益氣活血通絡方對脊髓型頸椎病模型大鼠miR-126a-5p及VEGF信號通路的影響

劉丹 唐占英 李攀 袁薇娜 李芳芳 陳倩 胡志俊

摘要：目的 探討益氣活血通絡方對脊髓型頸椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p（miR-126a-5p）及血管內皮生長因子（VEGF）信號通路的影響。方法 30只健康雄性SD大鼠按照隨機數字表法均分為假手術組、模型組和中藥組。模型組、中藥組均制備脊髓型頸椎病模型。中藥組給予益氣活血通絡方灌胃，假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃，均為12周。各組干預結束后進行大鼠行為學測試，測定機械性刺激閾值和熱刺激回縮時間。處死大鼠，HE染色觀察各組椎間盤軟骨終板結構的差異。TUNEL染色觀察大鼠椎間盤纖維環細胞變化。實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測大鼠椎間盤纖維環組織miR-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法檢測大鼠椎間盤纖維環組織VEGF蛋白表達。結果 與假手術組比較，模型組大鼠椎間盤血管芽數目減少，大鼠椎間盤纖維環細胞破壞明顯、大量凋亡且細胞密度降低；模型組和中藥組機械性刺激閾值降低，熱刺激回縮時間縮短，miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠椎間盤血管芽數目增加，大鼠椎間盤纖維環細胞破壞減輕，大鼠椎間盤纖維環細胞凋亡減少且細胞密度增加，機械性刺激閾值升高，熱刺激回縮時間延長，miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）。結論 益氣活血通絡方治療脊髓型頸椎病的機制可能與上調miR-126a-5p、下調VEGF表達有關。

關鍵詞：頸椎??；血管內皮生長因子類；椎間盤；脊髓；益氣活血通絡方；miR-126a-5p

中圖分類號：R681.531.1文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230607

Effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on miR-126a-5p and VEGF signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats

LIU Dan， TANG Zhanying， LI Pan， YUAN Weina， LI Fangfang， CHEN Qian， HU Zhijun△

Department of Rehabilitation Medicine， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 200032， China

△Corresponding Author E-mail： hzjz1062@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on microRNA-126a-5p （miR-126a-5p） and vascular endothelial growth factor （VEGF） signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into the sham operation group， the model group and the traditional Chinese medicine （TCM） group by random number table method. Cervical spondylotic myelopathy models were prepared in the model group and the TCM group. The TCM group was given intragastric administration of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction， while the sham operation group and the model group were given intragastric administration of normal saline for 12 weeks. After intervention， the threshold of mechanical stimulation and retraction time of thermal stimulation in each group were measured by behavior tests. Rats were sacrificed to collect intervertebral disc tissue for hematoxylin-eosin （HE） staining and observe the number of vascular buds in intervertebral disc. Rat intervertebral disc annulus fibrosus cells were subjected to terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） staining. The miR-126a-5p and VEGF mRNA of rat intervertebral disc tissue were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR）. The expression of VEGF protein of rat intervertebral disc tissue was detected by Western blot assay. Results Compared with the sham operation group， the number of vascular buds in intervertebral disc was decreased in the model group and the TCM group. The cell destruction of intervertebral disc annulus was obvious in rats， and apoptosis was high and cell density decreased. Mechanical stimulation threshold decreased， and mechanical stimulation threshold decreased. The level of miR-126a-5p was decreased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein were increased. Compared with the model group， the number of vascular buds in intervertebral disc was increased in the TCM group. The destruction of intervertebral disc annulus cells was alleviated in rats. The apoptosis of annulus fibrosus cells in intervertebral disc decreased and cell density increased. The threshold of mechanical stimulation increased， and the retraction time of thermal stimulation was prolonged. The level of miR-126a-5p increased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein decreased （P＜0.05）. Conclusion The mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction in the treatment of cervical spondylotic myelopathy may be related to the up-regulation of miR-126a-5p expression and the down-regulation of VEGF expression.

Key words： cervical spondylosis; vascular endothelial growth factors; intervertebral disc; spinal cord; Yiqi Huoxue Tongluo Decoction; miR-126a-5p

脊髓型頸椎病是頸部椎間盤突出壓迫脊髓引起的頸椎病，致殘率較高［1］。該病屬于中醫“痹證”、“項強”范疇，病機為機體正氣不足、肝腎虧虛、脈絡瘀滯。益氣活血通絡方對脊髓型頸椎病具有良好療效，但機制尚不明確。多項研究發現，中藥治療脊髓型頸椎病可能與促進血管生成，改善血流動力學和微循環有關［2-3］。在椎間盤退行性病變進展過程中，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達明顯改變，退變椎體終板血管芽顯著減少［4］。Hong等［5］研究發現，miR-126可通過調控VEGF信號通路影響血管生成。本研究通過構建脊髓型頸椎病大鼠模型，旨在探討益氣活血通絡方治療脊髓型頸椎病的分子作用機制，為脊髓型頸椎病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康雄性SPF級SD大鼠30只，6～8周齡，體質量（300±15）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗前大鼠均在上海中醫藥大學實驗動物中心適應性喂養1周，飼養溫度22～26 ℃，相對濕度50%～70%。動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009，本實驗已獲得本院動物實驗倫理委員會審批通過（倫理審批號：PZSHUTCM210604003）。蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京雷根生物技術有限公司；TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；VEGF抗體購自美國Affinity公司。CWbio實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。BW-EVF2393大鼠自動足底機械刺痛儀購自美國IITC公司；JY-JX5L電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司；CFX ConnectTM熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。吸水膨脹性高分子材料（規格：5 mm×3 mm×0.8 mm）購自如皋市科力化工廠。

1.2 動物模型制備 30只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、中藥組，每組10只。參照文獻［6］，采用膨脹材料壓迫法制備脊髓型頸椎病模型。模型組、中藥組：將吸水膨脹性高分子材料置于大鼠C5—C6椎板與硬脊膜之間。假手術組：硬脊膜暴露及游離操作同模型組，但不放置吸水膨脹性高分子材料，不壓迫脊髓。各組大鼠術后紗布止血、逐層縫合，適當給予抗生素預防感染后單籠飼養。造模8周后進行斜板爬坡試驗，將大鼠放置于墊有橡膠墊的斜板上，從0°開始每次抬高5°，觀察大鼠能在斜板上停留5 s的最大角度，若發現大鼠爬行掉落，說明大鼠的下肢及軀干運動不協調，模型制備成功。

1.3 分組干預 中藥組給予益氣活血通絡方：黃芪30 g，當歸20 g，生地20 g，熟地20 g，白芍15 g，川芎9 g，丹參9 g，仙靈脾15 g，續斷10 g，懷牛膝10 g，加水300 mL煎煮并濃縮。參照文獻［7］，藥物劑量按照動物和人體表面積等效劑量比率換算，湯劑含生藥量0.70 g/mL，每次灌胃3 mL，每日1次，療程12周。假手術組、模型組給予同等容量的生理鹽水灌胃，每日1次，持續12周。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠行為學觀察 12周干預結束后，參照文獻［8］，第13周第1天采用Up-down法測定機械性刺激閾值。測量10次至少有連續5次縮足反應，探針的壓力值即為機械性刺激閾值。熱刺激回縮時間：將大鼠放置于紙筒中，后肢露于紙筒外，將大鼠的神經損傷側后肢放于一塊玻璃板上，用熱輻射儀照射足底，直到大鼠產生踮腳、回縮、舔足、掙扎等后足收縮反應，用秒表記錄從熱照射開始到大鼠后足收縮所需的時間即為熱刺激回縮時間。

1.4.2 大鼠椎間盤纖維環組織HE染色 參照文獻［9］，斷頭處死各組大鼠，剝離大鼠C5—C6椎間盤纖維環組織，一部分標本浸泡在4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，另一部分標本置于-20 ℃冷凍保存備用。經脫水、透明、包埋、切片等步驟，制作石蠟切片（3～4 μm），進行HE染色。觀察椎間盤軟骨終板結構、髓核組織、血管等病理改變。

1.4.3 TUNEL染色觀察椎間盤纖維環細胞凋亡 參照文獻［10］，各組取部分椎間盤纖維環組織切片，制備TUNEL反應混合液：用50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻；每個切片上加50 μL TUNEL反應混合液，在37 ℃濕盒避光反應1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加DAPI染色液，恒溫孵育盒避光室溫孵育20 min。PBS清洗，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學顯微鏡下觀察TUNEL陽性（凋亡細胞核呈綠色熒光）細胞數目并拍照。

1.4.4 RT-PCR檢測miR-126a-5p和VEGF mRNA 參照文獻［11］，取10 mg大鼠椎間盤纖維環組織，使用Trizol提取組織樣本中總RNA。使用CWbio RT-PCR試劑盒進行RT-PCR。反應體系：2×增強版熒光定量預混試劑10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 100 ng，加入ddH2O補足至20 μL。miR-126a-5p引物：上游5'-CCGGGCGCATTATTACTTTTGGTACGCG-3'，下游5'-CCGGGCGTTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3'；VEGF引物：上游5'-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3'，下游5'-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3'。反應條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，53～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40次。采用2-??Ct法計算miR-126a-5p和VEGF mRNA的相對表達量。

1.4.5 Western blot法檢測椎間盤纖維環組織VEGF蛋白表達 取-20 ℃冷凍保存的大鼠椎間盤纖維環組織，剪碎后于液氮中研磨至細粉末狀，分裝于離心管中，加入500 μL裂解液，充分混勻，4 ℃過夜裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。參照文獻［12］，以β-actin為內參，用Image J軟件測定條帶灰度值，計算VEGF蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。計數資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學指標比較 與假手術組比較，模型組和中藥組的機械性刺激閾值降低，熱刺激回縮時間縮短（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組的機械性刺激閾值增加，熱刺激回縮時間延長（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠椎間盤纖維環組織及細胞變化 （1）HE染色結果顯示，假手術組椎間盤軟骨終板結構完整，纖維環結構清晰，髓核組織未見明顯皺縮，關節軟骨較薄，軟骨下分布有較大血管。與假手術組相比，模型組椎間盤纖維環軟骨表面粗糙腫脹，纖維環結構紊亂，髓核組織明顯皺縮，椎間盤纖維環細胞大量凋亡，髓核突出，關節軟骨鈣化層增厚，軟骨下血管曲張，椎間盤軟骨出現明顯的退行性改變，血管芽數目顯著減少。中藥組椎間盤纖維環組織相比模型組有一定改善，其纖維環結構輕微紊亂，髓核組織輕微皺縮，纖維環軟骨厚度比模型組增大，軟骨下血管充血擴張改善，血管芽數目多于模型組。見圖1A。（2）TUNEL染色結果顯示，假手術組椎間盤纖維環細胞幾乎無凋亡。與假手術組相比，模型組椎間盤纖維環細胞大量凋亡，凋亡細胞核呈綠色熒光，細胞密度明顯降低。中藥組椎間盤纖維環細胞凋亡數目相比模型組有一定改善，細胞凋亡減少，細胞密度增加。見圖1B。

2.3 各組大鼠椎間盤纖維環組織miR-126a-5p表達水平比較 與假手術組比較，模型組和中藥組椎間盤纖維環組織miR-126a-5p表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組椎間盤纖維環組織miR-126a-5p表達水平增加（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠椎間盤纖維環組織VEGF mRNA及蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組和中藥組VEGF mRNA及蛋白表達水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組VEGF mRNA及蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

3 討論

機械性刺激閾值和熱刺激回縮時間是評價大鼠行為學特征的常用指標。研究顯示，脊髓型頸椎病模型大鼠在接受治療后，其機械性刺激閾值和熱刺激回縮時間明顯上升［13］。本研究也發現，模型組大鼠的機械性刺激閾值和熱刺激回縮時間低于假手術組，提示脊髓受壓和椎間盤退變可誘發大鼠痛覺過敏。在應用益氣活血通絡方灌胃后，大鼠的機械性刺激閾值和熱刺激回縮時間提高，提示益氣活血通絡方治療有效，促進了脊髓功能恢復，原因可能是益氣活血通絡方激活了脊髓VEGF信號通路，觸發了脊髓損傷大鼠神經病理性痛的內源性保護機制，從而提高了脊髓后角對神經性疼痛的興奮性［14］。本研究HE染色、TUNEL染色結果顯示，模型組較假手術組椎間盤血管芽數目減少，纖維環細胞大量凋亡，細胞密度明顯降低，中藥組較模型組上述指標均有改善，表明益氣活血通絡方有助于促進大鼠血管生成，減少椎間盤纖維環細胞凋亡，增加椎間盤纖維環細胞密度，提示益氣活血通絡方治療有效，促進了椎間盤纖維環細胞生長和恢復，具有一定的臨床應用價值。

微小RNA是參與轉錄后基因表達調控的非編碼RNA。目前，脊髓損傷相關疾病與微小RNA信號通路已成為研究熱點。微血管紊亂、過度炎癥和膠質增生是脊髓損傷相關疾病的關鍵病理生理變化，且與VEGF表達密切相關［15］。彭程等［16］研究發現，miR-126沉默組大鼠的脊髓組織出血水腫、神經纖維消失，脊髓損傷嚴重，而miR-126過表達組脊髓結構較好，組織水腫減輕；并且miR-126過表達與VEGF mRNA表達量密切相關，miRNA-126可作用于靶基因VEGF并調節VEGF蛋白表達。Alhasan［17］研究發現，VEGF-A基因是miR-126的靶基因，miR-126高表達可以阻斷乳腺癌細胞上的VEGF-A受體功能發揮。本研究結果顯示，相比假手術組，模型組miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA及蛋白表達增加，提示脊髓受壓和頸椎椎間盤退變可能通過下調miR-126a-5p，從而促進VEGF表達。在給予益氣活血通絡方灌胃后，中藥組大鼠的miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA及蛋白表達降低，證實了益氣活血通絡方通過上調miR-126a-5p來抑制VEGF表達?？紤]分子機制為：miR-126a-5p定位于第9號染色體表皮生長因子樣結構域蛋白7基因，該結構域可調控血管內皮抑制素的分泌，能夠特異性抑制血管內皮細胞的增殖和轉移，并誘導內皮細胞凋亡，從而抑制新生血管的生成。有研究顯示miR-126過表達可抑制血管生成，認為這可能與miR-126低表達導致VEGF表達上調、血管內皮抑制素分泌減少有關［16］。另外，從中醫理論角度分析，益氣活血通絡方含有黃芪、當歸、生地、熟地、白芍、川芎、丹參等成分，可補氣升陽、生津養血、行滯通痹。藥理學研究已證實，黃芪、當歸等藥物具有明顯的益氣活血作用并影響血管生成［18］。黃芪的化學成分主要為黃芪多糖、黃芪總皂苷、三萜類化合物。黃芪總皂苷可通過抑制VEGF信號通路活化下調表皮生長因子受體、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、缺氧誘導因子-1、VEGF等相關mRNA轉錄及蛋白表達，進而抑制血管內皮細胞增殖及毛細血管樣結構形成［19］。黃芪可顯著下調血小板-內皮細胞黏附分子和VEGF的陽性表達量，降低關節滑膜中的血管密度，抑制大鼠胸主動脈環微血管的生成［20］?，F代藥理學研究發現，丹參可改善微循環，減輕炎性滲出，保護神經功能，活血化瘀通絡［21］。在不同疾病中，丹參提取物丹酚酸B對VEGF信號通路具有雙向調節作用，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮可下調VEGF表達從而抑制血管生成，丹參酮ⅡA磺酸鈉可上調VEGF表達，從而促進血管生成［22］。

綜上所述，益氣活血通絡方治療脊髓型頸椎病的機制與上調miR-126a-5p表達、下調VEGF表達有關，該方劑可改善終板內血管芽損傷，從而修復椎間盤退變。然而，本研究未能分析中藥不同劑量對干預結果的影響，后續有待進一步驗證。

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（2023-04-23收稿 2023-06-08修回）

（本文編輯 陸榮展）