[2].更為嚴重的是,土壤中的PAEs 可以通過土壤-作物系統進入食物鏈,從而威脅人類健康和生態系統安全[3].因此,了解全國范圍內農田土壤PAEs 污染現狀,對于制定農田土壤PAEs 污染標準、研發污染控制技術等具有重要意義.

在長期受PAEs 污染的農田土壤中存在大量具有PAEs 降解能力的功能細菌[4].目前,科研工作者已從污染農田土壤中分離獲得大量具有PAEs高效降解能力的功能細菌,在其降解廣譜性、代謝途徑及關鍵功能基因等方面開展了深入研究.研究表明,將分離獲得功能細菌直接應用施入土壤中可有效降低土壤中PAEs 的含量.本文綜述了我國農田土壤PAEs 污染現狀,主要總結細菌降解PAEs 的途徑、機制及應用等,以期為我國PAEs 污染農田土壤功能細菌修復及農業生產安全提供理論和技術參考.

1 PAEs 的基本性質及污染現狀

環境中的PAEs 可通大氣干濕沉降、污水灌溉等途徑進入農田土壤.此外,污泥農用、化肥、農膜等使得農田土壤成為環境中PAEs 主要的匯.其中,農膜的使用是造成我國農田土壤大面積PAEs 污染的主要原因[5].表1 列舉了目前已報道的常見PAEs 化學信息和物化性質參數.當前,我國農田土壤中PAEs 的濃度一般在幾個μg/kg到幾十個mg/kg 之間.農田土壤PAEs污染已對我國農田土壤環境及農產品質量安全產生了一定威脅[7].我國農田土壤中PAEs 含量普遍高于其他國家.調查顯示,丹麥農田土壤中PAEs 的濃度范圍為14～2500μg/kg[8].研究人員發現英國農田土壤中Σ6PAEs 含量最高僅為99μg/kg[9].

表1 PAEs 及代表性物質的化學信息和物化性質參數[6]Table 1 Chemical information and physicochemical property parameters of PAEs and representative substances[6]

由表2 可以看出,我國各地農田土壤都不同程度的受到了PAEs 污染,而不同的區域、省份農業土壤中PAEs 濃度存在著較大的差異,如天津市菜地土壤中∑6PAEs 總含量為0.050～10.40mg/kg,而廣州市菜地土壤中Σ6PAEs 總含量最高僅為1.140mg/kg;其中,寧夏菜地土壤、貴州煙草地土壤和新疆棉田土壤中Σ6PAEs 的總含量遠超于其他地區.由此可見,我國大部分地區農田土壤中均能檢測出PAEs,含量水平不一,對人體存在健康隱患.李玉雙等[10]選取了沈陽市蔬菜基地的農田土壤為研究對象,分析了采集土壤樣品中PAEs 含量和類型,結果發現約30%的樣品中PAEs 的總含量超過1mg/kg, DBP和DEHP 在所有的樣品中均被檢測出,是當地農田土壤中主要的污染物. Kong 等[12]選取了天津市郊區不同農用類型的土壤為研究對象,分析了6 種PAEs 分布情況.結果表明:菜地土壤中PAEs 含量最高,可達到10mg/kg.DBP 和DEHP 是我國農田土壤中檢出率和濃度最高的兩種PAEs 單體化合物.不同農田用地類型中PAEs 含量存在一定差異,菜地土壤中的PAEs 含量通常高于稻田和果園地,其差異性可能源于城市化水平、農膜的使用和污水灌溉等[29].Feng 等[15]分析了江蘇省蔬菜樣品中PAEs 的含量,結果發現,蔬菜樣品中PAEs 單體以DEHP 和DnOP 為主,這可能與農田土壤中PAEs 的含量有關.另外,DEHP 和DnOP 的分子結構相對復雜,在水中的溶解度較低,且不易揮發,較難被微生物降解,同時其在作物體內難以被代謝分解,呈現出明顯的富集特征.當前,我國大多數農田土壤中PAEs 的人群健康致癌風險和非致癌風險均低于健康風險規定的可接受上限,整體而言處于相對安全狀態[30-31].但也有研究表明,我國某些地區部分農田土壤DEHP 殘留濃度較高(最高可達25.05mg/kg),存在較高的致癌風險[32-33].由于我國尚未制定農田土壤PAEs 控制標準,參照美國土壤PAEs 化合物控制標準,我國農田土壤DBP 含量的平均值全部超標.因此我國亟需制定農田土壤PAEs 污染控制標準,以保障農業生產安全和人類健 康.

表2 國內部分地區農田土壤中PAEs 污染現狀(mg/kg)Table 2 Concentration PAEs in the agriculture soil of different regions in China(mg/kg)

2 PAEs 的降解

2.1 PAEs 降解細菌

PAEs 在自然界中難以水解和光解,微生物是其自然消減的主要途徑.研究表明,PAEs 污染農田土壤中存在大量經自然馴化具有PAEs 降解能力的微生物[34],其中細菌被認為是PAEs 自然降解的主要微生物.當前國內科研工作者關于PAEs 降解細菌主要開展了PAEs 高效降解菌株富集、篩選與鑒定;PAEs降解功能菌群構建;細菌降解PAEs 的途徑及機制等方面的研究.

自1975 年Engelhardt 等[35]首次報道PAEs 降解功能微生物以來,科研工作者已從不同環境介質中分離純化獲得大量具有PAEs 降解功能的菌株(表3).目前,研究純化獲得的菌株主要來源于以下菌屬,如鞘氨醇單胞菌(Sphingobium) 、 假單胞菌(Pseudomonas)、節桿菌(Arthrobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、甲基桿菌屬(Methylobacillus)、紅球菌(Rhodococcus)、戈登氏菌(Gordonia)、伯克氏菌(Burkholderia)等.從表3 可以看出,不同降解菌屬對 PAEs 表現出不同的降解效果和降解譜.Tao等[43]從土壤中分離到一株具有PAEs 高效降解能力的假單胞菌屬菌株DNE-S1,該菌株能在堿性條件下降解DEP,并發現Fe3+可以通過表達鄰苯二甲酸二氫二醇脫氫酶(ophB)和鄰苯二甲酸二氧合酶-鐵氧還蛋白還原酶(ophA4)基因來促進DNE-S1對DEP 的降解.Fe3+的存在使DEP(500mg/L,12h)的降解率提高了14.5%. Zhao 等[50]從農田土壤中分離出一株能夠以多種PAEs 為底物的降解細菌農霉菌MT-O,該菌株在pH 值為7.2,溫度為29.6℃和接種量為OD600=0.2 的條件下,7d 內可將初始濃度200mg/L 的DEHP 幾乎完全降解.目前關于PAEs 降解細菌的研究多在高底物濃度下開展,而實際污染農田土壤中PAEs 含量較低,因此,將來應重點關注低濃度PAEs 條件下細菌降解能力的研究,進而利用純化獲得PAEs 降解菌株用于污染農田土壤修復.

表3 PAEs 降解細菌及其降解效果Table 3 PAEs-degrading bacteria strains and their effects

2.2 PAEs 降解菌群

當前,分離篩選的功能細菌主要是對一種或少數幾種PAEs 具有降解能力,而在實際污染環境中往往是多種PAEs 共存,且實際污染環境條件較為苛刻、土著群菌競爭力較強,單一菌株降解土壤中PAEs 仍存在很大的局限性.降解細菌在自然環境中往往以菌群形式存在,利用不同細菌之間的協同作用來完全降解環境中的有機污染物,為自身生長繁殖提供能量.于是,科研工作者嘗試利用功能菌群中不同菌株的協同互作實現PAEs 的廣譜和高效降解.

如表4 所示,目前已報道的PAEs 降解菌群主要分為兩種:一種是直接從受污染的環境中富集培養得到的.例如,Kou 等[53]從長期覆蓋地膜的農田土壤中分離出一組由Comamonadaceae sp.、Achromobacter sp.和Pseudomonas sp.組成的細菌菌群K1.在最優條件下,K1 對DEHP 的降解率可達99%以上,并發現K1可以快速礦化DEHP、DMP、DEP 及其代謝中間體,從而實現環境中常見PAEs的無害化處理.此外,K1具有廣泛的環境適應力,在PAEs 污染的復雜環境中具有巨大的潛力和優勢.而另一種是由兩種或者兩種以上的PAEs降解菌株人工構建而成.Wu等[57]從活性污泥中分離的Gordonia sp.菌株JDC-2 和Arthrobacter sp.菌株JDC-32 可以通過微生物的生化協同作用完全降解DOP,其中菌株JDC-2 可以將DOP 快速的降解為PA,但卻無法進一步利用PA;而菌株JDC-32 可以降解PA,但不能降解DOP.而通過將JDC-2 和JDC-32 共培養,有效克服了各自單獨降解DOP 的限制,實現了DOP 的降解.Lu 等[58]采用富集法分離了獲得一組由Microbacterium sp. PAE-1 和Pandoraea sp.PAE-2 組成的菌群,該菌群可以通過生化合作完全降解DBP.并從PAE-1 菌株中克隆出兩個酯酶基因DpeH 和MpeH,其中DpeH 只能將二烷基PAEs 水解為相應的單烷基PAEs,單烷基PAEs 再被MpeH 水解為PA;而PAE-2 菌株主要負責PA 的降解.顯然,與單一菌降解相比,復合菌群可以在一定程度上克服單一菌降解不徹底和降解譜窄等問題.因此,構建更多有效的復合菌群,有望實現污染農業土壤中PAEs 的經濟高效去除,具有較為廣闊的應用前景.

表4 PAEs 降解復合菌群Table 4 Bacterical consortia for PAEs biodegradation

2.3 PAEs 降解途徑

目前,單一菌降解PAEs 的降解途徑已經比較完善.如圖1 和圖2 所示,細菌降解PAEs 主要分為兩個階段:第一階段是PAEs 的水解,將PAEs 轉化為中間產物PA;第二階段是PA 的開環裂解,最終降解成小分子物質[62].在PAEs 降解的第一階段中,主要方式有去酯化和 β-氧化,其中去酯化為主要途徑.PAEs 先經過多次去酯化反應轉化為鄰苯二甲酸單酯(MAPs),再進一步生成PA.而β-氧化途徑是先經過多次氧化,將PAEs 氧化為鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)和鄰苯二甲酸二甲酯(DMP),隨后又經過去酯化途徑,將其水解為PA.

圖1 鄰苯二甲酸酯的水解途徑[62]Fig.1 Hydrolysis pathway of phthalates[62]

圖2 鄰苯二甲酸的好氧降解途徑[62]Fig.2 Aerobic degradation pathway of phthalic acid[62]

PA 是PAEs 降解過程中的重要代謝產物之一.由于G+菌(革蘭氏陽性菌)和G-菌(革蘭氏陰性菌)的降解酶基因不同,所以PA 降解途徑也存在著差異[63].對于G+菌而言,首先,鄰苯二甲酸經過鄰苯二甲酸3,4 雙加氧酶的氧化,生成了順式-3,4-二羥基-3,4-二氫鄰苯二甲酸,隨后經過脫氫作用,進一步得到4,5-二羥基鄰苯二甲酸,接著再通過脫羧生成PCA.而G-菌則是在鄰苯二甲酸的4、5 號位碳上發生氧化反應和脫氫反應生成4,5-二羥基鄰苯二甲酸,最后再通過脫羧形成PCA.而PCA 又存在兩種不同的開環途徑,分別為正位開環途徑和偏位開環途徑.經正位開環途徑,PCA依次被轉化為3-羧基-順,順粘康酸和3-己二酸酮酯,又經過β-酮己二酸途徑轉化為琥珀酸和乙酰輔酶A,從而進入三羧酸循環.在偏位開環途徑中,PCA 卻在4,5 雙加氧酶的作用下,依次被降解成4-羧基-2-羥基粘琥珀酸半醛和2-羥基-4-羧基粘琥珀酸半縮醛,隨后經過多次酶促反應,最終生成草酰乙酸和丙酮酸,分別進入三羧酸循環和糖酵解途徑.

2.4 PAEs 降解基因和酶

與此同時,眾多學者對PAEs 降解的遺傳機制也開始進一步研究,這些研究主要集中在對參與PAEs 水解酶的研究和從PA 到PCA 降解的酶基因進行克隆和鑒定.Xu 等[64]分離了一株枯草芽孢桿菌BJQ0005,對其進行基因組測序,發現共表達了 18 種水解酶.其中酶 GTW28-09400 和酶GTW28-13725 實現了PAEs 單酯鍵的水解,而酶GTW28-17760 能夠破壞DBP 和DEHP 的二酯鍵,說明它是一種二酯鍵水解酶.從Rhodococcus sp.LW-XY12 中克隆獲得的水解酶KXC42-04905,該酶可以有效降解DEHP 和MEHP(鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯);水解酶KXC42-04905 可以通過氫鍵和疏水相互作用與DEHP 和MEHP 結合,酶中的一個催化三聯體(Ser195-Glu319-His412)可能作為一個活性蛋白口袋,從而催化DEHP 的水解[65].

對于鄰苯二甲酸到原兒茶酚降解的途徑,由于細菌的降解酶不同,所以G+菌和G-菌的PA 降解途徑也存在著差異.在G+菌中編碼的是3,4-二羥基鄰苯二甲酸的脫氫酶和脫酸酶,而在G-菌中編碼的是4,5-羥基鄰苯二甲酸的脫氫酶和脫酸酶.目前已經報道的 G+菌中負責降解 PA 的降解基因見表5.Eaton 等[66]率先報道了PA 降解基因簇是來源于G+菌 Arthrobacter keyseri 12B 的 pht 操縱子(phtBAaAbAcAdCR),并在A. keyseri 12B 中,克隆出了一個130kb 的質粒編碼鄰苯二甲酸的完全代謝,確定了pht 操縱子負責編碼PA 到PCA 轉化,pcm 操縱子編碼從PCA 到丙酮酸和草酰乙酸的代謝,pehA基因編碼PAEs 水解酶,tnpR 基因編碼轉座子解離酶,ptr 操縱子可能編碼PA 或PCA 或PAEs 的轉運蛋 白.

表5 已報道的革蘭氏陽性菌中PA 的降解基因Table 5 Reported degradation genes for PA in gram-positive bacteria

由于降解酶不同,因此編碼的基因也存在差異,表6 列出了目前已經報道的革蘭氏陽性菌中負責降解PA 的降解基因.Chang 等[72]率先發現了DBO1 中參與從PA 到PCA 的基因,其中ophA1 和ophA2 可能共同編碼PA雙加氧酶還原酶,ophD負責編碼4,5-二羥基鄰苯二甲酸脫羧酶,ophB 負責編碼PA 二氫二醇脫氫酶.Wang 等[44]通過基因組測序技術,在DNHP-S2 菌株的染色體上發現了一個完整的PCA分解代謝基因簇,由8 個基因(pcaBLIJCHG-fadA)和4 個調節基因(IclR-LysR-GntR-LysR)組成.并發現該菌株能以PCA 為唯一碳源時高效生長,這表明該菌株可能無法通過先前表征的鄰苯二甲酸酯雙加氧酶系統將PA 轉化為PCA,但它卻可以完全降解PCA.因此,推測可能存在其他途徑利用PA,或者PA可以通過脫羧生成BA(鄰苯二甲酸酐).隨后又發現該菌株攜帶了CoA 轉移酶基因,與其他已報道的CoA 轉移酶同源性為49.03%～75.04%,與PA 脫羧成BA 一致.因此,該基因簇編碼的MFS 轉運蛋白可能負責介導BA 的轉運.

表6 已報道的革蘭氏陰性菌中PA 的降解基因Table 6 Reported degradation genes for PA in gram-negative bacteria

2.5 PAEs 降解菌在污染土壤修復中的應用

隨著研究的不斷深入,科研工作者驗證了功能微生物對治理PAEs 污染土壤的效能. Wang 等[46]從長期受PAEs 污染菜地土壤中富集分離獲得一株具有DEHP 高效降解功能的紅球菌屬細菌WJ4,將菌懸液濃度為0.8 的WJ4 加入到DEHP 污染濃度為1.0g/kg 的土壤中,置于28℃黑暗條件下培養21d,處理結束后土壤中DEHP 去除率高達55%,而對照土壤中DEHP 的去除率僅為4.2%.趙真真[62]從污水處理廠中篩選出了兩株可以降解PAEs 的菌株,分別為Microbacterium panaciterrae USTB-Y和Comamonas guangdongensis USTBZA1,將其復配構建為復合菌群USTB-YA,將該菌群接種至初始濃度為50mg/kg 的DBP 污染土壤中,研究了菌群對DBP的消減效能.結果表明:在滅菌處理組中,接種復合菌群YA 的土壤樣品中的DBP 在24 和48 內分別降低了49.1%和89.5%,而在未接菌處理中僅為2.5%和6.0%,其降解率分別提高了46.6%和83.5%.總體而言,當前從土壤中馴化的菌株或復配構建的菌群在實際污染土壤修復中具有較大應用潛力.然而,令人遺憾的是,當前大多數研究僅停留于實驗室模擬階段,功能細菌在實際污染農田土壤治理中的應用效能仍不明確,尚存在著較多的限制因素.例如,營養物質作為微生物生長必不可少的重要因素,在利用微生物修復污染農田土壤過程中,雖然部分污染物可被微生物利用,但仍然無法滿足微生物的生長繁殖所需的所有能量,從而影響菌株的繁殖和存活.此外,在純培養條件下復合菌群的菌株之間可以相互協作,但實際污染農田土壤中土著微生物競爭力較強,對添加的外源菌群穩定性影響較大,甚至因與土著微生物競爭處于劣勢而被淘汰.因此,如何將有效提高功能微生物與土著菌群的競爭力,促進外源菌群與土著菌群之間的相互協作,進而提高功能微生物原位修復效能,是科研工作者將來亟需的瓶頸問題.

3 總結與展望

總結了農田土壤中PAEs 污染現狀、降解功能細菌及其應用.從PAEs 污染農田土壤中富集篩選的降解細菌具有不同的降解特征,細菌降解PAEs 首先進行水解產生中間產物PA,然后將PA 開環裂解,最終降解成小分子物質.與單一功能菌株相比,自然馴化或人工構建的功能菌群具有PAEs 降解高效性、廣譜性和競爭能力,在實際污染農田土壤修復中具有廣闊的應用前景.將來需要在以下幾個方面開展相關研究.

(1)現階段關于PAEs 降解細菌的研究主要集中于實驗室,很少應用于實際農田土壤的降解.考慮到農田土壤環境的復雜性,PAEs 降解菌在實際農田土壤修復中應用還需要進一步驗證.

(2)復合菌群是利用細菌降解PAEs 的研究熱點之一.將來可借助高通量測序、穩定同位素示蹤、環境宏基因組學、宏轉錄組學等現代分子生物學技術手段,明確菌群中不同菌株間協同互作的機制,進而篩選構建具有PAEs 降解靶向性和高效性的菌群,實現復合菌群在實際污染農田土壤修復中的應用.

(3)因此,在今后的研究中,需要微生物學家、生物地球化學家、農學家、土壤學家和建模者進行緊密的跨學科合作,從環境適應性、降解酶、降解基因和菌株協同共生等角度繼續深入研究,并結合工程學、高通量測序和基因組學等方法,建立合適的定量模型,構建具有環境適應性強、降解譜廣、降解能力的強的功能菌群.總之,利用功能細菌削減農田土壤PAEs 污染是一種低成本、綠色和切實可行的方法,可為我國污染農田土壤的資源化再利用、保障農產品生產安全和人類健康提供重要技術參考.