circ_HIPK3靶向miR-381-3p/ZNF217軸調控Aβ誘導的海馬神經元功能和形態

李偉 陳亮 呂昌迎

摘要：目的 分析環狀RNA同源結構域相互作用蛋白激酶3（circ_HIPK3）靶向miR-381-3p/鋅指蛋白217（ZNF217）軸對β淀粉樣蛋白（Aβ）誘導的海馬神經元功能和形態的影響。方法 制備新生大鼠海馬神經元，分為對照組、Aβ組、si NC1組、si HIPK3組、si HIPK3+inhibitor NC組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2組、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組，除對照組外其余組均通過40 μmol/L Aβ1～42誘導。qRT-PCR法測定海馬神經元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA表達，透射電鏡觀察細胞形態，CCK-8法測定海馬神經元存活率，Hochesst 33342法測定海馬神經元凋亡，流式細胞儀檢測海馬神經元內Ca2+熒光強度，Western blot法測定海馬神經元磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217蛋白表達，雙螢光素酶報告基因分析miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217靶向關系。結果 對照組海馬神經元結構正常，胞核形態正常，線粒體、內質網無病理改變；Aβ組海馬神經元呈退行性改變，核形態異常，膜內陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內含大量脂滴空泡；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元結構部分恢復；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元結構損傷嚴重；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元結構損傷減輕。與對照組相比，Aβ組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達、凋亡率、Ca2+熒光強度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達升高，miR-381-3p表達、存活率、Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達、凋亡率、Ca2+熒光強度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達降低，miR-381-3p表達、存活率、Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和蛋白表達、凋亡率、Ca2+熒光強度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達升高，miR-381-3p水平、存活率、Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元ZNF217 mRNA和蛋白表達水平、凋亡率、Ca2+熒光強度、P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達降低，存活率、Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）；miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均靶向結合。結論 circ_HIPK3沉默可能通過調控miR-381-3p/ZNF217軸改善Aβ誘導的海馬神經元結構功能損傷。

關鍵詞：海馬；神經元；Tristetraprolin蛋白；circ_HIPK3；miR-381-3p；ZNF217

中圖分類號：R749.16文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231013

circ_HIPK3 regulates function and morphology of Aβ induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/ZNF217 axis

LI Wei1， CHEN Liang1， LYU Changying2△

1 Department 1 of Encephalopathy， 2 Department 3 of Encephalopathy， Jinan Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Jinan 271100， China

△Corresponding Author E-mail： lvchangying@sohu.com

Abstract： Objective To analyze the influence of cyclic RNA homologous domain interacting protein kinase 3 （circ_HIPK3） on function and morphology of myloid β-protein （Aβ） induced hippocampal neurons by targeting miR-381-3p/zinc finger protein 217 （ZNF217） axis. Methods Hippocampal neurons of neonatal rats were prepared and divided into the control group， the Aβ group， the si NC1 group， the si HIPK3 group， the si HIPK3+inhibitor NC group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2 group and the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group. Except the control group， all the other groups were modeled by 40 μmol/L Aβ1～42. qRT-PCR was used to determine the circ of hippocampal neurons circ_HIPK3， miR-381-3p and ZNF217 mRNA levels. Cell morphology was observed by transmission electron microscope， and the survival rate of hippocampal neurons was measured by CCK-8 method. Hochesst 33342 method was used to measure apoptosis of hippocampal neurons. The intracellular Ca2+ fluorescence intensity of hippocampal neurons was detected by flow cytometry. The expression levels of P-Tau， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， Caspase-3 and ZNF217 proteins in hippocampal neurons were measured by Western blot assay. Double luciferase reporter genes were used to analyze the targeting relationship between miR-381-3p and circ_HIPK3， ZNF217. Results In the control group， the structure of hippocampal neurons was normal， the morphology of nucleus was normal， and there were no pathological changes in mitochondria and endoplasmic reticulum. In the Aβ group， hippocampal neurons showed degenerative changes， abnormal nuclear morphology， membrane invagination， a large number of mitochondria swelling and a large number of lipid droplets vacuoles in cytoplasm. Compared with the Aβ group， the hippocampal neuronal structure was partially restored in the si HIPK3 group. Compared with the si HIPK3 group， the hippocampal neuronal structure was severely damaged in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the damage of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group was reduced. Compared with the control group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax， Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were increased in the Aβ group， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the Aβ group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons were decreased in the si HIPK3 group， and? miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3 group， the circ_HIPK3， ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group were increased， and the miR-381-3p level， survival rate and Bcl-2 protein expression decreased （P＜0.05）. Compared with the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor group， the ZNF217 mRNA and ZNF217 protein levels， apoptosis rate， Ca2+ fluorescence intensity， P-Tau， Bax and Caspase-3 protein expression of hippocampal neurons in the si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217 group were decreased， and the survival rate and Bcl-2 protein expression increased （P＜0.05）. miR-381-3p targeted and combined with HIPK3 and ZNF217. Conclusion circ_HIPK3 silencing may ameliorate Aβ-induced damage of hippocampal neuronal structure and function by regulating miR-381-3p/ZNF217 axis.

Key words： hippocampus; neurons; tristetraprolin; circ_HIPK3; miR-381-3p; ZNF217

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是臨床上表現為記憶衰退、失語、行為障礙等癡呆行為的神經進展性疾病，隨著人口老齡化進程加快，AD發病率呈上升趨勢［1-2］。β淀粉樣蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）是由β-淀粉樣前體蛋白水解而來，在腦脊液中大量存在，在細胞基質沉淀聚積后具有很強的神經毒性作用，可刺激海馬神經元變性和死亡，被認定為AD發病的因素之一［3］?；诖藰嫿ˋD損傷細胞模型并進行分子靶向分析是研究AD病理的重要方式。環狀RNA（circRNA）在生物體內廣泛存在，在各種細胞活動中發揮關鍵作用，可與miRNA競爭性結合參與對下游靶基因的調控，環狀RNA同源結構域相互作用蛋白激酶3（circRNA homologous domain-interacting protein kinase 3，circ_HIPK3）是一種circRNA，可促進神經膠質瘤細胞增殖與轉移［4］，減輕CoCl2誘導的神經元凋亡［5］。miR-381-3p在AD患者體內呈低表達，其過表達可減弱Aβ誘導的神經毒性和炎癥反應［6］。鋅指蛋白217（Zinc finger protein 217，ZNF217）屬于鋅指基因家族成員之一，與AD發病風險有關聯［7］；調節miR-200/ZNF217軸可防止Aβ誘導的PC12細胞神經毒性［8］。經查詢StarBase生物信息學網站（https：//rnasysu.com/encori/）發現，miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均存在結合位點，circ_HIPK3能否通過miR-381-3p/ZNF217軸參與對Aβ誘導的海馬神經元結構與功能造成影響仍未知，本研究將對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級新生SD大鼠10只，1日齡，體質量6.0～7.0 g，購自廣東萊迪生物醫藥研究院有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0064。實驗前將其與母鼠飼養于同籠，母鼠均正常喂養，動物飼養溫度為22～24 ℃，光照/黑暗時間為12 h，相對濕度40%～60%，大鼠自由攝食、飲水。本實驗經濟南市中西醫結合醫院倫理委員會批準［（2022）倫審第（044）號-KY］，在實驗過程中按照動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 主要試劑與儀器 CCK-8試劑盒、Hochesst 33342染色液、鈣熒光探針fluo-3 AM、TRIzol試劑、Lipo脂質體高效轉染試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；cDNA第一鏈合成/RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green qPCR Mix（2×）購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗微管相關蛋白2（Microtubule associated protein 2，MAP2）、磷酸化Tau蛋白（P-Tau）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、ZNF217購自英國Abcam公司。Gallios流式細胞儀購自美國貝克曼公司；7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Spectra S/TEM透射電子顯微鏡購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元分離與分組 將新生大鼠斷頭處死，無菌環境下分離大鼠海馬組織并剪碎，胰酶消化，終止消化并吹打細胞后進行過濾初篩，調整細胞濃度（1×106個/mL），接種至L-多聚賴氨酸處理的6孔板，培養箱內培養，48 h后加入5 g/L阿糖胞苷抑制神經元活性，隔3 d換液（1/2原培養基），第5天采用神經元特異性標志物MAP2進行免疫熒光染色鑒定神經元，陽性率高于90%為神經元［9］。

將神經元分為對照組（正常培養）、Aβ組（40 μmol/L Aβ1～42培養48 h［10］）、si NC1組（轉染si NC1）、si HIPK3組（轉染si HIPK3）、si HIPK3+inhibitor NC組（si HIPK3與inhibitor NC共轉染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組（si HIPK3與miR-381-3p inhibitor共轉染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si NC2組（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si NC2共轉染）、si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組（si HIPK3、miR-381-3p inhibitor、si ZNF217共轉染）。除對照組外，其余組均采用Lipo轉染試劑盒進行轉染，轉染6 h后細胞加入40 μmol/L Aβ1～42培養48 h。

1.2.2 qRT-PCR法測定海馬神經元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA水平 取各組海馬神經元總RNA（TRIzol試劑），并將一定量RNA逆轉錄為cDNA，進行擴增，測定程序為94 ℃預處理3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 5 min。circ_HIPK3、ZNF217（內參GAPDH）、miR-381-3p（內參U6）水平以2-ΔΔCt法確定。引物序列見表1。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察海馬神經元形態 制備細胞涂片：將蓋玻片（10 mm×10 mm）在95%乙醇（含1%鹽酸）中浸泡過夜，然后用95%乙醇沖洗2次，滅菌備用。將瓊脂糖滴在蓋玻片上，使蓋玻片表面覆蓋一層瓊脂糖（約20 μm厚），再將多聚賴氨酸（0.01 mol/L硼酸溶解）鋪在包被有瓊脂糖的蓋玻片上，將蓋玻片置于無菌條件下的24孔培養板中，加入細胞懸液（1×105個/mL）進行培養。待細胞長至鋪滿孔底后取出蓋玻片，戊二醛預固定30 min后，用細胞刮子輕輕將細胞連同瓊脂糖膜刮下，繼續用戊二醛2 h，鋨酸再次固定，經乙醇丙酮梯度脫水、浸透、包埋等步驟后，制備超薄切片（70 nm），透射電鏡觀察細胞形態。

1.2.4 CCK-8法測定海馬神經元存活率 將各組細胞以每孔4 000個的密度接種到96孔板中，培養48 h后，加入CCK-8試劑，培養箱內繼續培養4 h后，使用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5 海馬神經元凋亡率測定 胰酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并重懸，取1 mL細胞懸液（1×105個/mL）接種至24孔板后，PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定細胞5 min，加入Hochesst 33342染色液孵育5 min，PBS清洗細胞，加入抗熒光淬滅封片液封固，熒光顯微鏡下觀察并確定細胞凋亡情況。

1.2.6 熒光探針fluo-3 AM法檢測海馬神經元內Ca2+熒光強度 無Ca2+細胞外液（135 mmol/L NaCl、KCl、MgCl2、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀釋熒光探針fluo-3 AM（5 μmol/L），分組處理后收集各組細胞（1×105個/mL）至不同管中，加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，流式細胞儀檢測細胞內Ca2+熒光強度（以發出熒光細胞的比例計）。

1.2.7 Western blot檢測細胞中P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉模，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗P-Tau、Bcl-2、Bax、Caspase-3、ZNF217（稀釋比1∶1 000），4 ℃過夜，洗滌3次，加入山羊抗兔IgG（稀釋比1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3次。增強化學發光底物顯色，用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質條帶灰度，計算目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次，以β-actin作為內參。

1.2.8 雙螢光素酶鑒定靶向關系 構建circ_HIPK3和ZNF217的野生型（WT）與突變型（MUT）質粒，分別命名為WT HIPK3、MUT HIPK3、WT ZNF217、MUT ZNF217，將其分別與mimic NC、miR-381-3p mimic共轉染，分別作為mimics NC+WT HIPK3組、miR-381-3p mimics+WT HIPK3組、mimics NC+MUT HIPK3組、miR-381-3p mimics+MUT HIPK3組；mimics NC+WT ZNF217組、miR-381-3p mimics+WT ZNF217組、mimics NC+MUT ZNF217組、miR-381-3p mimics+MUT ZNF217組，轉染48 h，雙螢光素酶試劑盒測定螢光素酶相對活性。檢測circ_HIPK3沉默表達對miR-381-3p表達及miR-381-3p過表達對ZNF217 mRNA與蛋白表達的影響。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[x] ±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬神經元鑒定 海馬神經元培養7 d后，熒光顯微鏡下觀察MAP-2蛋白陽性率>90%，見圖1。

2.2 各組海馬神經元circ_HIPK3、miR-381-3p、ZNF217 mRNA和蛋白表達水平比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達水平升高，miR-381-3p表達水平降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達水平降低，miR-381-3p表達水平升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元circ_HIPK3、ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達水平升高，miR-381-3p表達水平降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元ZNF217 mRNA和ZNF217蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2、表2。

2.3 各組海馬神經元形態觀察 對照組海馬神經元結構正常，胞核形態正常，線粒體、內質網無病理改變；Aβ組海馬神經元呈退行性改變，核形態異常，膜內陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內含大量脂滴空泡；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元結構部分恢復；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元結構損傷嚴重；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元結構損傷減輕，見圖3。

2.4 各組海馬神經元活力比較 與對照組相比，Aβ組神經元存活率降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組神經元存活率升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組神經元存活率降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組神經元存活率升高（P＜0.05），見表3。

2.5 各組海馬神經元凋亡比較 對照組神經元凋亡極少，染色極少；與對照組相比，Aβ組海馬神經元凋亡率升高，呈現藍色熒光（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元凋亡率降低（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元凋亡率升高（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元凋亡率降低（P＜0.05），見圖4、表3。

2.6 各組海馬神經元Ca2+熒光強度比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經元Ca2+熒光強度升高（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元Ca2+熒光強度降低（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元Ca2+熒光強度升高（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組Ca2+熒光強度降低（P＜0.05），見圖5、表3。

2.7 各組海馬神經元相關蛋白、凋亡相關蛋白表達比較 與對照組相比，Aβ組海馬神經元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與Aβ組相比，si HIPK3組海馬神經元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與si HIPK3組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組海馬神經元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與si HIPK3+miR-381-3p inhibitor組相比，si HIPK3+miR-381-3p inhibitor+si ZNF217組海馬神經元P-Tau、Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖6。

2.8 靶向關系結果 miR-381-3p與circ_HIPK3、ZNF217均具有結合位點，見圖7。雙螢光素酶顯示，miR-381-3p mimics+WT HIPK3組螢光素酶活性低于mimics NC+WT HIPK3組（P＜0.05），miR-381-3p mimics+MUT HIPK3組與mimics NC+MUT HIPK3組螢光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）；miR-128-3p mimics+WT ZNF217組螢光素酶活性低于mimics NC+WT ZNF217組（P＜0.05），miR-128-3p mimics+MUT ZNF217組螢光素酶活性與mimics NC+MUT ZNF217組差異無統計學意義，見表5。

與sh NC組相比，sh HIPK3組miR-381-3p表達水平升高（1.41±0.13 vs. 0.82±0.08，t=9.468，P＜0.05）；與mimics NC組相比，miR-381-3p mimics組ZNF217 mRNA（0.46±0.04 vs. 1.06±0.17，t=8.415，P＜0.05）與蛋白降低（0.33±0.04 vs. 0.83±0.09，t=12.435，P＜0.05），見圖8。

3 討論

海馬神經元結構、功能損傷是AD發病基礎之一［11］，控制海馬神經元凋亡是延緩AD發展的方式。Aβ誘導學說是目前主流觀點之一，神經外Aβ沉積誘導神經衰老、細胞凋亡和炎癥反應。本研究通過構建Aβ誘導大鼠海馬神經元，構建海馬神經元損傷模型，探討AD相關分子機制。

circ_HIPK3在非小細胞肺癌細胞［12］、結直腸癌［13］凋亡的調控中發揮重要作用。Zhao等［14］研究顯示，circ_HIPK3可通過競爭性內源性RNA（ceRNA）模式減輕脊髓損傷中神經元凋亡。有報道稱，敲低HIPK3可通過增強自噬，降低HTT蛋白表達水平，改善亨廷頓病小鼠神經損傷［15］。在本研究中，Aβ誘導的海馬神經元呈退行性改變，核形態異常，膜內陷，可見大量線粒體腫脹，胞漿內含大量脂滴空泡，且細胞存活率降低，凋亡率增高，并伴隨Bcl-2蛋白表達水平降低及Bax蛋白表達水平升高，證明模型構建成功。采用小分子干擾技術敲低circ_HIPK3后，Aβ誘導的海馬神經元形態有所恢復，細胞存活率升高，凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高及Bax蛋白表達水平降低，提示沉默circ_HIPK3可對AD神經元損傷發揮保護作用。Ca2+可維持神經細胞正常功能，Aβ沉積會引起神經元Ca2+超載，激活一系列級聯反應，在AD發生發展中發揮作用［16］。本研究中沉默circ_HIPK3可降低Aβ誘導的海馬神經元Ca2+超載，表現為Ca2+熒光強度降低，推測其可能原因是沉默circ_HIPK3可抑制細胞膜上Ca2+通道，使Ca2+內流減少，改善Ca2+超載現象。此外，神經元相關蛋白P-Tau蛋白表達水平降低亦證明沉默circ_HIPK3可發揮神經元保護作用。

CircRNA可通過海綿化吸附miRNA調控下游靶基因表達發揮作用。miRNA是一種高度穩定、小而短的非編碼RNA分子，參與細胞生長、代謝、分化和發育的調節。miR-381-3p是近年來新發現的一種miRNA。在AD患者血清和細胞模型中檢測到miR-381-3p低表達，過表達miR-381-3p可減弱Aβ誘導的神經毒性和炎癥反應［6］。本研究中Aβ誘導的海馬神經元中miR-381-3p表達水平降低，與既往研究結果［6］一致；沉默circ_HIPK3可上調Aβ誘導的海馬神經元中miR-381-3p表達，且miR-381-3p與circ_HIPK3存在互補的結合位點；推測沉默circ_HIPK3對Aβ誘導的海馬神經元損傷的改善作用可能與miR-381-3p表達有關。本研究采用雙螢光素酶實驗證實miR-381-3p與circ_HIPK3之間存在靶向結合關系，miR-381-3p低表達可逆轉circ_HIPK3沉默對海馬神經元的保護作用，提示circ_HIPK3沉默可能通過上調miR-381-3p表達對Aβ誘導的海馬神經元發揮保護作用。

ZNF217定位于人染色體20q 13.2，表達產物為ZNF217蛋白。Wu等［17］研究顯示，ZNF217在AD中參與Aβ誘導的神經元損傷。lncRNA SNHG1敲除可通過上調miR-361-3p表達，降低ZNF217表達，減輕神經元損傷［18］。本研究結果顯示，Aβ誘導的海馬神經元中ZNF217 mRNA和蛋白表達水平升高，與miR-381-3p表達趨勢相反；miR-381-3p與ZNF217存在結合位點，雙螢光素酶實驗亦驗證了miR-381-3p與ZNF217之間存在靶向結合關系，且miR-381-3p過表達后ZNF217 mRNA和蛋白表達水平降低，miR-381-3p低表達可逆轉circ_HIPK3沉默對海馬神經元的保護作用，而此逆轉作用又可被ZNF217沉默恢復，即ZNF217沉默亦可發揮對海馬神經元的保護作用，提示circ_HIPK3沉默可能通過上調miR-381-3p表達，抑制ZNF217表達發揮對海馬神經元的保護作用。

綜上所述，沉默circ_HIPK3可能通過調控miR-381-3p/ZNF217軸改善Aβ誘導的海馬神經元結構功能損傷。后續將在動物模型中對本研究結果進行驗證，此外，circRNA可調控的下游靶miRNA眾多，circ_HIPK3能否通過其他分子通路發揮作用仍有待進一步探究。

參考文獻

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（2023-07-27收稿 2023-09-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）