豆蔻明對肺纖維化的治療作用及機制

張娟 黨連生

[摘要]?目的?觀察豆蔻明（Cardamonin，CDN）對肺纖維化小鼠的作用，并探究其對轉化生長因子-β1（transforming?growth?factor-β1，TGF-β1）/smad信號通路的影響。方法?將小鼠隨機分為生理鹽水（Sham）組、博萊霉素（Bleomycin，BLM）組、豆蔻明低劑量（low?dose?of?Cardamonin，CDN-L）組、豆蔻明中劑量（medium?dose?of?Cardamonin，CDN-M）組、豆蔻明高劑量（high?dose?of?Cardamonin，CDN-H）組、地塞米松（dexamethasone，DXM）組；單次氣管注射BLM誘導肺纖維化，計算肺指數；酶聯免疫吸附法測血清腫瘤壞死因子（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）水平；試劑盒測肺組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量，蘇木精-伊紅、馬松染色觀察肺炎癥程度及纖維化情況，RT-PCR法檢測肺組織TGF-β1/smad信號通路相關基因表達情況。結果?與Sham組相比，BLM組小鼠肺指數、Szapiel評分、Ashcroft?評分明顯升高（P<0.05），肺部炎癥程度和纖維化程度嚴重。血清中TNF-α含量升高（P<0.05）、肺組織HYP水平升高（P<0.05），TGF-β1[（1.02±0.21）vs.（3.25±?0.14）]、smad2[（1.00±0.05）vs.（1.63±0.09）]、smad3[（1.00±0.06）vs.（1.82±0.07）]、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth?muscle?actin，α-SMA）[（1.00±0.10）vs.（2.15±0.10）]mRNA表達升高（P<0.05），上皮-鈣黏蛋白（E-Cadherin）[（1.01±0.16）vs.（0.57±0.09）]mRNA水平降低（P<0.05）。CDN-M、CDN-H干預可減低小鼠肺指數，減輕炎性和肺纖維化，降低TNF-α、HYP水平（P<0.05），同時下調肺纖維小鼠肺組織中TGF-β1、smad2、smad3、α-SMA?表達，上調E-Cadherin表達。CDN-L無明顯治療效果，CDN-H治療作用與DXM相似。結論?CDN可能通過TGF-β1/Smad通路介導上皮-間充質轉化而發揮抗纖維化作用。

[關鍵詞]?豆蔻明；肺纖維化；TGF-β1/smad信號通路；上皮間質轉化

[中圖分類號]?R?285.5??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.019

Therapeutic?effect?and?mechanism?of?Cardamonin?on?pulmonary?fibrosis

ZHANG?Juan1，?DANG?Liansheng2

1.Department?of?Geriatrics，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Baotou?Medical?College，?Baotou?014010，?Inner?Mongolia，?China;?2.Department?of?Geriatrics，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Baotou?Medical?College，?Baotou?014010，?Inner?Mongolia，?China

[Abstract]?Objective?To?observe?the?effect?of?Cardamonin?（CDN）?on?pulmonary?fibrosis?in?mice，?and?explore?the?effect?of?CDN?on?transforming?growth?factor-β1?（TGF-β1）/Smad?signaling?pathway.?Methods?The?mice?were?grouped?into：?Sham?group，?Bleomycin（BLM）?group，?low?dose?of?Cardamonin?（CDN-L）?group，?medium?dose?of?Cardamonin?（CDN-M）?group，?high?dose?of?Cardamonin?（CDN-H）?group?and?Dexamethasone?（DXM）?group.?Injectioning?of?BLM?induce?pulmonary?fibrosis?in?mice，?the?lung?index?was?measured.?Enzyme-linked?immunosorbent?assay?kit?measured?serum?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α）?levels，?the?hydroxyproline?（HYP）?content?in?lung?tissue?was?detectioned?by?kits.?Pathological?changes?were?observed?by?Htoxylin?Eosin?and?Masson?staining，?and?the?level?of?genes?related?to?TGF-β1/smad?signaling?pathway?was?detected?by?RT-PCR.?Results?Compared?with?the?Sham?group，?the?lung?index，?Szapiel?score?and?Ashcroft?score?of?the?BLM?group?were?significantly?increased?（P<0.05），?and?the?degree?of?pulmonary?inflammation?and?fibrosis?was?more?severe.?The?levels?of?TNF-α?in?serum?and?HYP?in?lung?tissue?were?increased?（P<0.05），?lung?tissue?TGF-β1[（1.02±0.21）vs.（3.25±0.14）]，smad2[（1.00±0.05）vs.（1.59±0.20）]，smad3?[（1.00±0.06）vs.（1.59±0.20）]，?α-smooth?muscle?actin?（α-SMA）[（1.00±0.10）vs.（2.15±0.10）?and?E-Cadherin?[（1.01±0.16）?vs.（0.57±?0.09）]?mRNA?level?decreased?（P<0.05）.?The?intervention?of?CDN-M?and?CDN-H?could?decrease?the?lung?index，?alleviate?the?inflammation?and?Pulmonary?fibrosis，?and?decrease?the?levels?of?TNF-α?and?HYP?（P<0.05）.?The?expression?of?TGF-β1，?smad2，?smad3?and?α-SMA?in?lung?tissue?of?mice?with?pulmonary?fibrosis?was?down-regulate.?CDN-L?had?no?significant?effect，?while?CDN-H?had?similar?effects?to?DXM.?Conclusion?Cardamonin?may?play?an?anti-fibrotic?role?by?mediating?epithelial-mesenchymal?transition?through?the?TGF-β1?/Smad?pathway.

[Key?words]?Cardamonin;?Pulmonary?fibrosis;?TGF-β1/Smad;?Epithelial-mesenchy?mal?transition

特發性肺纖維化（idiopathic?pulmonary?fibrosis，IPF）是一種慢性進展并最終致命的疾病，其特征是肺間質纖維化，引起肺結構破壞，最終導致進行性呼吸困難、氣體交換障礙和死亡。IPF男性發病率稍高，診斷的平均年齡為65～70歲，患病率隨著年齡的增長而急劇上升，診斷后平均生存期3～6年，病死率為17.8%[1-2]。目前尚無能夠治愈IPF的藥物，吡非尼酮和尼達尼布可改善輕、中度IPF患者的肺功能，但不能改善生存率或生活質量，肺移植是治療終末期IPF患者的主要手段，但因其缺乏供體及術后排斥反應，而被限制其的臨床應用。因此，急需為肺纖維化治療提供新方案。肺纖維化典型特征是轉化生長因子-β（transforming?growth?factor-β1，TGF-β1）信號上調，Smad介導的TGF-β信號途徑在IPF過程中有著誘導上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal?transition，EMT）的作用。通過抑制TGF-β1/Smad信號通路介導的EMT可有效改善肺纖維化[4-5]。豆蔻明（Cardamonin，CDN）是一種天然黃酮化合物。研究表明，CDN對急性肺損傷具有保護作用，可以降低小鼠肺組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）水平[6]。此外，在動物水平，還可以通過TGF-β/Smad信號通路抑制α-平滑肌蛋白（α-smooth?muscle?actin，α-SMA）表達，促進上皮-鈣黏蛋白（E-Cadherin）的表達來抑制腎間質纖維化，但目前關于CDN肺纖維化的作用及其機制所知甚少[7]。

綜上所述，本研究通過觀察CDN對小鼠肺纖維化的具體作用，探討TGF-β1/Smads信號通路在肺纖維化的作用機制。

1??材料與方法

1.1??實驗動物

48只清潔級10周齡C57BL/6小鼠，雄性，體質量24～28?g，購于中國食品藥品檢定研究院，精神及活動正常。動物實驗包頭醫學院第一附屬醫院動物倫理委員會批準（倫審字2023007號）。動物實驗生產許可證號：SCXK（京）2022-0002。

1.2??試劑與藥物

硫酸博來霉素（批號：F2221238，上海晶純生化科技股份有限公司，規格5mg）；醋酸地塞米松片（國藥標準字H41021038，遂成藥業股份有限公司，規格0.75mg）；CDN（批號：21101510，四川維克奇生物科技有限公司，規格200mg）；腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）；酶聯免疫試劑盒（批號：MM-0132M1，江蘇酶免實業有限公司，規格96T）；HYP檢測試劑盒（批號：20220714，南京建成生物工程研究所，規格48T）；總RNA提取試劑盒（批號：R1100北京索萊寶科技有限公司，規格100ml）；蘇木精-伊紅、馬松染色試劑盒（批號：G1120、G1340北京索萊寶科技有限公司，規格100ml）；HiFiscript?gDNA?Removal?CDNA?Synthethesis?Kit?試劑盒、MasicSYBR?Mixture?（批號：147100，康為世紀公司，規格50T）；引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.3??實驗方法

取適量CDN，溶解于0.5%羥甲基纖維素鈉。將小鼠隨機分為6組，每組8只，即生理鹽水（Sham）組、博來霉素（bleomycin，BLM）組、豆蔻明低劑量（low?dose?of?Cardamonin，CDN-L）組（25mg/kg）、豆蔻明中劑量（medium?dose?of?Cardamonin，CDN-M）組（50mg/kg）、豆蔻明高劑量（high?dose?of?Cardamonin，CDN-H）組（100mg/kg）、地塞米松（dexamethasone，DXM）組（1mg/kg），采用單次氣管內滴注5mg/kg?BLM誘導肺纖維化，具體操作見文獻[8]。造模第7天給與相應藥物，連續給藥21d。稱重后進行麻醉，摘取眼球后取血，分離血清，–20℃保存。取肺組織稱重，計算肺指數，具體計算公式見文獻[9]，采取右下肺組織組織固定液固定，余組織分裝后–80℃保存。

1.4??指標檢測

將固定的組織包埋成蠟塊，做成4μm切片，后進行蘇木精-伊紅、馬松染色，觀察肺組織相關炎癥情況采用文獻[9]制定標準。采用酶聯免疫法檢測大鼠血清TNF-α水平。采用相應試劑盒，進行肺組織HYP水平的檢測。

采用總RNA提取試劑盒提取肺臟總RNA，合成cDNA，按照MasicSYBR?Mixture說明書進行PCR反應。根據2-ΔΔCt分析相對表達定量。引物見表1。

1.5??統計學方法

采用Graphpad?Prism?9.5對所有數據進行Kolmogorov-Smirnov檢驗符合正態分布，計量數據以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??CDN對肺指數的影響

BLM組小鼠肺指數明顯升高，與Sham組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；CDN-M、CDN-H、DXM組肺指數降低，與BLM組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；CDN-L與BLM組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；CDN-H組與DXM組肺指數比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.2??小鼠病理檢查結果

Sham組小鼠肺組織結構完整，肺泡間隔正常。BLM組肺泡壁顯著增厚，部分肺泡實變及塌陷不均勻分布，肺泡大小不一，肺泡腔內可見大量炎性細胞浸潤及滲出液，間質可見彈力纖維和膠原纖維增生，馬松染色可見肺間質大量膠原纖維沉積形成纖維灶。DXM組可見肺結構相對完整，肺間隔明顯縮小，間質可見少量炎細胞浸潤，肺泡內少量滲出液；馬松染色可見支氣管周圍少量膠原纖維沉積。CDN-L組與BLM組相似。CDN-M、CDN-H組可見不同炎性程度和纖維化程度改善，CDN-H組尤為明顯，馬松染色膠原纖維面積減少。見圖1、圖2。

2.3??CDN對小鼠Szapiel、Ashcroft評分與血清中TNF-α水平影響

Szapiel評分結果：與Sham組比較，BLM組小鼠肺組織炎癥評分升高（P<0.05）；與BLM組比較，CDN-M、CDN-H、DXM組肺組織炎癥評分不同程度降低（P<0.05），CDN-L組小鼠肺組織炎癥評分稍降低（P>0.05）；CDN-H組和DXM組炎癥評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。Ashcroft評分：與Sham組比較，BLM組小鼠纖維化評分明顯升高（P<0.05）；與BLM組比較，CDN-M、CDN-H、DXM組肺組織纖維化評分降低（P<0.05），CDN-L組肺組織纖維化評分稍低（P>0.05）；CDN-H組和DXM組纖維化評分差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

與Sham組比較，BLM組小鼠血清中TNF-α水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與BLM組相比，CDN-M、CDN-H、DXM組TNF-α水平降低（P<0.05），CDN-L組差異無統計學意義（P>0.05）；CDN-H組小鼠血清TNF-α水平稍高于DXM組（P>0.05），見表3。

2.4??CDN對小鼠肺組織HYP水平影響

與Sham組相比，BLM組小鼠肺組織中HYP含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與BLM組相比，CDN-M、CDN-H、DXM干預降低肺組織HYP含量（P<0.05），CDN-L組肺組織HYP含量稍降低（P>0.05）；與DXM組比較，CDN-H組小鼠肺組織HYP含量升高，差異無統計學意義（P>0.05），見表4。

2.5??CDN對小鼠肺組織TGF-β1、smad2、samd3?mRNA水平的影響

與Sham組相比，BLM組TGF-β1、smad2、smad3

mRNA表達明顯升高（P<0.05）；與BLM組相比，CDN-M、CDN-H、DXM組?TGF-β1、smad2、smad3?mRNA水平降低，差異有統計學意義（P<0.05），CDN-L組小鼠TGF-β1、smad2、smad3?mRNA變化降低，差異無統計學意義（P>0.05）；與DXM組比較，CDN-H組小鼠TGF-β1、smad2、smad3?mRNA表達升高，差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

2.6??CDN對小鼠肺組織α-SMA、E-Cadherin?mRNA水平影響

與Sham組相比，BLM組α-SMA?mRNA水平明顯升高，E-Cadherin?mRNA水平減低，差異有統計學意義（P<0.05）；與BLM組相比，CDN-M、CDN-H、DXM組α-SMA?mRNA表達降低、E-Cadherin?mRNA表達升高，差異有統計學意義（P<0.05），CDN-L組小鼠α-SMA?mRNA水平降低、E-Cadherin?mRNA水平升高，差異無統計學意義（P>0.05）；與DXM組比較，CDN-H組小鼠α-SMA?mRNA水平升高（P<0.05），E-Cadherin?mRNA水平減低，差異無統計學意義（P>0.05），表5。

3??討論

IPF是一種進行性肺部疾病，病死率高，治療方案有限。IPF病因不明，發病機制尚未完全確定，炎癥在IPF的發展早期具有舉足輕重的作用。長期慢性炎癥引起肺上皮細胞反復損傷，從而引起其衰老、凋亡，部分上皮細胞EMT[1]。EMT是一種生物過程，上皮細胞失去黏附功能，并獲得轉移入侵的能力，通過細胞外基質遷移為間充質細胞的現象，在組織學上是通過上皮細胞-細胞黏附分子如E-Cadherin喪失和間充質標志物如波形蛋白或α-SMA的增加來識別的。α-SMA是肌成纖維細胞表達的標志蛋白，纖維細胞和肌成纖維細胞過度分泌膠原蛋白導致細胞外基質沉積是肺纖維化的典型表現。HYP是膠原蛋白特有的主要成分，通過測定其水平反應膠原蛋白的含量，評估纖維化程度[11-13]。

BLM可通過引起DNA鏈斷裂和氧化誘導肺損傷，從而引起炎癥細胞在損傷部位的募集，最終導致成纖維細胞活化、細胞外基質沉積[14]。研究表明，BLM可導致小鼠體質量下降、肺指數增加，肺組織大量炎性細胞浸潤和膠原蛋白沉積[8]。本研究通過單次氣管內注射BLM發現肺組織彌漫性炎癥和纖維化，表明肺纖維化模型建立成功。

CDN對肺損傷具有保護作用。伍曉瑩等[15]研究表明CDN通過激活腺苷A2A受體減少巨噬細胞介導炎癥，從而改善失血性休克誘發大鼠肺損傷。Yang等[16]研究證實，CDN在體內外通過靶向髓細胞分化因子2抑制脂多糖誘導的炎癥因子產生與巨噬細胞浸潤，預防急性肺損傷。此外，Lee等[17]發現CDN對顆粒物誘導的肺損傷具有保護作用，其機制可能是抑制Toll樣受體2、4/髓樣分化因子88和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白自噬途徑有關。最新研究表明，CDN可以改善佛波醇酯類多克隆刺激劑誘導的肺部炎癥，其機制與肺泡巨噬細胞中的核因子E2相關因子/血紅素加氧酶1信號通路激活有關[6]。然而，CDN對肺纖維化的作用及其機制鮮有文獻報道。

TNF-α是由活化的巨噬細胞產生的一種多功能細胞因子，參與正常的炎性反應與免疫反應。同時，TNF-α可促進成纖維細胞分化并產生大量膠原蛋白，與巨噬細胞細胞釋放的纖維結合素相互作用形成初期的肺泡炎[18]。最新研究表明，TNF-α可以促進肺駐留間充質干細向肌成纖維細胞分化，其機制與核轉錄因子-κB信號有關[19]。本研究中CDN可顯著抑制肺組織纖維化和炎癥改變，降低HYP和血清中TNF-α水平，降低肺指數。這些證據表明，CDN可以改善BLM誘導的炎癥并具有抗纖維化作用，且與DXM治療效果相似。此外，本研究CDN-L組治療效果不明顯，這可能與CDN在體內未達到有效血藥濃度有關，CDN口服后具有吸收不良、生物利用度低、清除率高、平均停留時間短等缺點[20]。

一項關于單細胞RNA測序研究表明TGF-β通路是異常肺上皮細胞群中上調最多的通路之一，在IPF肌成纖維細胞中，TGF-β1激活其受體，促進Smad2/3磷酸化與Smad4相互作用并易位到細胞核中激活EMT和纖維化相關基因如纖連蛋白、膠原蛋白等轉錄合成膠原蛋白，另一方面通過基質金屬蛋白酶抑制細胞外基質降解，促進纖維化，在BLM誘導的肺纖維化模型中，滇龍膽草通過調控TGF-β1/Smad2/3信號通路抑制EMT發揮抗纖維作用[21-23]。本研究發現小鼠肺組織中?TGF-β1/Smad2/3?信號在?BLM?誘導的肺纖維化過程中被激活。CDN干預后，小鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA?mRNA表達下降，E-Cadherin?mRNA表達升高。由此可見，CDN可能通過下調TGF-β1/smad信號通路介導EMT對BLM誘導肺纖維化小鼠發揮抗纖維化作用。

綜上所述，CDN可以抑制肺纖維化的炎癥與膠原蛋白沉積，其機制可能通過下調TGF-β1/smad信號通路介導EMT對BLM誘導肺纖維化小鼠發揮抗纖維化作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–28）

（修回日期：2023–11–15）