水合氧化物對抗生素抗性基因水平轉移的影響

李曉佳,劉 思,王婷婷,秦 超,胡小婕,高彥征(南京農業大學,土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

抗生素抗性基因(ARGs)是一種新型環境污染物,普遍存在于水、土壤、大氣中.其在環境中的廣泛傳播,易導致多重耐藥致病菌產生,進而危害人類健康.ARGs 在環境中傳播的主要方式包括垂直基因轉移和水平基因轉移.由于水平基因轉移可以實現基因在同種和不同種屬菌株間的傳遞,因此對于ARGs 在環境中的擴散與傳播具有更加重要的影響,這也是細菌獲得耐藥性的主要方式之一[1-2].ARGs水平轉移方式主要有接合、轉化和轉導.其中,接合和轉導針對細胞內的DNA,而轉化則允許細菌同化胞外的DNA.與胞內DNA 相比,胞外DNA 更易受到外部環境影響,因此,了解ARGs 的轉化過程對于控制它在環境中的傳播具有重要意義.

土壤是人類生產、生活的重要資源,也是ARGs主要受納體之一.ARGs 在土壤中的傳播與擴散受到多種生物和非生物因素影響.現有研究發現環境中的污染物如離子液體[3]、重金屬[4]、有機化合物[5]等均能對ARGs 的轉移產生影響.金屬氧化物是土壤礦物的重要組成部分,主要包括鐵氧化物、鋁氧化物、錳氧化物等,水合形式是其存在的重要形式.在高度風化的土壤中,水合氧化物最高可占據土壤總重的50%[6].這些土壤氧化物在不斷變換的地表環境中長久地經歷各種復雜過程,通常具有比表面積大、表面性質活潑、帶有兩性電荷等性質,對于許多物質具有很強的吸附能力,擁有與土壤中重金屬離子、有機污染物、DNA、細菌等多種生物和非生物物質相互作用的潛能,這也為其影響ARGs 水平轉移提供了可能.

一方面,土壤水合氧化物能夠與DNA 發生結合.由于脫氧核糖-磷酸鏈處于DNA 雙螺旋結構外側,環境中DNA 分子表面通常呈現負電性.而土壤水合氧化物多攜帶正電荷,其具有與DNA 相互結合的可能.現今,學者們在此方面已經有所發現.Cai等[7]和Saeki 等[8]分別發現針鐵礦和三水鋁石對鮭魚精DNA 具有不同程度的吸附能力,吸附量分別達到3.5mg/g與5.4mg/g.另一方面,土壤水合氧化物活潑的表面性質,使其具有易吸附于細菌表面的特性.其可通過靜電作用、化學成鍵、配位鰲合、離子交換等方式結合于宿主細胞包膜上,引起細菌生理生化改變,具體表現為細菌胞內活性氧自由基(ROS)水平、細胞膜通透性、細胞形態、相關mRNA表達情況等發生變化.已有研究表明,三水鋁石可通過靜電作用、化學成鍵作用黏附于細菌表面[9];針鐵礦能夠促使致病菌胞內ROS 大量生成,不僅抑制了其蛋白質合成,還破壞了細胞膜完整性,進而顯著抑制細菌生長[10].由此可見,土壤中水合氧化物可與細菌相互作用并影響其生理生化與存活.結合土壤水合氧化物與DNA 的相互作用,不難窺見土壤水合氧化物充分具有影響ARGs 以轉化形式進行水平轉移的可能性.

基于此,本文以負載于pUC19 質粒的氨芐青霉素抗性基因為代表性胞外ARGs,以大腸桿菌作為受體細胞,研究土壤中比較常見、具有代表性的兩種水合氧化物(水合鋁氧化物與水合錳氧化物)對ARGs轉化的影響.同時,分別分析了水合氧化物與DNA及受體細胞的相互作用,以揭示其影響ARGs 轉化的機制.該研究將有助于增進人們對環境中抗生素耐藥性傳播的認識.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

四水硝酸錳( Ⅱ)、無水氯化鋁購于南京晶格化學科技有限公司.抗性質粒pUC19 購于Takara 生物科技(中國)有限公司,濃度為0.5μg/μL,被溶解于含有10mmol/L Tris-HCl(pH 為8)及1mmol/L EDTA 溶液中.革蘭氏陰性菌大腸桿菌E. coli DH5α 感受態細胞(Trelief? 5α Chemically Competent Cell)購于擎科生物科技(北京)有限公司.氯化鈉(NaCl)、蛋白胨、酵母提取物(生物可用級別)購自于Oxoid(英國)有限公司.瓊脂粉、氨芐西林鈉鹽購自于Solarbio 科技(中國)有限公司.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)購自凱基生物技術股份(南京)有限公司.超純水通過Milli-Q 梯度系統獲得(電導率18.2M?×cm)(貝德福德,MA,美國),此水被用于本文所有實驗.

1.2 研究方法

1.2.1 水合氧化鋁與水合氧化錳合成 分別將5g NaOH、5.56g AlCl3固體加入250mL 水中制得0.5mol/L NaOH 溶液和0.5mol/L AlCl3溶液.然后將NaOH 溶液加入AlCl3溶液中,快速攪拌,并調節pH=7.0.室溫陳化48h,離心,棄去上層清液.用去離子水反復漂洗離心6 次,至上層清液pH=7.0,沉淀透析16h 以除去多余離子.洗滌后的沉淀物在25℃風干,用研缽和研杵輕輕研磨,過60 目篩并收集粉末.

分別將18.83g Mn(NO3)2·4H2O、7.95g KMnO4、4g NaOH 固體溶解于250mL 水中配成0.3mol/L Mn(NO3)2溶液、0.2mol/L KMnO4溶液和0.4mol/L NaOH 溶液.將KMnO4溶液緩緩加入NaOH 溶液中制得堿性KMnO4溶液,再將Mn(NO3)2溶液與堿性KMnO4溶液充分混合,此時Mn(NO3)2、KMnO4和NaOH 混合的摩爾比為3:2:4.所得沉淀清洗數次并重新分散于NaNO3溶液中,調節pH 值等于7,老化16h.用去離子水反復漂洗離心,沉淀透析16h,以除去多余離子.洗滌后的沉淀物在25℃風干,用研缽和研杵輕輕研磨,過60 目篩并收集粉末.

1.2.2 水合氧化物組成及表面性質 本實驗采用X 射線衍射儀(XRD;布魯克D2PHASER)對樣品進行分析.實驗采用銅靶,掃描速度2°/min,掃描角度0～80°.采用掃描電鏡(SEM)觀察樣品的表面形貌和顆粒尺寸.將樣品置于銅網并做噴金處理,后用SEM(S-3400N,Hitachi,日本)進行觀察.以水為分散劑,采用納米粒度及 Zeta 電位分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90 )測定兩種水合氧化物的粒徑大小及Zeta 電位.

1.2.3 ARGs 轉化實驗 將兩種水合氧化物配制為1g/L 儲備液并超聲、分散1h,后將儲備懸浮液稀釋至系列濃度以備后續實驗.將25ng pUC19 質粒加入上述水合氧化物稀釋液中,并將混合物轉移至裝有100μL E. coli DH5α 感受態細胞的離心管中(水合氧化物終濃度為0～200mg/L),25℃、200r/min 條件下反應5h.每個處理設置3 個平行.隨后將所有裝有質粒-感受態細胞混合物的離心管輕輕搖勻,取出后將其置于37℃水浴中5min,并即刻放入冰水浴5min.最后向離心管中加入LB 液體培養基,使最終體積為1mL,在37℃、轉速150r/min 條件下復蘇培養1h.

采用抗生素篩選平板進行轉化效率/頻率測定.將100μL 上述菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基平板上,以確定轉化子個數.將另一份100μL 上述菌液涂布于未含任何抗生素平板上,以確定宿主細胞存活個數.涂布完成后,將平板正向放置30min,隨后倒置放入37℃培養箱中培養20h.最后,計算平板菌落數以確定轉化子個數.

為考察水合氧化物析出離子的影響,將 0～200mg/L 水合氧化物懸液加入無菌水,避光、置于25℃、200r/min 搖床中5h,離心使水合氧化物與上清液分離.利用電感耦合等離子體發射光譜(ICP-OES)檢測上清液中離子種類及濃度.取上清液與25ng 質?；旌?并轉移至感受態細胞懸液,作用5h 后,按上述步驟進行轉化實驗.

按下列公式計算ARGs 轉化效率、轉化頻率:

將所得數據通過Origin 軟件作圖以表明可存活的大腸桿菌數、轉化子、轉化效率、轉化頻率隨水合氧化物濃度增加的變化.并采用SPSS 軟件進行單因素方差分析(ANOVA)、LSD多重比較法和Duncan新復極差法對各變量進行顯著性檢驗,以0.05 為顯著性水平,比較各組不同濃度的水合氧化物作用下存活的大腸桿菌數、轉化子、轉化效率、轉化頻率與對照組之間的顯著性差異,并在圖中進行標注.

1.2.4 水合氧化物與DNA 的相互作用 利用原子力顯微鏡(AFM)觀察質粒與兩種水合氧化物結合前后的形態.將100ng質粒與200mg/L的水合氧化物混合制成200μL 混合體系,在25℃條件下反應5h 后,將10uL 樣品溶液滴至云母片表面,并在25℃下使其自然干燥.質粒樣品圖片通過 Multimode 8AFM(Bruker,德國)原子力顯微鏡獲得.

分析水合氧化物與質粒DNA 結合位點.將2mg質粒DNA 與100mg/L 水合氧化物混合制成5mL 混合體系,在25℃條件下反應5h后,放入冷凍干燥儀進行干燥.所獲樣品利用Nicolet NEXUS870 傅里葉紅外光譜(FTIR)儀獲取其對應光譜,并通過譜圖分析兩者結合位點.

1.2.5 水合氧化物對宿主細胞膜通透性的影響大腸桿菌-水合氧化物(0～200mg/L)混合液在25℃條件下反應5h 后,與PI 染料進行混合,隨后在25℃、黑暗環境中孵育30min.最后,細菌發出的紅色熒光由流式細胞儀(BD Accuri C6)進行測定,測量時激發波長設定為480nm,每組共檢測10000 個細胞,并使用Flowjo 軟件對數據進行分析.

采用 SPSS 軟件進行單因素方差分析(ANOVA)、LSD 多重比較法和Duncan 新復極差法對各變量進行顯著性檢驗,以0.05 為顯著性水平,比較不同水合氧化物濃度下細胞膜通透性水平的顯著性差異,并采用 Origin 軟件作圖.

2 結果與討論

2.1 水合氧化物材料表征

2.1.1 XRD 表征 對實驗制得的水合氧化鋁和水合氧化錳進行XRD 表征,XRD 譜圖如圖1(a)所示.水合氧化鋁分別在衍射角為40.0°和65.6°處顯示了兩個較為明顯的衍射峰,該譜圖與文獻報道的水合氧化鋁出峰位置一致[11].水合氧化錳在衍射角為37.3°和66.7°時均出現了衍射峰,該樣品的衍射峰峰形完整、窄而尖銳、相對強度較高,未觀察到其它明顯雜質衍射峰出現,該譜圖符合水合氧化錳(δ-MnO2)特征[12].

圖1 水合氧化物表征Fig.1 Characterization of hydrous oxides

2.1.2 水合氧化物基本形貌表征 現有研究表明,環境溫度、作用時間和pH 值等多種因素均能夠對水合氧化鋁的形成速度和種類產生影響[13-17].已有研究發現,當溫度上升至150℃時,其水合產物中薄水鋁石(AlOOH)比三水鋁石更加穩定[17].不同水熱條件下合成的水合氧化鋁類型相異,即亞穩態的氧化鋁多晶在水介質中可發生相變[18-21],目前已知的水合氧化鋁結晶相至少有7 種[22].類似地,水合氧化錳的形成也與不同的反應時間和環境條件密切相關.李娜[23]指出,氧化錳存在至少30 種不同的晶體結構,不同的反應條件下可制備出晶格結構、表面形貌、比表面積不同的氧化錳類型.其中,δ-MnO2是典型的水合氧化錳晶體,其層間距中除了堿金屬離子之外,還含有封閉的水層.由此可見,不同水合方式與水合條件下形成的水合氧化物形貌也各有不同.在本實驗條件下,水合氧化鋁多為較小塊狀,具有一定的不規則性;而水合氧化錳則呈現為較為均勻的顆粒狀(圖1(b)).

2.1.3 粒徑及Zeta 電位表征 對實驗制得的水合氧化物進行粒徑及Zeta 電位表征,結果如表1 所示.水合氧化鋁的粒徑為(449.43±13.86)nm,水合氧化錳的粒徑為(350.27±2.38)nm.此外,Zeta 電位反映了顆粒表面電荷種類和密度,是衡量懸浮液體系中膠粒凝聚穩定性的重要指標.兩種水合氧化物均顯示為正電位,Zeta電位相近且均不超過30mV,這表明顆粒間電荷排斥力較小,在水中較易發生團聚.多分散系數(PDI)可反映粒徑分布的均一程度,PDI 指數越小,則樣品粒度分布越均勻.通過分析PDI 數據可知(表1),實驗所制的水合氧化鋁PDI 較高(PDI>0.3),即分子量分布較寬,均勻性較差;相反,水合氧化錳的分子量分布較為均勻,均一性更好,這與SEM 表征結果一 致.

表1 水合氧化物的粒徑及Zeta 電位Table 1 Particle sizes and Zeta potentials of hydrous oxides

2.2 水合氧化物對ARGs 水平轉移的影響

為探究水合氧化物對ARGs 水平轉移的影響,將土壤礦物材料配置成系列濃度(0～200mg/L)溶液進行轉化實驗,結果如圖2 所示.總體上,兩種水合氧化物均未顯著抑制大腸桿菌存活,可培養的大腸桿菌個數僅在100 和200mg/L 水合鋁氧化物處理下略有降低.兩種水合氧化物均導致轉化子個數、轉化效率和轉化頻率降低.與對照組ARGs轉化頻率相比,50mg/L 水合氧化鋁處理下轉化頻率開始出現顯著變化,而≥2.5mg/L 水合氧化錳即可顯著抑制ARGs 轉化.在200mg/L 水合氧化鋁處理下,轉化效率和轉化頻率分別降至 3.39×104CFU/μg 和0.006,其中轉化頻率相比于對照組降低了79.44%.在200mg/L 水合氧化錳處理下,轉化效率和轉化頻率分別降至33.11×104CFU/μg 和0.014,其中轉化頻率相比于對照組降低了57.64%.這表明,水合氧化鋁和水合氧化錳均抑制了ARGs轉化過程.

圖2 水合氧化物對ARGs 轉化的影響Fig.2 The effect of hydrous oxides on the transformation of ARGs

2.3 水合氧化物析出金屬離子及其對ARGs 水平轉移的影響

現有研究表明,土壤水合氧化物溶于水時,可能會析出一定量的金屬離子.而土壤中游離態金屬離子會對同一環境中的ARGs 污染產生影響.一方面,重金屬(Cu2+、Ag+、Cr6+、Zn2+、Cd2+)[4,24-25]等可通過導致細胞內ROS 產生、增加細胞膜通透性、改變mRNA 基因表達等機制促進ARGs 水平轉移;另一方面,重金屬可以通過協同選擇和交叉選擇使ARGs 豐度提升[26].

為明確水合氧化物析出的金屬離子是否是其抑制ARGs 轉化的原因,本實驗首先測定了0～200mg/L 水合氧化物析出的離子濃度.結果表明(圖3(a)),在供試范圍內,隨著水合氧化鋁濃度的升高,其析出的Al(III)呈現明顯上升趨勢,200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)高達3299.38μg/L.而對于水合氧化錳,隨著其濃度升高,溶液中Mn(II)濃度總體上在0～4μg/L 區間內上下浮動,幾乎可以忽略不計.

圖3 水合氧化物析出離子及其對轉化的影響Fig.3 Metal cations released from hydrous oxides and its impact on transformation of ARGs

有學者指出,水溶液中Al(III)可引起DNA 團聚[27],這可能會降低游離ARGs 進入受體細菌胞內的效率.為進一步探查析出Al(III)對ARGs 轉化的影響,收集0～200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)溶液進行轉化實驗.如圖3(b)所示,隨著Al(III)濃度的升高,可培養大腸桿菌數增加;相反的,ARGs 轉化子個數、轉化效率和轉化頻率呈現下降趨勢.在200mg/L 水合氧化鋁析出的Al(III)處理下,轉化效率和轉化頻率由18.72×104CFU/μg 和0.010 分別降至2.83×104CFU/μg 和0.001,其中轉化頻率相比于對照組降低了88.15%.由此可見,水合氧化鋁析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平轉移的因素之一.本實驗結果表明,Al(III)并未抑制大腸桿菌存活,其對ARGs轉化的影響并非通過抑制大腸桿菌細胞活性導致,具體機理仍需結合進一步實驗分析.

2.4 水合氧化物與抗性質粒的相互作用

為進一步探究水合氧化物與DNA 的相互作用,通過AFM 觀察質粒DNA 與高濃度(100mg/L)水合氧化物溶液作用前后形態變化.如圖4(a)所示,未添加水合氧化物的對照組中DNA 呈絲狀、以獨立個體形式存在.而在添加100mg/L 水合氧化物的處理組中,質粒與水合氧化物發生交纏,形成大尺寸結合物(直徑約為60～80nm;圖4(a)中的亮白點),難以觀察到單個絲狀DNA.這些大尺寸質粒-水合氧化物結合體導致抗性質粒及其攜帶的ARGs 難以進入胞內,進而阻礙了ARGs 的水平轉移.除水合氧化物本身與DNA 的結合外,水合氧化鋁析出的Al(III)也會導致質粒發生團聚(圖3(a))[27].

圖4 水合氧化物與質粒DNA 的相互作用Fig.4 Interaction between hydrous oxides and plasmid DNA

通過分析水合氧化物暴露前后pUC19 質粒的紅外光譜變化,確定水合氧化物在質粒上的結合位點.圖4(b)中的結果進一步證實了DNA 與水合氧化物之間發生了相互作用.對于未與水合氧化物反應的質粒DNA,可識別的紅外光譜特征峰對應于磷酸基團中P-O 拉伸振動位于1061.3cm-1,PO2-不對稱拉伸振動位于 1228.7cm-1[28].位于 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1的振動峰分別歸屬為質粒堿基胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)[28].與對照組相比,加入水合氧化鋁后的 DNA,在1061.3cm-1處的吸收峰偏移到了1058.5cm-1,而加入水合氧化錳后的DNA 在該處則沒有發生吸收峰的偏移;水合氧化鋁和水合氧化錳加入后,DNA 在1228.7cm-1處的振動峰分別偏移到了1223.0 和1230.1cm-1,這表明兩種水合氧化物都可通過磷酸基團與DNA 結合.

而加入水合氧化物后的DNA 在1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1這4 處的振動峰也發生了不同程度的偏移.其中,加入水合氧化鋁后 DNA 在1481.9cm-1處的振動峰沒有偏移;而在1604.1,1653.5,1688.9cm-1處的振動峰則分別偏移到了 1601.6,1646.4,1686.4cm-1.這表明,pUC19 質粒還可通過堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤與水合氧化鋁發生結合,而胞嘧啶與水合氧化鋁未發生結合.而加入水合氧化錳后的 DNA, 在 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1處的振動峰分別偏移到了1483.3,1601.6,1650.6,1693.8cm-1,這表明,pUC19 質?？赏ㄟ^4 種堿基與水合氧化錳發生結合.

2.5 大腸桿菌細胞膜通透性的變化

除了與DNA 發生相互作用外,水合氧化物也具有與宿主細胞發生相互作用的潛能.現有研究表明,金屬氧化物以及金屬離子可通過改變宿主細胞膜通透性、引起細胞膜損傷、影響胞內ROS生成等,使ARGs 轉化頻率發生不同程度的改變.例如,納米Al2O3可造成大腸桿菌E. coli DH5α 細胞膜形成納米孔洞,有助于攜帶ARGs 的質粒pBR322 進入細胞并表達其抗性[29].在本實驗中,水合氧化物及其析出的金屬離子具有影響宿主細胞膜通透性的理論可能.因此,本實驗采用PI 染色法、借助流式細胞儀進一步探究了水合氧化物作用下宿主細胞膜發生的變化.

熒光染料PI 是一種可對DNA 染色的細胞核染色試劑,當細菌細胞通透性發生改變,PI 染料可穿過細胞膜嵌入胞內DNA 雙鏈釋放紅色熒光,該紅色熒光強度可反映細胞膜通透性的大小.在本實驗中,當大腸桿菌細胞膜通透性提升時,細菌發出的熒光強度則更強,其對應的出峰位置向右偏移;當大腸桿菌細胞膜通透性減弱時,其對應的出峰位置向左偏移.不同濃度水合氧化物作用下細胞膜通透性變化如圖5 所示.在0～100mg/L 水合氧化鋁作用下,隨著水合氧化鋁濃度升高,宿主細胞發出的熒光強度并未出現顯著變化,對應出峰位置未發生明顯偏移,即細胞膜的通透性未顯著改變,僅在200mg/L 的水合氧化鋁作用下宿主細胞的熒光強度有所上升.然而,水合氧化錳暴露下細胞熒光強度顯著下降,對應出峰位置左移,細胞膜通透性變弱.減弱的細胞膜通透性將降低宿主對ARGs 的攝入,進而使ARGs 水平轉移頻率降低(圖2(b)).

圖5 水合氧化物對宿主細胞膜通透性的影響Fig.5 The effect of hydrous oxides on the membrane permeability of recipient cells

值得注意的是,水合氧化錳對宿主細胞膜通透性產生抑制效應的原因可能與其在水溶液中的團聚有關,這些團聚體易包裹細菌,阻礙細菌與外界環境的有效接觸,增強細胞膜的屏障作用,進而導致細胞膜通透性減弱.對于水合氧化鋁顆粒,盡管其團聚體也在一定程度上占據了細胞膜的部分位置,但其析出的濃度較高的Al(III)被證明可以引發細胞內ROS 過量產生[30],這會導致細胞膜通透性提升,進而可能抵消了由水合氧化鋁團聚體包裹引發的對宿主膜通透性的抑制效應.因此,對于水合氧化鋁,未觀察到顯著的膜通透性變化.

3 結論

3.1 水合氧化鋁與水合氧化錳對胞外ARGs 水平轉移均具有抑制作用,且抑制程度受其濃度調控.200mg/L 水合氧化鋁處理下,轉化頻率相比于對照組降低了79.44%;在200mg/L 水合氧化錳處理下轉化頻率相比于對照組降低了57.64%.

3.2 水合氧化鋁析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平轉移的因素之一.200mg/L 水合氧化鋁析出Al(III)高達3299.38 μg/L,該濃度的Al(III)作用下,轉化頻率相比于對照組降低了88.15%.而水合氧化錳未有明顯Mn(II)析出.

3.3 兩種水合氧化物均對質粒DNA 具有吸附作用,能夠引發大尺寸DNA-水合氧化物結合體的形成,這是其抑制ARGs 水平轉移的原因之一. pUC19 質?？赏ㄟ^磷酸基團以及堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤與水合氧化鋁發生結合;通過磷酸基團以及4種堿基與水合氧化錳發生結合.

3.4 水合氧化錳顯著降低了宿主細胞膜通透性,這也是其抑制ARGs 水平轉移的因素之一.