畜禽糞便好氧堆肥過程中抗生素的消減規律

周 賢,王 建,韓 進,徐鵬程,凌婉婷*(.南京農業大學,土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 0095；.江蘇省環境工程技術有限公司,江蘇 南京 009)

抗生素作為抗菌劑和生長促進劑被廣泛用于畜牧業[1-3].我國作為抗生素最大生產和消費國,畜禽養殖業中抗生素年用量已達8.4 萬t[4].然而,這些藥物無法被動物體完全吸收代謝,約85%抗生素會以母體形式通過動物糞尿排入環境[5].大量研究表明,畜禽糞便中抗生素種類繁多,其殘留量一般在μg/kg級,甚至高達mg/kg 級[5-7].研究發現[6],在36 個養殖場的豬糞中檢測出14 種不同種類的抗生素,其含量為0.01～5.2mg/kg.當前全球畜禽糞便排放量巨大.據估算,歐美國家每年約有11～16 億t 畜禽糞便產生,而中國每年動物糞便產生量高達38億t[8].目前,畜禽糞便的主要處理途徑仍是作為有機肥還田.如此高劑量的抗生素必然會隨畜禽糞便農用進入土壤環境,在土壤中積累,從而影響土壤微生物群落結構[9]、誘導微生物產生耐藥性[10]、抑制或增強微生物代謝[11-12],給生態環境及人群健康造成潛在的威脅.因此,如何去除畜禽糞便中的抗生素殘留,實現畜禽糞便資源化和無害化利用,已成為當前農業生態領域亟需解決的問題.

好氧堆肥法是處理畜禽糞便的主要方法.它利用各種微生物的活性對糞便中有機物質進行分解并產生穩定的有機或無機物作為最終產物,從而達到對畜禽糞便的資源化和無害化處理[13].研究表明,好氧堆肥可去除糞便中抗生素殘留[14-15].例如,好氧堆肥后,糞便中氟喹諾酮類抗生素和土霉素可被完全去除[14],強力霉素和磺胺類抗生素的去除率高達80%[15].然而,這些研究只針對一種或兩三種抗生素進行研究.到目前為止,人們對大多數抗生素在堆肥過程中的消減情況知之甚少.

本文采用雞糞、牛糞和豬糞為堆肥原料,著重研究畜禽糞便好氧堆肥過程中15 種磺胺類(SAs)、13種氟喹諾酮類(FQs)和4 種四環素類(TCs)共32 種常見抗生素含量的動態變化,分析糞便中抗生素含量與堆肥時間、糞便特性(如來源、組成、含水量)、供氧頻率(翻堆次數)等的關系,系統闡釋好氧堆肥后畜禽糞便中抗生素的污染特征,為抗生素風險防控提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供試抗生素及堆肥原料

本試驗共檢測了15 種磺胺類抗生素(SAs,磺胺嘧啶[SD]、磺胺二甲基嘧啶[SM2]、磺胺氯噠嗪[SPD]、磺胺甲噁唑[SMZ]、磺胺甲氧嗪[SMP]、磺胺對甲氧嘧啶[SMD]、磺胺間甲氧嘧啶[SMM]、磺胺噻唑[ST]、磺胺間二甲氧嘧啶[SDM]、磺胺甲噻二唑[ST2]、磺胺苯吡唑[SPP]、磺胺脒[SG]、磺胺醋酰鈉[SA-Na]、磺胺鄰二甲氧嘧啶[SDM’]和磺胺喹噁啉[SQ]),13 種氟喹諾酮類抗生素(FQs,諾氟沙星[NOR]、氟羅沙星[FLX]、司帕沙星[SPA]、奧比沙星[ORB]、恩諾沙星[ENR]、達氟沙星[DFX]、培氟沙星[PEF]、二氟沙星[DIF]、環丙沙星[CIP]、沙拉沙星[SAR]、洛美沙星[LOM]、氧氟沙星[OFL]和氟甲喹[FLM])和4 種四環素類抗生素(TCs,四環素[TC]、土霉素[OTC]、金霉素[CTC]和多西霉素[DOC]),這32 種目標抗生素標準品均購自美國Sigma 公司,純度大于98%,其理化性質如Zhou 等[5]介紹.質譜級甲醇和乙腈購自美國Thermo Fisher 科技公司,其他分析級化學品購自國藥化學試劑公司,實驗用水均為超純水.

堆肥原料為新鮮的牛糞、豬糞和雞糞,分別采自南京及其周邊地區規?；膛?、生豬和蛋雞養殖場[17].堆肥初始物料理化性質見表1.

表1 堆肥初始物料理化性質Table 1 Physicochemical properties of raw materials

1.2 試驗設置

本試驗在南京農業大學玻璃溫室中進行,堆肥共設6 個處理,分別為2 個雞糞堆肥、1 個豬糞堆肥和3 個牛糞堆肥,具體處理見表2.

表2 堆肥處理方案Table 2 Protocols of composting treatment

根據《畜禽糞便堆肥技術規范》(NY/T 3442-2019)[16],選擇稻殼為輔料,將稻殼粉碎成1～2mm,分別與雞糞、豬糞和牛糞混合均勻,使堆肥初始C/N 為30:1.將6 種處理組的初始含水率調整為55%左右.其中向雞糞堆肥中加入適量的超純水,使初始含水率為68%左右,使其成為高含水率雞糞堆肥處理組(表2).試驗采用開放式堆肥,將6 種糞便堆制成錐形(0.5m×0.5m×0.8m),按不同頻次進行人工翻堆,為堆體提供充足的氧氣.堆肥過程中表面覆蓋塑料膜以防止水分過量蒸發.在每個堆體的中心使用自動數字溫度計測量每天的溫度(上午9:00 和下午15:00),同時測定室溫,豬糞、牛糞和雞糞堆肥溫度變化如韓進等[17]所示.

1.3 堆肥樣品采集

堆肥32d 后,當所有處理組的溫度達到與環境溫度25℃接近時,終止觀察.收集和分析堆肥第1,2,4,8,16,32d 的樣品.按四分法在堆體的上、下、左、右、中位置進行取樣,混合均勻后組成一個樣品(1kg).樣品保存于-80℃用于抗生素檢測.

1.4 抗生素檢測方法

根據Zhou 等[5]描述的方法從堆肥樣品中提取目標抗生素,通過API 5000 三重四極桿質譜儀在電噴霧電離模式下對抗生素進行檢測分析.所采用的分析方法線性相關性良好(r>0.9995).堆肥樣品中所選抗生素的最低檢出限為0.5～10μg/L.

1.5 統計分析

不同類型糞便堆肥過程中,抗生素含量隨時間的變化趨勢,用一級動力學方程進行擬合:

式中: c 指堆肥某一時間測得的抗生素含量,μg/kg;c0指堆肥開始(第1d)時抗生素含量,μg/kg;k 為抗生素降解速率常數,d-1.

不同類型糞便堆肥過程中,抗生素半衰期公式如下:

式中:t1/2為半衰期,d.

數據經Excel 2020 預處理后用IBM SPSS Statistics 22 單因素方差分析(One-way ANOVA)中的最小顯著性差異法(LSD)進行不同處理間各項指標的顯著性差異檢驗.P<0.05 視為統計學上具有顯著性差異.對于兩個處理組間的比較采用獨立樣本T檢驗(置信區間95%)進行分析比較.其中,*為P<0.05統計學上具有顯著性差異.最后采用Origin 2018 軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 畜禽糞便中抗生素殘留特征

表3 反映了新鮮雞糞、豬糞和牛糞樣品中抗生素種類及含量特征.如表3 所示,SAs、FQs 和TCs均在3 種糞便中檢出.其中,SAs 的檢出率為31.1%,低于糞便中FQs(56.4%)和TCs(91.7%)的檢出率,說明FQs 和TCs 是3 種糞便中主要抗生素種類.然而,SAs 的總量(干物質計)為119.09μg/kg,高于TCs和FQs 在糞便中的總含量.并且SAs 的平均含量(干物質計)范圍為ND～49.65,而FQs 和TCs 平均含量范圍為n.d.～13.2,n.d.～20.95μg/kg.這說明盡管SAs檢出率低,但其在糞便中總含量高且含量范圍跨度較大.

表3 3 種畜禽糞便堆肥前后抗生素含量(μg/kg 干物質計,平均值±標準差,n=3)Table 3 The antibiotic concentration(μg/kg dry matter, mean±standard derivation, n=3) in three kinds of livestock manures before and after composting

不同種類糞便中抗生素種類和含量存在差異.在3 種糞便中,牛糞中抗生素檢出率最低,且總含量較低,為67.76μg/kg.豬糞和雞糞中抗生素檢出率和總含量相當.對于3 種類型的抗生素,牛糞中SAs 檢出率較低,為6.67%.而雞糞中SAs 的檢出率較高,為53.3%,且其總含量在3 種糞便中最高,為72.43μg/kg.其中,SPP 在雞糞中含量最高為49.65μg/kg.FQs 和TCs 在3 種糞便中的檢出率及總含量相當,但FQs組成存在一定差異.其中PEF、CIP、SAR 和OFL 均在糞便中檢出.上述結果表明不同種類糞便中抗生素種類和含量存在一定差異.

2.2 畜禽糞便堆肥過程中抗生素殘留動態變化

3 種畜禽糞便堆肥溫度變化分為升溫期、高溫期和降溫期3 階段[17].在堆肥第3d,堆體溫度上升至50℃ ,維持到第16d 后下降,并逐漸接近環境溫度.這一過程符合《糞便無害化衛生標準》(GB 7959—2012)[35]中對堆肥溫度的規定,即堆肥溫度(≥50 ℃)需保持一周以上.顯然,本文中3 種畜禽糞便均滿足高溫堆肥要求.表3 反映了堆肥前后抗生素殘留變化情況.經32d堆肥后,3種糞便中抗生素總含量分別由67.76,107.32 和123.09μg/kg 下降至8.12,23.51 和11.91μg/kg,其去除率高于78.09%.并且糞便中抗生素的檢出率分別由40.62%、53.12%和53.12%降低至28.12%,31.25%和25%,表明好氧堆肥可有效減低糞便中抗生素含量及種類.

此外,堆肥過程對不同種類抗生素的去除效果存在差異.堆肥后,3 種糞便中SAs 的檢出率分別由6.67%,33.33%和53.33%下降至0%,6.67%和13.33%.同時,除雞糞中ST2 去除率較低外,其余被檢出的SAs 去除率均高達90%,說明高溫好氧堆肥可有效去除畜禽糞便中SAs.堆肥結束后FQs 和TCs 的去除率高達62.81%,但檢出率較高.與堆肥前檢出率相比,堆肥后牛糞和豬糞中仍有5 種FQs 被檢出,而TCs 的檢出率仍為100%.同時,堆肥對OFL 和CTC的去除率均低于50%,說明堆肥可有效降低畜禽糞便中FQs 和TCs 殘留,但不能完全去除.

2.3 不同類型糞便堆肥過程中抗生素消減效果

如圖1 所示,在相同的堆肥處理過程中,隨著時間的延長,糞便中各類抗生素含量逐漸降低.不同種類糞便中抗生素的殘留率存在顯著差異(P<0.05).與雞糞和豬糞相比,32d 堆肥后,牛糞中抗生素已低于檢出限≤0.5 μg/L,表明牛糞中抗生素可通過堆肥被去除.對于雞糞堆肥,除SAs 外,雞糞中FQs 和TCs 殘留率隨時間的延長緩慢下降.經32d 堆肥后,雞糞中FQs 和TCs 的總殘留率高達59.57%和81.32%.同樣地,豬糞堆肥32d 后,FQs 和TCs 的總殘留率分別為32.90%和35.31%.并且豬糞在堆肥前期消減速率較快.堆肥第2d,FQs 和TCs 的去除率分別為40.38%和39.92%.隨著時間的延長,堆肥第8d 后,FQs 和TCs消減速率趨于平緩.綜上,堆肥對不同種類糞便中抗生素的去除存在顯著差異,牛糞中抗生素殘留更易通過堆肥去除.

圖1 不同種類糞便堆肥過程中抗生素殘留率變化Fig.1 Residual rate(%) of antibiotics during composting process

2.4 不同堆肥處理方式對抗生素消減的影響

研究表明,抗生素在堆肥過程中的消減可能與堆肥樣品C/N、TOC、濕度、溫度和氧氣等環境變量有關[13].為此,本研究考察了堆肥初始含水率及堆肥過程中翻堆頻率對抗生素消減的影響.圖2 所示,經過32d 堆肥處理,低含水率雞糞中SAs、FQs、TCs 和總抗生素的殘留率分別為7.10%、59.57%、81.32%和45.90%,高于高含水率雞糞堆肥后的殘留率.通過對堆肥過程中抗生素消減速率擬合(表4),發現不同含水率雞糞堆肥過程中各類抗生素含量變化符合一級降解動力學擬合模型,其R2>0.63.同時,高含水率雞糞SAs、FQs、TCs 和總抗生素的降解速率常數分別為 0.3293,0.0229,0.0669,0.2739d-1,高于低含水率條件下各類抗生素的降解速率(表4),表明較高的初始含水率(68.11%)有利于加快抗生素的消減.

圖2 不同初始含水率下雞糞堆肥過程中抗生素的殘留率Fig.2 The residual rate of antibiotics during chicken manure composting under 68.11% and 53.27% moisture

表4 不同初始含水率下雞糞堆肥抗生素降解半衰期Table 4 Half-life of antibiotic degradation in different initial moisture during chicken manure composting

圖3 反映了不翻堆、2 次/d 和1 次/2d 的翻堆頻率對牛糞中抗生素含量變化的影響.SAs在堆肥32d均被完全去除,翻堆與不翻堆無顯著差異(P>0.05).但在32d堆肥過程中,不翻堆處理對SAs 的去除效果優于翻堆處理.堆肥2d 后,SAs 在3 種處理下的殘留率分別為17.03%、61.56%和41.84%.在第8d 時,不翻堆處理下,牛糞中SAs 被完全去除,而翻堆處理組中仍有46.11%和32.46%的SAs 殘留.這表明不翻堆更有利于牛糞中SAs 的去除.在32d 堆肥后,FQs、TCs 和總抗生素在翻堆處理中的去除效果顯著優于不翻堆處理(P<0.05),而1 次/2d 和2 次/d 的翻堆頻率不具有顯著差異(P>0.05).如圖3所示,32d堆肥后,翻堆處理中FQs、TCs和總抗生素被完全去除,而不翻堆處理中各抗生素的殘留率分別為25.53%、27.99%和16.48%.

圖3 堆肥過程翻堆頻率對抗生素殘留的影響Fig.3 Changes of the residual rate of SAs, FQs, TCs and total antibiotics with different turning frequency during cow manure composting

通過堆肥過程中抗生素消減過程擬合(表5),發現不同翻堆頻率下FQs、TCs 和總抗生素含量變化符合一級降解動力學擬合模型,其R2>0.68.并且翻堆處理牛糞中FQs、TCs 和總抗生素的降解速率常數均高于不翻堆條件下各類抗生素的降解速率常數.這表明堆肥過程中翻堆有利于加快糞便中抗生素的消減.盡管2 次/d 和1 次/2d 的翻堆頻率均可在32d完全去除糞便中FQs 和TCs,但1 次/2d 翻堆處理過程中抗生素的降解速率常數高于2 次/d 翻堆處理,且抗生素的半衰期更短(表5).這說明1 次/2d 的翻堆處理可加快堆肥過程中抗生素的消減.綜上,較低的堆肥濕度和翻堆頻率會降低堆肥過程中抗生素的進一步消散.

表5 不同翻堆頻率下牛糞堆肥過程中抗生素降解半衰期Table 5 Half-life of antibiotic degradation in different turning frequency during cow manure composting

3 討論

本研究3 種畜禽糞便中均檢測出抗生素殘留,其殘留含量在μg/kg 量級,比前期文獻報道的殘留含量低[4,18-19].Hu 等[20]研究表明,采樣地區、時間以及抗生素使用情況的不同會造成檢出的抗生素殘留量差異.自2014 年開始,我國政府已開始關注畜牧業中抗生素使用問題,并采取了一系列措施來減少和禁止部分抗生素在養殖業中的使用,如NOR 等.此外,堆肥原料的采樣開始于秋、冬季節,這期間養殖動物傳染病發病率較低,治療疾病所需的抗生素用量較少.這些原因可能導致樣品中抗生素殘留量較低.大量研究表明,SAs、FQs 和TCs 是畜禽糞便中主要的抗生素[5,14,21].同樣地,本研究供試牛糞、豬糞和雞糞中均檢測到了SAs、FQs 和TCs 殘留,但其檢出率和殘留量存在明顯的差異.其中,畜禽糞便中SAs 檢出率較低,其在牛糞中的檢出率僅有6.7%.雞糞中SAs檢出率較高,為 53.3%,且檢出總含量最高,為72.43μg/kg.SAs 只含有苯胺基和酰胺基兩個離子型官能團,易發生水解[19];并且SAs 在畜禽糞便中的吸附作用較弱,具有較高的移動性[22].本研究中,牛糞含水率較高,因此,SAs 更容易隨著牛的尿液進入污水管網.此外,SAs 主要用于治療畜禽細菌感染疾病,在治療雞群細菌性疾病的用量較大[23],同時,雞糞對抗生素的吸附固持能力要大于豬糞和牛糞[22].這就導致更多的SAs 在雞糞中殘留.FQs 和TCs 在3 種糞便中的檢出率高,分別為46.15%～61.54%和75%～100%.但其在糞便中殘留總含量分別為 26.26～37.1μg/kg和24.48～34.81μg/kg,低于SAs在糞便中殘留總含量(除牛糞).這表明,在畜禽養殖過程中存在使用多種類、低劑量FQs 和TCs 的情況.與SAs 相比,由于FQs 和TCs 自身結構使其在畜禽糞便上的吸附能力更強[22],這也是糞便中FQs 和TCs 檢出率高的原因之一.

本研究中,32d 堆肥后,3 種糞便中抗生素檢出率明顯下降.SAs、FQs 和TCs 的檢出率分別由40.6%、53.1%和53.1%下降到28.1%、31.2%和25%.這表明,好氧堆肥有利于糞便中抗生素的去除.由于不同類型的抗生素具有不同的化學結構,導致其在堆肥過程中消減機制因其種類不同而存在顯著差異[21].其中,SAs 檢出率最低,除雞糞中ST2 消減速率較慢外,其余SAs 去除率均高達90%.如前所述,SAs 結構簡單和高移動性使其在堆肥過程中更容易受到含水率、溫度等堆肥過程的影響而發生快速消減.FQs 和TCs 在糞便堆肥過程中降解較慢,其降解半衰期是SAs 的2 倍.對于FQs,PEF 在3 種堆肥過程中去除率均高于75%,表明好氧堆肥有利于PEF 的去除.但對于大多數FQs 來說,其在不同糞便堆肥中的去除率差異較大.以牛糞堆肥為例,32d 堆肥后,除SAR 和OFL 外,其他6 種FQs 去除率均在70%以上.與NOR 相比,OFL 的活化能較高,熱穩定性能好,分解率較低[24].另一方面,NOR分子量較小,結構相對簡單,易被微生物降解[25].32d 堆肥后,TCs 仍可以在豬糞和牛糞中100%檢出.與SAs 和FQs 相比,TCs 分子中含有較多的極性/離子型官能團,如OTC 含有6 個-OH、2 個-C=O、1個-CONH2和1個-N(CH3)2,導致其在畜禽糞便中的吸附能力較強,難以通過生物作用完全去除[22].盡管如此,TCs 在3 種糞便堆肥中的去除率仍可達到60%以上,這與劉志平等研究相似[26].這表明好氧堆肥有利于降低糞便中TCs 的殘留,但不能完全將其去除.

堆肥過程中,抗生素含量的降低并非完全是由微生物降解和抗生素本身結構性質所致.畜禽糞便理化性質、處理工藝以及抗生素初始濃度也是影響堆肥過程中抗生素含量變化的重要因素[14,18,21].大量研究認為,堆肥溫度是抗生素去除的重要因素.抗生素的去除主要發生在升溫及高溫階段,其去除率隨著堆體溫度的升高而提高[14,27].本研究中,堆肥第3d 堆體溫度已達到55℃[17],由圖3 可知,堆肥第4d時,3 種糞便中抗生素殘留量迅速下降.這表明堆肥溫度的升高有利于抗生素的去除.與上述因素相比,含水率是影響糞便堆肥中抗生素去除率的最重要的因素.研究發現,低含水率(53.27%)條件下雞糞堆肥中各類抗生素殘留含量顯著高于68.11%含水率條件(圖2).Zhang 等[13]在商業堆肥過程中發現,堆體含水率的降低導致四環素的去除率較低.研究表明,初始含水率過低會導致堆肥初期缺水,抑制微生物代謝,并且由于孔隙率高導致堆體熱損失過大,形成生物不穩定產物[28-29].然而,研究也表明,過高的含水率會降低堆肥孔隙度,抑制氧氣傳質,使堆體缺氧,導致分解速度減慢.同時,高初始含水率還會導致游離水以滲濾液的形式排出,造成肥料的養分損失,也會造成環境負擔和二次污染[28-30].因此,合適的含水率有利于促進堆肥過程中抗生素的消減.本試驗含水率設置范圍較窄,因此,在未來的研究中應進一步研究含水率對堆肥過程中抗生素及其他有機污染消減的影響.

本研究在堆肥過程中對堆體進行翻堆與不翻堆處理發現,相比于不翻堆,堆肥32d 時1 次/2d 翻堆處理組中FQs、TCs 和總抗生素殘留率分別由25.52%、27.99%和16.48%降低至0、0 和0.這表明,堆肥過程中通過翻堆可以提高抗生素的去除率.同樣地,韓進等[17]研究畜禽糞便堆肥過程中雌激素降解時,發現翻堆也可顯著提高雌激素的降解效率.而Wallace 等[31]對牛糞厭氧堆肥中TCs 去除效果的研究發現,厭氧堆肥條件下TCs 的去除率僅有29%.供氧不足會抑制微生物活性,阻礙生物過程[32].翻堆可以滿足堆體中的好氧微生物對氧氣的需求,有利于好氧微生物的繁殖和活動,從而促進對抗生素等有機物的分解[21].但是,過度的翻堆頻率不利于維持堆體溫度,且會加速堆肥過程中水分的蒸發和NH3的生成,造成氮素損失,減低堆肥產品肥效和抗生素去除效率[21,33].本試驗研究發現,盡管2 次/d 和1 次/2d的翻堆頻率均能完全去除糞便中抗生素,但1 次/2d的翻堆頻率下抗生素的去除速率常數明顯高于2 次/d 的翻堆頻率.這表明1 次/2d 的翻堆頻率更有利于抗生素的快速去除.

綜上,好氧堆肥條件有利于促進畜禽糞便中抗生素及其他痕量污染物的去除.然而,在堆肥過程中,由于糞便性質及污染物性質、含量、工藝條件的差異,使得部分抗生素難以完全去除,仍有大量抗生素殘留在糞肥中.Zhou 等[5]對市售有機肥中抗生素進行調查發現,有機肥中有大量四環素殘留,殘留量高達1920μg/kg.這些殘留的抗生素等藥物經糞肥還田在土壤中積累會對生態環境造成一定的負面影響.Shen 等[34]發現,抗生素長期暴露下會提高生菜-土壤系統中水平基因轉移潛力,增加抗生素抗性基因的相對豐度.因此,在堆肥過程中需根據堆肥原料制定適合的堆肥條件(含水率、翻堆頻率、延長堆肥時間等)以提高抗生素及痕量污染物的去除效果、提高糞便有機肥肥效,實現畜禽糞便的無害化、資源化利用.

4 結論

4.1 畜禽糞便中均存在SAs、FQs 和TCs.3 種糞便中抗生素總含量大小順序依次為:雞糞(123.09μg/kg)>豬糞(107.32μg/kg)>牛糞(67.76μg/kg).

4.2 開放式好氧堆肥可有效去除糞便中的抗生素殘留,其中SAs、FQs、TCs 和總抗生素的去除率分別可達94.47%、62.81%、64.69%和78.09%.

4.3 堆肥過程中初始含水率控制在68.11%并采用1 次/2d 的翻堆頻率可加快糞便中抗生素殘留的消減.