固定化菌劑對鄰苯二甲酸酯的降解效能及途徑

陸雯逸,王澤銘,左翔之,劉奕翔,武海濤,高彥征(南京農業大學,土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

鄰苯二甲酸酯(PAEs),俗稱酞酸酯,是一類人工合成有機物,主要作為增塑劑被廣泛應用于塑料?包裝?化妝品?潤滑劑和香料等商品的生產當中[1].目前,全球PAEs 的年產量約3 億t,預計2050 年將達到5億t[2],而中國已成為世界上最大的增塑劑消費國,僅2017 年消費額就占世界消費總量的42%[3].PAEs 與塑料制品間沒有穩定的化學鍵結合,因此其會不斷的從塑料制品中滲透、蒸發而出,進入土壤?水?大氣等環境介質中[4].殘留在土壤或水體等環境介質中PAEs 可通過食物鏈、呼吸、皮膚接觸等途徑進入人體[5].研究表明,人體直接接觸大劑量的PAEs 或長期累積低劑量的PAEs 會對生殖系統?肝臟和腎臟等器官產生不良影響,遺傳物質也可能受到損傷[6-8].

自然環境中的PAEs 難以被非生物降解,因此微生物降解被認為是降解PAEs 最經濟有效的方法[9].為獲取高效降解PAEs 的微生物,很多研究者針對PAEs 污染環境中的微生物開展了篩選與分離工作.如Wu 等[10]從河床沉積物中分離出的一株蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.),可在48h內能將鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)完全礦化,且對其他種類的PAEs 同樣具有高效的降解能力.Wang 等[11]尋找到一株紅球菌(Rhodococcus sp.),其可以在7d 內降解96.4%的鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(200 mg/L).從污染環境中提取PAEs 降解菌顯然是一種行之有效的方法.但是,目前已篩選出的降解菌株,大部分只能把PAEs 轉化為鄰苯二甲酸單酯(PMEs)或鄰苯二甲酸(PA),甚至有的菌株僅參與共代謝過程[12].研究發現很多細菌僅對單一組分的PAEs 具有較強的降解能力,面對實際環境中多種PAEs 共存的局面,使用單一菌株難以達到良好的修復效果.復合菌群作為一種多菌體共存的生物群體,菌株之間可以通過協同代謝作用有效降解環境中的多種有機污染物.馬永見等[13]從某污染場地中篩選分離出3株具有PAEs降解能力的菌株,將其按照一定的比例構建成新的復合菌群,與單菌株相比,復合菌群能在更短的時間內降解PAEs.此外,在協同代謝過程中,一些細菌對復雜有機物的生物降解產物可能會為群落中的其他細菌提供生物降解所需的簡單分子[14].Vega 等[15]從污染土中篩選出兩株降解菌,利用它們的特性構建新的菌群,實現了對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)的完全礦化.Wu 等[16]從活性污泥中分離純化出戈登氏菌(Gordonia sp.strain JDC-2)和節桿菌(Arthrobacter sp. strain JDC-32)兩株降解菌,發現JDC-2 能迅速將DOP 轉化為PA,而菌株JDC-32 能將PA 進一步分解.由此可見,與單一功能菌株相比,菌群中不同細菌之間的協同代謝可提高環境中PAEs 的消減.但目前,仍缺少一組能同時降解多種PAEs 的復合菌群,以應對實際環境中的多污染場景.

此外,為了提高微生物的環境適應能力,增強對污染物的去除效果,微生物的固定化技術得到了越來越多的關注[17-18].在國內,固定化微生物技術已被應用于修復農藥、石油及多環芳烴等有機污染物污染土壤,在實際的污染修復工程應用中表現出極大的優勢[13,19].而載體材料始終是研究的重點之一.元妙新[20]、段淑偉等[21]研發的微生物包埋固定技術都能成功去除土壤中的有機污染物,且修復效果優于游離菌.載體材料對環境的友好性有待進一步提高.生物炭既解決了農林廢棄生物質的處理工作,又可提高土壤的保水功能,提高土壤有機質含量,有望成為更加理想的微生物固定化載體.

本研究嘗試將具有不同PAEs 降解能力的多個菌株進行復配,構建具有PAEs 降解廣譜性的功能菌群.以生物炭為載體,采用吸附法研制固定化菌劑,研究固定化菌劑降解環境中PAEs 的效能及途徑.旨在為PAEs 污染環境的微生物修復提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸正辛酯(DnOP)純度為99.0%,購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司.6 種PAEs 的基本理化性狀見表1.甲醇為色譜純級別.

1.1.2 供試菌株 菌株為課題組已有的PAEs 高效降解菌:谷氨酸桿菌(Glutamicibacter sp. A4),保藏編號為 CCTCC M20221850;芽孢桿菌(Bacillus sp.W34)[22];紅球桿菌(Rhodococcus sp. 2G)[23],保藏編號為CCTCC M2015056.供試菌株的形貌見圖1,A4 的系統發育樹見圖2.

圖1 菌株的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of the strain

圖2 A4 的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of A4

1.1.3 培養基 所用的培養基為LB 培養基和無機鹽培養基,具體配方如下:LB 培養基:NaCl 10.0g/L,進口蛋白胨10.0g/L,進口酵母粉5.0g/L.無機鹽培養基(MSM):(NH4)2SO41.50g/L, KH2PO40.50g/L,K2HPO4·3H2O 1.91g/L,NaCl 0.5g/L, MgSO4?7H2O 0.20g/L.所有培養基在使用前均在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min.

1.2 復合菌群的構建

分別將菌株A4、2G、W34 接種到LB 液體培養基中,置于30℃,150r/min 搖床中振蕩培養24h.將菌液8000r/min、4℃離心5min,棄去上清液;用已滅菌的MSM 對菌體反復沖洗2～3 次,再次離心收集菌體.用MSM 將菌體制備成菌懸液,OD600調整到1.0.拮抗實驗結果發現A4、2G、W34 不存在拮抗反應,因此按照1:1:1 的比例進行復配,4℃冰箱備用.

1.3 固定化菌劑的制備

1.3.1 固定化載體生物炭的制備 前體材料清洗后置于烘箱內,105℃殺青30 min,然后在55℃條件下烘烤24h,干燥后用粉碎機打碎.在氮氣氣氛條件下,以5 ℃/min的升溫速率,達到600℃后恒溫2h 燒制為生物炭,冷卻后研磨過60 目篩.將獲得的炭材料先用0.1%的HCl 溶液進行清洗,除去熱解過程中產生的焦油和灰分,接著用超純水沖洗多次后烘干.

1.3.2 固定化菌劑的制備 稱取1.5g 生物炭于50mL 錐形瓶,滅菌后冷卻至常溫,加入15mL 復合菌群的菌懸液,置于30℃、150r/min 的恒溫震蕩培養箱內固定24h,隨后5000r/min 離心5min,棄上清液.用滅菌的MSM 液體洗滌2～3 次,離心收集下層固體.置于25℃下干燥,即為本文所用固定化菌劑.

1.3.3 游離菌和固定化菌劑降解能力的驗證 向滅菌的錐形瓶中加入PAEs 混標,使得6 種PAEs 終濃度均為20mg/L,待甲醇揮發完全后,加入19mL 的MSM 液體培養基,加入1mL 復合菌群的菌懸液,并設置未投加菌液的空白對照,每個處理設置3 個重復.在150r/min、30℃條件下避光培養,分別于培養第1,3,5,7d 測定PAEs 殘留濃度.

固定化菌劑降解能力驗證實驗的處理組為20 mL 的MSM 液體培養基,加入0.1g 的固定化菌劑,其余與游離菌降解實驗過程相同.

1.4 固定化菌劑制備條件的優化

1.4.1 固定化時間對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在制備固定化菌劑的過程中,將樣品置于恒溫振蕩培養箱內培養不同的天數:1,2,3d,將制備完成后的固定化菌劑投加于20mL無機鹽培養基中,加入PAEs,使6 種PAEs 終濃度均達到20mg/L,30°C、150r/min 條件下培養7d 后取出,用HPLC 測定培養基中PAEs 殘留量,確定最佳固定化時間.

1.4.2 菌料比對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在確定最佳固定化天數的基礎上,在制備固定化菌劑的過程中向1g 生物炭中加入不同的菌液量:10,20,30mL,以制備固定化菌劑.剩余步驟同1.4.1 中所述,通過測定培養基中PAEs 殘留量確定最佳菌料比.

1.4.3 固定化溫度對固定化菌劑降解PAEs 的影響 在最佳固定化時間和菌液用量的制備條件下,分別在25,30,35℃條件下培養以制備固定化菌劑.剩余步驟同1.4.1 中所述方法,通過測定培養基中PAEs殘留量確定最佳固定化溫度.

1.5 PAEs 降解途徑分析

反應體系設置:將PAEs混標加入到100mL滅菌的錐形瓶中,使總PAEs 濃度達到120mg/L,待有機溶劑揮發后加入47.5mL MSM 培養基和2.5mL 菌群菌懸液,置于30℃、150r/min 的恒溫震蕩培養箱中培養24h,于3,6,12,24h 取樣.

HPLC-HRMS 分析樣品前處理:使用Cleanert polar-enhanced polymer(PEP)固相萃取柱(500 mg/6 mL,Bonna-Agela Technologies,中國天津)對降解產物進行凈化和濃縮.使用前,先用10mL 甲醇活化PEP 小柱,再用5mL 超純水清洗柱體.然后,將50mL 的降解液以1 mL/min的流速流經PEP小柱,用5mL超純水清洗.用2mL 甲醇以2mL/min 的流速淋洗PEP 小柱,收集洗脫液,過0.22μm 有機相濾膜,?20℃靜置備用.使用HPLC-HRMS 聯用方法檢測降解產物分子量.

1.6 PAEs 的檢測方法

采用LC-20AT 高效液相色譜儀(配有SPD-2A紫外檢測器).檢測時間為40min,進樣系統的進樣量為20μL;分離系統以乙腈-水為流動相、初始流速為1.0mL/min,采用梯度洗脫的方式分離PAEs,色譜柱為Φ4.6×250mm Inertsil ODS-P 液相色譜柱,柱溫為40℃;檢測系統采用紫外檢測器檢測、開啟雙波長檢測模式,分別為205 和225nm.20mg/L 的6 種PAEs加標回收率范圍為80.03%～102.05%,相對標準偏差范圍為0.52%～4.36%,實驗方法符合要求.

1.7 數據處理

采用Excel 2016 進行數據處理,使用Origin 2018 進行圖表繪制.

計算方法為:

式中:CK為無菌對照處理PAEs 的殘留濃度;CB為含降解菌培養液或固定化菌劑中PAEs 的殘留濃度.

2 結果與討論

2.1 功能菌群對塑化劑的降解效能

構建的復合菌群對6 種PAEs 具有較好的降解能力.如圖3(a)所示,復合菌群對6 種PAEs 總的降解率在第1d 時為60.35%,在第7d 時能達到80.04%.但該復合菌群對不同PAEs 的降解能力有所不同.復合菌群對短鏈PAEs 降解率在7d 時能高達98.19%,對長鏈PAEs 在第7d 時降解率僅61.93%.

圖3 復合菌群對PAEs 的降解率Fig.3 Degradation rate of PAEs by complex flora

如圖3(b)所示,復合菌群對DMP、DEP 和DBP的降解能力相對較高,在第1d 時降解率就能達到93.87%以上,對BBP 的降解能達到66.65%,但DEHP和DnOP 的降解率相對較低,在第1d 時幾乎不降解;到第7d 時,對DnOP 的降解能達到71.16%, DEHP的降解率為34.99%.6 種污染物中,DMP?DEP 和DBP 作為短鏈的PAEs 化合物,具有較好的親水性,更容易與功能微生物發生接觸,并且分子結構更加簡單,所以更容易被微生物降解;而DEHP 和DnOP分子量較大,水溶性相對較差,則不易被微生物降解[24].但該復合菌群在廣譜性方面仍具有一定優勢,目前已有的報道幾乎未見對6 種PAEs 均具有降解的菌群.例如Zhang 等[25]將Arthrobacter sp. SLG-4和Rhodococcus sp. SLG-6 復配構建了一個新的菌群,其僅對DMP、DEP、DBP 和DnOP 具有較好的降解能力.Lu 等[26]用Microbacterium sp. PAE-1 和Pandoraea sp. PAE-2 組建的菌群僅能降解DBP.相較于前人研究,本文所構建的PAEs 降解菌群具有更好的廣譜性.

2.2 固定化菌劑對塑化劑的降解效能

如圖4(a)所示,固定化菌劑對6 種PAEs 總的降解率在第1d 時就能達到70.58%,在第7d 時能達到90.21%,比游離菌群降解率提高了10.17%.固定化菌劑對短鏈PAEs 降解率在7d 時能高達98.39%,對長鏈PAEs 在第7d 時降解率能達到80.10%,比游離菌群降解率提高了18.17%.固定化提高了微生物的細胞密度和耐受性,因而提高了降解效率.根據趙暹等[27]的研究,將復合菌群DP3 通過包埋法制備而成的固體菌劑,降解同等濃度的污染物所需時間僅為游離菌的一半.SEM 掃描發現菌群被復合材料包埋吸附在凝膠球內部,為微生物提供了生存空間,因而增強了物質交換效率.本研究以生物炭作為載體,不僅能擴充微生物的生存空間,其中的有機質,以及氮?磷和鉀等元素還可為菌群的生長提供營養物質,進而提高微生物的密度[28].可見固定化可有效提高復合菌群的生存質量,進而提高對污染物的降解效能.

圖4 固定化菌劑對PAEs 的降解率Fig.4 Degradation rate of PAEs by immobilized bacterial agent

如圖4(b)所示,固定化菌劑對6 種PAEs 的降解效率均有升高,其對DMP、DEP、DBP 的降解在第1d 時均能達到96.31%以上,對BBP 的降解率在第1d 時能達到74.61%,較游離菌提高了7.96%;對DEHP 和DnOP 在第1d 時就有降解能力.特別是對于游離菌無法利用的DEHP,固定化菌劑在7d 內對DEHP 的降解率高達76.17%,比游離菌高了1.18 倍.這可能是由于生物炭自身的多孔結構和豐富的官能團,使其能夠吸附污染物,增加了親水性差的污染物與微生物的接觸幾率,進而提高了功能菌群對DEHP 的降解[28].以上結果顯示,制備的生物炭固定化菌劑對PAEs 的降解具有廣譜性和高效性.

2.3 固定化菌劑制備條件優化

固定時間的優化結果如圖5 所示.固定溫度為30℃ ,菌料比為1:10,固定1～3d 后,固定化菌劑對總PAEs 的降解率在80.66%～84.99%,當固定時間為2d時,該固定化菌劑對總PAEs的降解效果最優.當固定時間為2d時,固定化菌劑對長鏈PAEs的降解率最高,達到70.44%,而固定時間為1,3d 時,其對長鏈PAEs的降解率僅63.98%?61.42%.這是因為,如果固定化時間短,載體對微生物的吸附效果不佳,吸附的微生物數量較少;固定化時間過長,微生物的生長可能處于衰亡期,活性好的微生物數量減少[29].因此選擇適宜的固定時間能夠綜合微生物的吸附效果與健康生長.固定化菌劑制備的最優固定時間為2d.

圖5 固定時間對固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.5 Influence of fixed time on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

在最佳固定化時間的基礎上,探究不同的菌料比對PAEs 降解效果的影響,結果如圖6 所示.向1g生物炭中加入30mL 菌液時,固定化菌劑對PAEs 的降解效果略高于菌液用量為10和20mL時的降解效果,對總PAEs 的降解率可達到94.18%.如圖6 所示,當菌料比為1:10、1:20(V/M)時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解率僅76.76%?80.26%,而當菌料比為1:30(V/M)時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解效果有所提升,降解率高達89.47%.與馬伶俐[30]研究結果一致.由于在降解過程中,數量過少的微生物難以應對高濃度的污染物,但當微生物數量較多時會引發種群間對氧氣和營養物質的競爭,阻礙負載在生物炭中微生物的生長,從而影響固定化菌劑的降解效能[31].固定化菌劑制備最優菌料比為1:30(V/M).

圖6 菌料比固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.6 Influence of bacteria-material ratio on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

當固定化時間為2d,菌料比為1:30 時,探究該固定化菌劑的最佳固定溫度,結果如圖7 所示.當溫度為30℃時,固定化菌劑對總PAEs 的降解率最高,可達到96.60%,當溫度過高或過低時,固定化菌劑對PAEs的降解能力有所下降.當溫度為30℃時,固定化菌劑對長鏈PAEs 的降解效果最好,降解率可達93.86%.根據張小紅等[32]的報道,這是因為微生物降解污染物是一種酶促反應,當溫度過高時,酶的蛋白質結構受到了破壞,溫度過低時酶的活性不足,對PAEs 的降解率也會有所下降.固定化菌劑最優固定溫度為30℃.

圖7 固定溫度對固定化菌劑降解PAEs 的影響Fig.7 Influence of temperature on the degradation of PAEs by immobilized bacterial agent

固定化菌劑的最優制備條件為:固定化時間2d,固定溫度30℃,菌料比1:30(V/M).在該條件下,固定化菌劑對6 種PAEs 總的降解率能達到96.60%,對短鏈PAEs 的降解率能達到99%以上,對長鏈PAEs 的降解率也能達到93%以上,具有顯著的高效性和廣譜性.

2.4 PAEs 的降解途徑

DBP 和BBP 作為短鏈PAEs 和長鏈PAEs 的代表,解析了功能菌群代謝PAEs 的途徑.借助HPLCHRMS 分析檢測DBP 的降解產物.如圖8(a)所示,功能菌群降解DBP 過程中檢測到了5 種代謝產物-鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸單乙酯(MEP)、鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)、鄰苯二甲酸(PA)和1,3-異苯并呋喃二酮(IBF).趙真真[33]在研究微生物降解DBP 時發現,微生物可先將DBP 轉化成了DEP 繼而進一步將其轉化為PA,酯的水解是DBP 主要的生物降解過程.最終推測DBP 的降解路徑如下:首先經微生物β-氧化作用形成DEP,然后去酯化形成MEP,再通過脫甲基反應形成MMP,在酯酶作用下水解形成PA,然后芳香環開環后進入三羧酸循環,最后礦化成CO2和H2O.

圖8 推測生物降解的途徑Fig.8 The proposed biodegradation pathways

如圖8(b)所示,功能菌群降解BBP 的過程中主要檢測出7 種代謝產物包括:鄰苯二甲酸單芐酯(MBzP)、鄰苯二甲酸單丁酯(MBuP)、鄰苯二甲酸(PA)、1,3-異苯并呋喃二酮(IBF)、鄰苯二甲酸二甲氧基乙酯(BMP)、苯甲醛(BzH)和γ-羧基粘康酸內酯(γ-carboxy muconolactone).大部分產物在此前就有所報道.Chatterjee 等[34]分離獲得一株具有BBP 降解功能的革蘭氏陽性細菌MTCC 4818,該菌株降解BBP過程中產生中間產物主要為MBuP和MBzP.Xu等[35]在紅樹林沉積物中分離出一株熒光假單胞菌B-1,其在降解BBP 過程中主要降解產物為MbuP、MBzP、PA 和BzA.最終推測BBP 降解路徑為:在微生物的作用下, BBP 通過去酯化形成了MBzP 和MBuP,這兩種物質經過去酯化形成了PA.推測PA的分解共有4 條途徑,第1 條途徑是經過脫水縮合反應形成IBF, IBF 在微生物酯酶的作用下會與體系中的甲醇發生酯化反應形成BMP,也可能轉化成BzH 進入三羧酸循環;第2 條途徑是PA 直接轉化成BzH 進入三羧酸循環;第3 條途徑是PA 直接進入三羧酸循環;第4 條途徑是PA 轉化成γ-carboxy muconolactone 進入三羧酸循環.

3 結論

3.1 通過單菌復配獲得一組具有PAEs 降解高效性和廣譜性的功能菌群,該菌群7d 內對總濃度為120mg/L 的6 種PAEs 降解率為80.04%;以生物炭為載體,采用固定化技術制備了固定化菌劑,菌劑最優制備條件為:溫度30℃、固定化時間2d、菌料比1:30(V/M),固定化菌劑對總PAEs 的降解率可達到96.60%,比游離菌提高了16.56%.

3.2 功能菌群通過β-氧化、去酯化和脫甲基反應等過程將DBP 最終礦化成CO2和H2O;而BBP 在功能菌群的作用下先經過去酯化形成MBzP 和MBuP兩種中間產物,然后再進一步通過酯化形成PA,最后進入三羧酸循環.酯的水解作用是PAEs 重要的生物降解過程.