環洞庭湖土壤抗生素抗性基因分布和潛在風險

武 晨,黃鳳蓮,劉新剛,范青青,陸海楠,李啟武,郭 倩,李 瑩,彭勇春,李 峰*(1.湘潭大學環境與資源學院,湖南 湘潭 41110；2.長沙環境保護職業技術學院,湖南 長沙 410004；.國家環境保護城市土壤污染控制與修復工程技術中心,上海市環境科學研究院,上海 2002；4.環境生態健康湖南省普通高校重點實驗室,湖南 湘潭 41110；.湖南省長沙生態環境監測中心,湖南 長沙 410001；.湖南省生態環境監測中心,湖南 長沙 41002；.湖南省湘西生態環境監測中心,湖南 吉首 41000；8.國家環境保護重金屬污染監測重點實驗室,湖南 長沙 410014)

洞庭湖流域是湖南省乃至全國最重要的商品糧油基地和水產養殖基地之一,同時也是長江流域重要的綠色生態屏障,對維護當地生物多樣性和生態健康安全具有重要作用.然而,由于工業生產和農業面源污染等原因導致環洞庭湖流域周邊環境受到不同程度的污染.以往研究大多關注洞庭湖流域水體、沉積物和周邊土壤中重金屬、多環芳烴和農藥等傳統污染物的賦存特征、來源和環境風險[1-2],忽略了抗生素抗性基因(ARGs)在環洞庭湖流域周邊環境的豐度分布和潛在風險.ARGs 作為一種新污染物被廣泛的從生態系統中檢出,ARGs 能夠在不同細菌種群之間發生基因水平轉移并且存在自身擴增的獨特行為從而引起生物體高耐藥性,對農業生物安全、生態環境健康和全球公共衛生安全造成潛在威脅[3].

土壤是環境中ARGs 重要的“匯”,也是ARGs向水體和大氣等環境介質發生遷移轉化重要的“源”[4].污泥農用和有機肥施用等活動向土壤中引入病原菌和耐藥菌從而增加土壤ARGs 豐度和多樣性,并進一步促進可移動基因元件(MGEs)在土壤-植物系統中的傳播,從而對土壤生態系統造成危害[5].重要的是,土壤ARGs 能夠通過多種暴露途徑進入人體微生物組和病原體中,將增加人體耐藥性從而使疾病治療難度增加,對人體健康造成嚴重影響[6-7].因此,亟需評估環洞庭湖流域周邊土壤中ARGs 的潛在健康風險.

由于缺乏ARGs 的劑量-效應模型,導致準確評估ARGs 對人體造成的健康風險存在一定難度[8].已有學者嘗試采用定量微生物風險評估、實驗室篩選致病菌和流行病學調查等方式搭建ARGs 健康風險評估框架,以評估人體對ARGs 的攝入量,從而篩選高風險ARGs[9-13].值得注意的是,現有的評價方法多依賴某些確定性參數(如土壤顆粒吸入速率、暴露時間和體重等),但由于環境中ARGs 豐度的不確定性和特定人群受體的變化,易引發對潛在暴露劑量和健康風險的高估或低估[14].Monte Carlo 模擬已被廣泛的應用于污染物的概率健康風險評估中,該方法可以準確評估健康風險超過閾值的概率并確定優先控制因子[15].

因此,本研究通過實時熒光定量PCR(qPCR)對環洞庭湖流域表層土壤中不同類型的ARGs 豐度進行系統分析,明確研究區域土壤中ARGs 分布特征,采用Monte Carlo 模擬評估土壤ARGs 多途徑暴露下的人體暴露劑量和潛在健康風險,以期為環洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs 風險管控提供科學依據,為農業系統可持續發展和維持生態環境安全提供科學支撐.

1 材料與方法

1.1 點位布設和樣品采集

本研究在環洞庭湖流域共設置表層土壤采樣點位52 個(圖1),其中東洞庭湖流域采集19 個樣本,南洞庭湖流域采集18 個樣本,西洞庭湖流域采集15個樣本.采用五點取樣法采集表層土壤樣本.樣品放入含有冰袋的保溫箱中立即運回實驗室置于-80℃保存.土壤樣本去除根莖、石塊等異物,經過真空冷凍干燥后用滅菌的瑪瑙研缽研磨,然后過100 目篩放置在棕色無菌玻璃瓶中,儲存于-80℃備用.

1.2 土壤DNA 提取與qPCR

準確稱取0.2g 土壤樣本,根據Ezup 柱式土壤DNA 抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國)中的操作步驟提取土壤樣本中微生物總DNA,然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳(Thermo Fisher Scientific,美國)和ND5000 超微量紫外分光光度計(北京百泰克生物技術有限公司,中國)檢驗DNA 濃度和質量.

本研究選取土壤環境中廣泛檢出的 8 種ARGs 類型和16 種ARGs 亞型作為目標ARGs,選擇I 型整合子(intl1)作為MGEs 代表(表1),采用qPCR(LightCycler 96, Hoffmann-La Roche,瑞士)定量分析ARGs 和intl1 在研究區域表層土壤樣本中的豐度,每組測試設有3 個平行.qPCR 反應體系為20μL,包括正、反引物各0.5μL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國),SYBR Green Master Mix 10μL(翌圣生物科技(上海)股份有限公司,中國),ddH2O 8.0μL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國),模板DNA 1.0μL.qPCR 反應程序為95℃預變性5min,1 個循環,95℃變性10s、退火溫度下退火20s、72℃延伸20s,40 個循環[16].引物信息和退火溫度見表1.

表1 qPCR 反應中定量ARGs 和intl1 豐度的引物序列Table 1 Primer pairs for the quantification of ARGs and intl1by qPCR

1.3 土壤ARGs 日均暴露劑量評估

根據《環境污染物人群暴露評估技術指南》(HJ 875-2017),分別評估了兒童和成人經不同途徑攝取土壤中ARGs 的日均暴露劑量,即經皮膚接觸土壤ARGs、經呼吸道吸入攜帶ARGs 的土壤顆粒和無意中經口攝入攜帶ARGs 的土壤顆粒,計算公式見公式(1)～(3).為了減小模型中參數的不確定性導致評估結果偏大或偏小的問題,利用Oracle Crystal Ball v11.1.2.4 軟件(Oracle,美國)進行了Monte Carlo模擬,設定在95%置信水平上隨機模擬迭代次數為10000 次.

式中:ADD 為ARGs 的日均暴露劑量copies/(g·d);C 為ARGs 在土壤中的豐度,copies/g.公式中的其他參數含義及其在Monte Carlo 模型中的輸入值見表2.

表2 Monte Carlo 評估土壤ARGs 日均暴露劑量的參數Table 2 Parameter values of the model for daily exposure dose of ARGs in soil with the Monte Carlo simulator

偏遠地區具有人口稀少、工業活動極少、環境溫度低的特點(如永久凍土、極地和高海拔區域等),這些地區土壤中 ARGs 被認為是原始存在的,ARGs 豐度受到人為因素影響較小[17-18].因此,本研究將青藏高原地區土壤中ARGs 絕對豐度作為土壤中ARGs 豐度背景值(豐度范圍是1.80×105～1.35×107copies/g,平均值為 3.03×106copies/g)[19],利用公式(1)～(3)計算的日均暴露劑量作為土壤ARGs 暴露劑量風險背景值,從而判斷研究區域土壤中ARGs 的潛在健康風險.土壤ARGs 暴露劑量風險背景值為:成人 12.56copies/(g·d),兒童38.11copies/(g·d).

1.4 數據處理與分析

利用ArcGIS 10.5 繪制土壤采樣點位分布圖.利用SPSS Statistics 26.0 進行單因素方差分析(Duncan檢驗)比較不同類型ARGs 的豐度差異,并分析不同地區表層土壤中intl1 的豐度差異(P<0.05).利用SPSS Statistics 26.0 進行Spearman 相關性分析.利用Origin 2017 進行數據可視化.

2 結果與討論

2.1 環洞庭湖流域周邊表層土壤ARGs 分布特征

采用 qPCR 對洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs的豐度進行定量.如圖2所示,環洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs 總豐度范圍為3.29×107～3.73×109copies/g.東洞庭湖流域表層土壤采樣點中ARGs的總豐度范圍為5.36×107～1.97×108copies/g,西洞庭湖流域表層土壤中ARGs 的總豐度范圍為5.75×107～7.34×108copies/g,南洞庭湖流域表層土壤中ARGs 的總豐度范圍為3.29×107～3.73×109copies/g.研究區域表層土壤中ARGs 豐度遠遠高于人跡罕至的青藏高原地區土壤中ARGs 豐度(1.80×105～1.35×107copies/g)[19],表明環洞庭湖流域表層土壤受到了人類活動的影響造成高豐度ARGs 的積累.三個區域土壤中ARGs 的平均豐度排序為:南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>東洞庭湖流域.已有研究表明洞庭湖流域中部地區的化肥使用量及面源污染的環境風險高于東部和西部地區[22].南洞庭湖流域處于研究區域中下游地區,大面積的水流運動導致攜帶ARGs 的微生物或者病原菌進入下游水體和表層土壤中,從而使該地區土壤中ARGs 豐度較高.此外,本研究中南洞庭湖流域的采樣點位靠近工業區,工業廢棄物和工業廢水中含有的大量的抗生素進入土壤中也會促進更多耐藥微生物的產生,并且工業污染排放的污染物在土壤中積累也會影響ARGs 的傳播與富集[23].

圖2 研究區域表層土壤中ARGs 和intl1 的豐度Fig.2 The abundance of ARGs and intl1in surface soil of the study area

所有采樣點表層土壤中均檢測到較高豐度的磺胺類抗性基因sul1 和dfrA14、氨基糖苷類抗性基因kan 和喹諾酮類抗性基因qnrB(圖2(a)).與其他類型的ARGs 相比,洞庭湖流域周邊表層土壤中磺胺類ARGs 豐度最高(P<0.05),其次是氨基糖苷類和四環素類ARGs,表明這3 類ARGs 存在較高的環境風險和潛在的人群暴露風險(圖2(b)-(d)).已有研究表明磺胺類和四環素類抗生素在養殖業中廣泛使用且在禽畜體內不能被完全降解,從而造成洞庭湖水體以及沉積物中檢測到高豐度的磺胺類和四環素類抗生素[24-25].這些抗生素伴隨著灌溉水或者施肥進入周邊土壤中,加之地表徑流和土-水交換等過程,誘導土壤微生物產生高豐度的磺胺類和四環素類ARGs,進一步引起ARGs 在蔬菜、稻米和土壤等介質中的積累[26].sul1 和drfA14 基因是磺胺類ARGs豐度的主要貢獻因子(圖2(a)),其中sul1 基因在農田土壤[27]、麥田土壤[28]和堆肥土壤[29]中被檢到且屬于高豐度ARGs 基因.sul1 基因常位于可傳播型多抗性的大型質?；蛐⌒头墙Y合質粒上,可通過結合、轉導等方式在不同細菌間轉移和傳播從而導致磺胺類ARGs 在環境中廣泛存在[30].然而,一些低豐度的磺胺類ARGs(如drfA10 基因)也被檢出,說明ARGs 的豐度不僅受到環境中殘留抗生素的影響,還與該基因在環境介質中的穩定性有關[31].值得注意的是,本研究中檢測的氨基糖苷類ARGs 類型僅一種(kan 基因),但其豐度較高,這表明kan 基因廣泛的存在于研究區域土壤環境中并存在潛在風險.

2.2 intl1 促進環洞庭湖周邊表層土壤中ARGs 的傳播

由于土壤中intl1 豐度與ARGs 豐度和重金屬等抗性基因豐度相關且常存在于致病菌中,所以intl1 被認為是人為污染的環境指示因子且促進ARGs 的傳播[32].洞庭湖周邊表層土壤中 intl1 的平均豐度為6.94×108copies/g,高于ARGs 平均豐度(圖2(e)).洞庭湖流域屬于亞熱帶濕潤氣候,適宜的溫度和濕度促進了土壤環境中細菌的繁殖,而在高濃度的抗生素誘導下導致部分細菌產生intl1[33].此外,高豐度的intl1 可以通過遺傳和復制等方式進入后代細菌基因組,利用編碼酶來剪切自身與宿主細菌的DNA連接,隨即intl1進入細菌的轉座酶系統將復制的基因序列插入到細菌的染色體中,從而加速intl1 在不同細菌種群中的傳播[34].同時,intl1 與同一基因位點上多個ARGs 的整合密切相關,能夠促進ARGs 的水平基因轉移過程[35].

通過對各個研究區域采樣點intl1與ARGs相對豐度進行相關性分析,探究intl1 對ARGs 擴散傳播的影響(圖3).結果表明,intl1 與研究區域土壤中高豐度ARGs 基因(如dfrA14、tetR 和kan)的相對豐度均呈顯著正相關(P<0.05),表明intl1可以通過水平基因轉移的方式介導洞庭湖流域表層土壤中磺胺類(dfrA14)、四環素類(tetR)和氨基糖苷類(kan)ARGs的擴散傳播,這也是研究區域這3 類ARGs 豐度較高的原因之一.此外,在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域,intl1 的豐度與萬古霉素類(vanG)和喹諾酮類(qnrB)ARGs 豐度顯著正相關(P<0.05),表明intl1 同步介導了vanG 和 qnrB 的基因水平轉移,從而導致這兩個區域具有較高的ARGs 豐度.同時,研究區域表層土壤中豐度最高的磺胺類ARGs(sul1)豐度與大環內酯類(ermB)和喹諾酮類(qnrB 和oqxA)ARGs豐度呈顯著正相關(P<0.05),表明大環內酯類和喹諾酮類ARGs 與sul1 在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域中可能具有相同的來源.

圖3 不同類型ARGs 和intl1 豐度的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of abundance of different types of ARGs and intl1

2.3 環洞庭湖周邊表層土壤中ARGs 的潛在健康風險

利用Monte Carlo 模型計算了研究區成人和兒童經過消化道暴露、呼吸道暴露和皮膚接觸3種途徑攝入土壤中ARGs 的日均暴露劑量.由圖4可知,人群在環洞庭湖流域不同區域土壤攝入的ARGs 平均劑量排序為:南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>東洞庭湖流域,這與ARGs 豐度的區域分布相一致.兒童攝入土壤ARGs 的暴露劑量大于成人,這是由于ARGs 日均暴露劑量與受試人群的體重和暴露時間成反比,而兒童的體重和平均年齡均小于成人.

由于現有研究缺少ARGs 對人體的潛在致癌風險和非致癌風險相應的斜率因子及參考劑量系數,所以本研究將青藏高原土壤(高海拔、溫度低且受到人類活動影響小)中ARGs 豐度作為土壤背景值,并由此計算的人體ARGs 日均暴露劑量作為風險背景值(成人為 12.56copies/(g·d),兒童為 38.11copies/(g·d)).如圖4 所示,研究區域存在64.92%～98.68%概率的ARGs 潛在健康風險,兒童與成人受到ARGs 潛在健康風險概率相差不大,表明研究區域土壤ARGs造成的潛在健康風險不可忽視.

2.4 不同暴露途徑和不同類型ARGs 對人體暴露劑量的貢獻

研究區土壤中ARGs 經過3 種暴露途徑和8 種不同類型ARGs 對總暴露劑量的貢獻比如表3 所示.皮膚接觸途徑是ARGs 暴露劑量的主要來源,其對成人和兒童暴露劑量的貢獻分別達到89%以上和58%以上.成人接觸土壤時具有較大的皮膚接觸面積,也就導致了較高的皮膚接觸的ARGs 暴露劑量.然而,兒童經過消化道途徑攝入ARGs 的暴露劑量占比在41%以上,這可能是由于兒童在戶外活動時存在頻繁接觸土壤并吮吸手指的行為[36],從而導致其可能通過消化道途徑較高攝入ARGs.因此,需要格外注意兒童在戶外活動的衛生防護.

表3 不同暴露途徑和不同ARGs 類型對ARGs 日均暴露劑量的貢獻比(%)Table 3 Contribution of different exposure pathways and different ARGs types to the daily exposure dose of ARGs(%)

磺胺類ARGs 是總暴露劑量的主要來源,貢獻比為47.83%～78.68%,磷酸乙醇胺轉移酶和萬古霉素類ARGs 的暴露劑量較低,貢獻比在1%以下.不同的是,在東洞庭湖流域和南洞庭湖流域中氨基糖苷類和四環素類ARGs 對人群暴露劑量的貢獻僅次于磺胺類ARGs,然而在西洞庭湖流域樣本中是大環內酯類和喹諾酮類ARGs 的貢獻次于磺胺類ARGs.這與不同類型的ARGs 在環洞庭湖流域不同區域土壤中的分布和豐度相關.此外,本研究中磺胺類ARGs亞型(sul1, dfrA14 和dfrA10)的檢測數量低于四環素類ARGs 亞型(tetA, tetM, tetX, tetQ 和tetR),但磺胺類ARGs 的豐度及人群暴露劑量遠遠高于四環素類ARGs,可能是由于人為活動和基因水平轉移導致了土壤中磺胺類ARGs 的豐度增加,從而造成較高的潛在健康風險.

3 結論

3.1 環洞庭湖流域周邊表層土壤受到人類活動影響導致存在較高豐度的ARGs 和I 型整合子基因(intl1),主要ARGs 類型是磺胺類、四環素類和氨基糖苷類ARGs,平均豐度分別為1.51×108、1.50×107和2.64×107copies/g,主要ARGs亞型是sul1和dfrA14基因.南洞庭湖流域土壤中ARGs 豐度分別是東、西洞庭湖流域土壤中ARGs豐度的3.6倍和2.0倍.intl1基因豐度與不同類型的ARGs 豐度呈正相關,提示intl1 通過水平基因轉移促進了研究區域表層土壤中ARGs 的擴散傳播.

3.2 環洞庭湖流域周邊表層土壤 ARGs 存在64.92%～98.68%概率的ARGs 人體暴露劑量高于風險背景值,表明ARGs 導致的潛在人體健康風險不可忽視,其中皮膚接觸途徑是土壤ARGs 主要暴露途徑,占比為58.42%～90.23%,土壤中磺胺類ARGs是導致潛在健康風險的主要來源,占比為47.83%～78.68%.