積雪草酸對實驗性蛛網膜下腔出血大鼠腦損傷的保護作用

武瀟瀟 胡玉鯤 吳江

摘要：目的 探討積雪草酸（AA）對實驗性蛛網膜下腔出血（SAH）大鼠腦損傷的神經保護作用。方法 將108只成年SD大鼠分為假手術（Sham）1組、SAH+Vehicle（空載）組與SAH+AA組，每組36只；42只大鼠分為Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組，每組6只。除Sham組外，其余各組采用單側頸外動脈線刺法建立SAH模型，造模后SAH+AA組灌胃AA溶液（30 mg/kg）。采用踏空實驗和改良Garcia評分評估神經行為學改變，Western blot檢測腦組織谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）蛋白表達，酶聯免疫吸附試驗檢測腦組織谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）濃度，Fluoro-Jade B染色檢測神經元死亡情況。結果 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組踏空步數比例明顯增多且改良Garcia評分明顯降低，腦組織GPX4蛋白表達水平和GSH含量降低，MDA含量升高，死亡神經元數目增多（均P＜0.05）。與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組踏空步數比例下降且改良Garcia評分升高，腦組織GPX4蛋白表達升高，MDA含量下降，GSH含量升高，死亡神經元數目明顯下降（P＜0.05）。結論 AA可能通過抑制脂質過氧化減輕大鼠SAH后的腦損傷。

關鍵詞：積雪草酸；脂質過氧化；蛛網膜下腔出血；腦損傷

中圖分類號：R743.35文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231956

Protective effect of asiatic acid on brain injury after experimental subarachnoid

hemorrhage in rats

WU Xiaoxiao1， HU Yukun2， WU Jiang3△

1 Suzhou Medical College of Soochow University， Suzhou 215000， China; 2 the Affiliated Changshu Hospital of Nantong University; 3 the First Affiliated Hospital of Soochow University

△Corresponding Author E-mail： szjiangwu@163.com

Abstract： Objective To explore the neuroprotective effect of asiatic acid （AA） on brain damage after experimental subarachnoid hemorrhage （SAH） in rats. Methods A total of 108 adult SD rats were divided into the sham1 group， the SAH+vehicle group and the SAH+AA group， with 36 rats in each group. The 42 rats were divided into the sham2 group， 3， 6， 12， 24， 48 and 72 h after SAH groups， with 6 rats in each group. Except the sham group， SAH model was established by unilateral external carotid artery puncture method in other groups. After modeling， the SAH+AA group was given AA solution （30 mg/kg） by gavage. Neurobehavioral changes were assessed by foot fault test and modified Garcia score. Western blot assay was used to detect the protein level of glutathione peroxidase 4 （GPX4） in brain tissue. ELISA was used to detect the concentrations of glutathione （GSH） and malondialdehyde （MDA）. Fluoro Jade B （FJB） staining was used to detect the neuronal death. Results Compared with the sham1 group， the SAH+vehicle group showed a significant increase in the proportion of empty steps and a significant decrease in the modified Garcia score， a significant decrease in GPX4 protein levels， a significant increase in MDA concentration （P＜0.05）， a decrease in GSH concentration （P＜0.01） and a significant increase in the number of dead neurons （P＜0.05）. Compared with the SAH+vehicle group， a significant decrease in the proportion of empty steps， a significant increase in the modified Garcia score， a significant increase in GPX4 protein level， a significant decrease in MDA concentration， a significant increase in GSH concentration （P＜0.05） and a significant decrease in the number of dead neurons in the SAH+AA group （P＜0.05）. Conclusion AA may reduce brain injury after SAH in rats by inhibiting lipid peroxidation.

Key words： asiatic acid; lipid peroxidation; subarachnoid hemorrhage; brain damage

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是出血性腦卒中的主要形式之一，也是一種致死致殘率高的神經外科急重癥［1-2］。目前已有大量實驗研究證實SAH后神經損傷與氧化應激有關，是導致預后不良的主要病理改變［3-5］。積雪草酸（asiatic acid，AA）是熱帶植物積雪草中天然存在的五環三萜類化合物，具有強大的抗氧化和抗炎等廣泛的生物活性［6-7］。已有研究證實，AA可以穿透血腦屏障，并在腦梗死等神經系統疾病中發揮神經保護作用［5，8］。本研究旨在探討AA在SAH中的神經保護作用及可能機制，為改善SAH患者預后提供潛在的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 150只SPF級成年健康雄性SD大鼠，8～10周齡，體質量280～330 g，購自昭衍新藥研究中心有限公司，動物生產許可證號：SCXK（蘇）2023-0004。大鼠以常規棒狀顆粒飼料喂養，自由飲水，定期更換飼料，清理鼠籠，動物房溫度18～22 ℃，維持晝夜循環。本研究過程中動物的使用符合《國家實驗動物飼養和使用指南》的相關規定，實驗及操作經過蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理會批準（編號：2021倫審批第124號）。

1.1.2 主要試劑和儀器 AA（純度98.23%）購自Aktin Chemicals公司，二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，兔抗鼠谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase，GPX4）抗體（DF 6701）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（AF 7021）購自Affinity公司，抗兔IgG抗體（7074S）購自Cell Signaling公司，丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自同仁化學公司，谷胱甘肽（GSH）ELISA檢測試劑盒購自BioVision公司，Western blot相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，Fluoro-Jade B（FJB）粉末購自Biosensis公司。光學顯微鏡（SMZ745型）、熒光顯微鏡（DS-Ri2型）購自日本Nikon公司，多功能酶標儀（DR-200Bn型）購自無錫華衛德朗儀器有限公司。溶液配制：空載溶液為50 mL生理鹽水+50 μL DMSO，AA溶液為50 mL生理鹽水+50 μL DMSO+150 mg AA粉末。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及大鼠SAH模型的建立 大鼠喂養1～2周后按照隨機數字表法將108只大鼠分為假手術（Sham）1組、SAH+Vehicle組（溶劑對照）、SAH+AA組（給藥），每組36只。剩余42只分為Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組，每組6只。除Sham組外，其余組均采用單側頸外動脈線刺法構建SAH模型。術前8 h禁食，稱體質量后，使用4%水合氯醛溶液（10 mL/kg）腹腔注射麻醉。常規消毒備皮后將大鼠固定在動物實驗臺上，在頸部做縱向切口，分離肌肉和筋膜，暴露頸外動脈。頭側解剖并結扎頸外動脈遠端，繼續解剖并暴露頸總動脈和頸內動脈。懸吊頸內動脈以暫時阻斷血流，用動脈夾夾住遠端頸總動脈以阻斷血流。用顯微剪刀在頸外動脈殘端上剪開一個破口，然后沿著破口插入線栓，直到栓線標記處到達頸內外動脈分叉口處再向內行進0.5～1.0 cm，直至感覺到突破；5 s后，拔出線栓，結扎頸外動脈殘端，松開頸總動脈的動脈夾。觀察血管的再灌注情況?？p合切口并進行術后護理［9］。Sham組僅結扎頸外動脈遠端。

1.2.2 干預時間及給藥方式 （1）干預時間：將Sham2組及SAH后3、6、12、24、48、72 h組的42只大鼠麻醉后處死，用150 mL PBS灌注心臟后完整取出腦組織，取顳底腦組織，置入IP細胞裂解液中充分裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分離上清液，使用BCA檢測試劑盒測量上清液中蛋白質含量并平衡濃度。平衡后的樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜。封閉液封閉60 min，添加GPX4一抗（1∶1 000），在4 ℃孵育過夜。次日用PBST沖洗3次，添加抗兔IgG二抗（1∶2 000），在室溫下孵育60 min。最后在顯影儀上用增強化學發光法曝光，Image J軟件測量目的條帶的灰度值并計算GPX4蛋白相對表達量［10］。根據GPX4表達水平確定SAH后取材時間。

（2）給藥方式：SAH+AA組大鼠在造模后按照30 mg/kg劑量［11］灌胃AA溶液（參與行為學實驗大鼠在SAH后3 h給藥，每隔24 h給藥1次，共3次，其余實驗大鼠在SAH后3 h給藥，隔12 h給藥1次，共2次）。SAH+Vehicle組在大鼠SAH造模3 h后通過灌胃給藥，根據AA需要量計算相應計量給予空載溶液。Sham1組不予處理。

1.2.3 踏空實驗 將大鼠置于升高的網格鐵架上，網格大小為6 cm×6 cm。大鼠把爪子放在鐵絲上，沿著格子移動。為了便于記錄步態，從格子下方對大鼠進行錄像。當神經受損的前肢負重時，可能會掉落到鐵絲之間，即為踏空［12］。記錄左側前爪的踏空步數和總步數，計算踏空比例。大鼠于造模前3 d進行訓練，每天3次，每次錄像1 min，取平均值作為術前基礎值。在建模后的第3、5、7、14天，每組取12只大鼠進行測試。

1.2.4 改良Garcia評分 大鼠于建模前1 d進行評分，每只大鼠測評3次，取平均值作為基線水平，在建模后第3、5、7天，每組取12只大鼠進行評估。改良Garcia評分用于評估SAH后大鼠的身體本體感覺、攀爬、前肢運動、觸須側轉、肢體對稱性以及自主運動6項，每項0～3分，總分18分；評分越高，代表神經功能越好［13］。

1.2.5 Western blot 各組取6只大鼠，在SAH后24 h處死，PBS灌注心臟后完整取出腦組織，參照1.2.2中步驟檢測腦組織中GPX4表達。

1.2.6 腦組織Fluoro-Jade B（FJB）染色 各組取6只大鼠在SAH后24 h處死，PBS及4%多聚甲醛灌注心臟后完整取出腦組織，取含有顳底的整塊腦組織制成石蠟切片。切片在70 ℃的烘箱中放置1 h，然后用二甲苯和乙醇水溶液對切片進行脫蠟。將切片置入0.06%的高錳酸鉀溶液中15 min，然后用去離子水沖洗2 min，再浸入FJB工作液（0.1%乙酸）中浸泡30 min。然后將切片在50～60 ℃烘烤15 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。熒光顯微鏡下采用藍色激發光（波長為450～490 nm）觀察及圖像采集［14］，計數死亡神經元數量。

1.2.7 ELISA檢測腦組織中MDA及GSH含量 各組取6只大鼠，在SAH后24 h處死，用PBS灌注心臟完整取出腦組織，PBS沖洗，每組取20 mg顳底腦組織采用微量板酶標法MDA的含量，根據檢測試劑盒說明進行操作；同上方法處死大鼠后，取100 mg顳底腦組織，采用微量板酶標法檢測GSH的含量，根據檢測試劑盒說明進行操作。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[x] ±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，SAH后不同時點指標比較采用重復測量資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AA可提高大鼠SAH后行為學表現 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組SAH后各時點踏空步數比例增多，改良Garcia評分降低（P＜0.05），與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組踏空步數比例下降，改良Garcia評分升高（P＜0.05），見表1、2。

2.2 SAH后腦組織中GPX4表達水平降低 Western blot結果顯示，與Sham2組相比，SAH后24 h腦組織中GPX4蛋白表達明顯下降，其他時間點差異無統計學意義，見圖1。故選擇SAH后24 h作為后續實驗的取材時間點。

2.3 AA能夠減少神經元死亡 見圖2。FJB染色結果顯示，Sham1組、SAH+Vehicle組、SAH+AA組變性神經元數量分別為（0.67±0.82）、（10.83±1.17）和（7.17±1.17）個/mm2，差異有統計學意義（n=6，F=140.300，P＜0.01）。SAH+Vehicle組變性神經元數目較Sham1組增多（P＜0.05），而相比SAH+Vehicle組，SAH+AA組中變性神經元出現減少（P＜0.05）。

2.4 AA對脂質過氧化蛋白表達的影響 與Sham1組相比，SAH+Vehicle組大鼠腦組織中GPX4蛋白相對表達量和GSH含量降低，MDA含量升高（P＜0.05）。與SAH+Vehicle組相比，SAH+AA組GPX4蛋白相對表達量和GSH含量升高，MDA含量下降（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

SAH是出血性腦卒中的一種致命亞型，它通常由顱內動脈瘤破裂導致［15］。目前已有大量針對SAH后神經損傷機制的研究，但是具體干預機制以及有效的治療手段仍然相對有限［16］。AA作為天然植物中存在的成分，具有抗氧化、保護神經的功能［10，17］。研究發現AA可明顯改善缺血性卒中后腦損傷［12］。因此，筆者推測AA可能對SAH同樣具有神經保護作用。本研究通過在大鼠SAH后給予AA進行藥物干預，觀察其在改良Garcia評分、踏空實驗等行為學測試中的表現，發現AA可有效改善大鼠SAH后的神經行為學功能損傷。本研究同時觀察到AA能夠有效減少SAH大鼠神經元的死亡，為SAH后腦損傷的治療提供了一種新型的藥物治療思路。

研究已經表明，許多神經系統疾病中均有脂質過氧化的出現，并且對于調控神經元死亡具有重要作用［18］，其中GSH、MDA以及GPX4則是脂質過氧化的重要標志物［19-20］。本研究發現，在SAH 24 h后大鼠腦組織中GPX4的含量明顯下降，這也印證了SAH后脂質過氧化的發生。本研究進一步發現SAH后大鼠腦組織中MDA含量增加，GSH含量下降，確證了SAH后脂質過氧化的發生及其下游產物的堆積。給予AA干預后，腦組織GPX4及GSH的含量較前得到提升，MDA含量下降，死亡神經元數量減少，提示AA可能通過抑制脂質過氧化來減少大鼠SAH后神經元死亡，發揮神經保護作用。本研究探究了AA在SAH中的作用，為SAH后的治療提供了新的思路方法。但本研究中尚存在著一些局限性，如僅簡單驗證了AA在大鼠SAH后的神經保護作用，具體的靶向蛋白及下游機制通路尚不明確；另外，GSH的耗竭、GPX4的失活以及MDA的堆積雖然是脂質過氧化發生過程中重要的一環，但根據上述指標的變化尚不能直接表明脂質過氧化的變化情況，療效證據不足；再者，AA是否通過脂質過氧化以外的其他信號通路來改善大鼠SAH后神經損傷還需進一步明確。

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（2023-12-10收稿 2023-12-25修回）

（本文編輯 胡小寧）