Ca2+誘導HK-2細胞焦亡及黏附性變化對含鈣腎結石形成的分子機制研究

向近杰 呂懋鑫 王夢悅 張坤 李顥

摘要：目的 探究人腎皮質近曲小管上皮細胞（HK-2）經Ca2+作用后的焦亡經典通路激活及黏附性變化對含鈣腎結石形成的作用及機制。方法 不同質量濃度的CaCl2（0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L）培養HK-2細胞24 h，使用細胞計數試劑盒（CCK-8）及流式細胞凋亡術檢測篩選最佳處理濃度。使用透射電鏡觀察高鈣環境下腎小管上皮細胞微結構的變化。在高鈣處理后用2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測細胞內活性氧（ROS）的產生，并采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應和Western blot法分別檢測高鈣刺激后HK-2細胞焦亡相關NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、gasderminD（GSDMD）和黏附分子骨橋蛋白（OPN）、CD44的mRNA和蛋白表達水平變化，酶聯免疫吸附試驗檢測白細胞介素（IL）-1β、IL-18和黏附分子單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）在高鈣刺激后的表達變化。結果 Ca2+對HK-2細胞生長具有細胞毒性并且可以促進其凋亡，Ca2+濃度越高，對HK-2細胞生長的毒性越大且凋亡率越高。高鈣可以促進HK-2細胞發生細胞膜完整性缺失、內容物釋放及胞內大量空泡產生等焦亡樣形態學改變。與對照組相比，1.0 g/L及2.0 g/L CaCl2組的ROS表達水平依次升高，焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18以及黏附相關基因OPN、CD44、MCP-1的mRNA和蛋白表達水平均依次升高（P＜0.05）。結論 高鈣能使HK-2細胞發生氧化應激損傷并產生ROS，從而激活NLRP3炎癥小體，進而導致細胞焦亡經典通路的激活和細胞黏附性的增加，最終間接促進腎結石的形成。

關鍵詞：細胞焦亡；高鈣尿癥；活性氧；細胞黏附分子；腎結石

中圖分類號：R349.5，R692.4文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231036

Molecular mechanisms of Ca2+-induced pyroptosis and adhesion changes of HK-2 cells in the formation of calcium-containing kidney stones

XIANG Jinjie， LYU Maoxin， WANG Mengyue， ZHANG Kun， LI Hao△

Department of Urology， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032， China

△Corresponding Author E-mail： lihao834@sina.com

Abstract： Objective To investigate the possible role and mechanism of activation of pyroptosis classical pathway and alterations in cell adhesion in calcium-containing kidney stones after the action of high concentration of Ca2+ on HK-2 cells. Methods HK-2 cells were cultured in the presence of different concentrations of CaCl2 （0， 0.1， 0.5， 1.0， 2.0， 4.0 and 8.0 g/L） for 24 hours， and cell counting Kit-8 （CCK-8） and flow cytometry were used to determine the optimal treatment concentration. Subsequently， the ultrastructure of renal tubular epithelial cells under high Ca2+ condition was observed by transmission electron microscopy after Ca2+ treatment. DCFH-DA staining was used to detect intracellular reactive oxygen species production， and quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） and Western blot analysis were performed to examine the expression of pyroptosis-related proteins NLRP3， Caspase-1， gasdermin D （GSDMD）， adhesive molecules osteopontin （OPN） and CD44 at mRNA and protein levels after high concentration Ca2+ treatment. The expression levels of pyroptosis-related inflammatory factors interleukin （IL）-1β， IL-18 and adhesive molecule monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） after high Ca2+ stimulation. Results Ca2+ showed cytotoxicity for HK-2 cell growth and can promote apoptosis. The higher the Ca2+ concentration， the more toxicity and apoptosis rate for HK-2 cell growth. High concentration of Ca2+ can promote pyroptosis-like morphological changes in HK-2 cells， including loss of cell membrane integrity， release of contents and numerous intracellular vacuoles. Compared with the control group， the expression levels of ROS were sequentially increased in the 1.0 g/L CaCl2 group and the 2.0 g/L CaCl2 group， and the expression levels of pyroptosis-related genes NLRP3， Caspase-1， GSDMD， and the pyroptosis-associated inflammatory factors IL-1β and IL-18， as well as the adhesion molecules OPN， CD44 and MCP-1 were significantly increased （P＜0.05）. Conclusion High Ca2+ treatment can cause oxidative stress damage in HK-2 cells to produce ROS， which activates NLRP3 inflammasome， leads to the activation of the classical pathway of pyroptosis and increase the adhesion of cells， and ultimately leads to the formation of kidney stones.

Key words： pyroptosis; hypercalciuria; reactive oxygen species; cell adhesion molecules; kidney stones

細胞焦亡是一種新的程序性細胞死亡，也是機體的一種天然免疫反應。其經典通路為炎癥小體介導并激活胱天蛋白酶（Caspase）-1，隨后活化的Caspase-1切割孔道形成蛋白gasderminD（GSDMD）轉化為GSDMD-N并在細胞膜上寡聚化形成焦亡孔隙，同時伴隨白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18等炎性因子的釋放，促進免疫炎癥反應的發生［1-2］。細胞焦亡廣泛參與諸多疾病的發生與調控，如代謝性疾?。?-4］、腎臟纖維化［5］以及多種腫瘤的發生與轉移［6］等。腎結石也屬于一種代謝性疾病，其發病率在北美、歐洲和亞洲分別為7%～14%、5%～9%和1%～5%［7］，且復發率高達50%以上［8］。因此，探討腎結石的發病機制對其預防和治療具有重要意義。研究發現，大多數腎結石患者均有代謝異常，以高鈣尿癥最常見，占40%～60%［9］。另有研究認為，高鈣尿是腎結石復發的主要診斷指標，結石復發患者24 h尿鈣濃度比未復發患者高近50%［10］。有研究發現草酸鈣（calcium oxalate，CaOx）結石的形成與腎小管上皮細胞發生的氧化應激損傷以及晶體黏附性增加有關，同時在結石形成中，細胞晶體誘導的炎癥反應也起著至關重要的作用［11-12］。本研究通過體外實驗模擬腎結石和特發性高鈣尿癥患者體內的高鈣環境，旨在探討高鈣與細胞焦亡在腎結石形成中的作用機制，以期為腎結石的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM/F12細胞培養基購自上海逍鵬生物科技有限公司；胎牛血清購自上海依科賽生物；兔抗人NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、Caspase-1、GSDMD、骨橋蛋白（OPN）、吞噬細胞糖蛋白-1（Pgp-1即CD44），β-肌動蛋白（β-actin），羊抗兔、鼠IgG抗體，IL-18酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒以及細胞計數試劑盒（CCK-8）購自武漢三鷹公司；IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；RNA Easy Fast總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）試劑購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養 HK-2細胞使用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM/F12培養基在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性 96孔板每孔接種約1×104個HK-2細胞，分為7組，每組6個復孔，每孔使用100 μL含不同質量濃度（0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L）CaCl2的培養液處理24 h，隨后每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，并置于37 ℃的恒溫培養箱中孵育2 h，在450 nm波長處用多功能酶標儀測定各孔光密度（OD）值，細胞存活率=［（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）］×100%。選擇與對照（0 g/L CaCl2處理）組比較細胞存活率出現顯著下降、但不低于50%的質量濃度進行后續實驗。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板，每孔使用不同質量濃度（0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L）CaCl2的培養液處理24 h后收集細胞。每管加入400 μL Binding Buffer重懸細胞，分出3管分別用于空白、FITC和PI單陽對照。取100 μL懸液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC和PI染料避光孵育5 min，再加入400 μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）混勻后流式細胞儀上機檢測。選擇與對照（0 g/L CaCl2處理）組比較細胞凋亡率出現顯著上升的濃度進行后續實驗。

1.2.4 透射電鏡法觀察細胞微結構變化 用含1.0、2.0 g/L CaCl2的培養液處理HK-2細胞24 h，消化后1 000 r/min離心5 min收集細胞，加入2.5%戊二醛固定細胞團2 h后使用1%瓊脂糖包裹，并使用1%鋨酸再固定2 h，隨后按照50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%乙醇-100%丙酮-100%丙酮進行逐步脫水，每次15 min，丙酮包埋劑滲透，包埋切片，鈾鉛雙染并干燥過夜后使用FEI Tecnai G2 Spirit透射電子顯微鏡采集圖像分析。

1.2.5 2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）法檢測細胞內ROS水平 HK-2細胞接種于6孔板與激光共聚焦培養皿，對照組使用不含CaCl2的培養液，實驗組使用含不同濃度（1.0、2.0 g/L）CaCl2的培養液培養24 h。采用DCFH-DA探針法檢測細胞內ROS水平［13］，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內ROS熒光強度，流式細胞儀檢測高鈣環境下腎小管上皮細胞內氧化應激水平。

1.2.6 qRT-PCR 采用試劑盒提取各組細胞總RNA，Thermo Nanodrop 2000紫外分光光度計測定總RNA濃度。將1 μg的總RNA逆轉錄為cDNA，隨后進行qRT-PCR實驗。反應體系（20 μL）：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 10 s，退火、延伸60 ℃ 30 s，循環40次。引物序列見表1。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法檢測HK-2細胞焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD，焦亡炎癥因子IL-1β、IL-18和黏附相關基因OPN、CD44、MCP-1的mRNA表達水平變化。

1.2.7 Western blot法檢測細胞內焦亡和黏附相關蛋白相對表達水平 將細胞接種于6孔板中，使用含1.0、2.0 g/L CaCl2的培養基培養細胞24 h后提取各組細胞總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量法測定各組蛋白質濃度，蛋白質樣品使用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離并轉移到PVDF膜，于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h，洗膜后加入對應一抗NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶2 000）、GSDMD（1∶2 000）、OPN（1∶1 000）、CD44（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h。ECL試劑顯色，多功能成像系統拍照，以β-actin為內參蛋白，Image J軟件分析目的蛋白條帶相對灰度。

1.2.8 ELISA檢測IL-18、IL-1β、MCP-1表達水平 用含1.0、2.0 g/L CaCl2的培養液處理HK-2細胞24 h后收集培養液，4 ℃、1 000 r/min離心10 min、取上清液，參照試劑盒說明書檢測細胞培養上清液中IL-18、IL-1β及MCP-1表達水平。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 9.4.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以[x] ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同質量濃度Ca2+對HK-2細胞存活率及凋亡率的影響 細胞存活率隨Ca2+質量濃度升高而降低；與對照組比較，Ca2+質量濃度≥1.0 g/L時細胞存活率明顯降低（P＜0.05），Ca2+質量濃度≥4.0 g/L時細胞存活率低于50%。細胞凋亡率隨Ca2+質量濃度升高而增加；與對照組比較，Ca2+質量濃度≥1.0 g/L時，細胞凋亡率明顯上升（P＜0.05），見表2、圖1。根據以上實驗結果，使用1.0、2.0 g/L的CaCl2進行后續實驗。

2.2 高鈣對HK-2細胞微結構的影響 透射電鏡下可見對照組細胞形態正常、胞膜完整、線粒體形態正常，而高鈣組細胞出現細胞膜完整性缺失、內容物釋放、線粒體明顯腫脹以及胞內大量空泡產生等細胞焦亡相關的微結構變化，見圖2。

2.3 高鈣對HK-2細胞氧化應激水平的影響 激光共聚焦顯微鏡觀察結果以及流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、1.0 g/L CaCl2組及2.0 g/L CaCl2組ROS水平均依次升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組焦亡和黏附相關基因mRNA表達水平比較 對照組、1.0 g/L CaCl2組及2.0 g/L CaCl2組細胞內焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18和黏附相關基因OPN、CD44、MCP-1的mRNA表達水平依次升高（P＜0.05），見表3。

2.5 各組焦亡相關蛋白和黏附相關蛋白表達水平比較 見表4、圖4。對照組、1.0 g/L CaCl2組及2.0 g/L CaCl2組細胞內焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD和黏附相關蛋白OPN、CD44的表達水平依次升高（P＜0.05）。

2.6 各組IL-18、IL-1β、MCP-1表達水平比較 對照組、1.0 g/L CaCl2組及2.0 g/L CaCl2組細胞培養上清液中焦亡相關炎性因子IL-1β、IL-18和黏附因子MCP-1的表達水平依次升高（P＜0.05），見表5。

3 討論

高鈣尿癥是含鈣腎結石發生、發展的重要危險因素之一［9］。Ca2+不僅是晶體的陽離子成分，暴露在高水平的Ca2+中還會導致腎小管上皮細胞損傷，其損傷程度取決于持續時間和濃度，并且因損傷產生的炎性細胞因子可能在含鈣腎結石的形成中起重要作用［14］。研究表明，CaOx晶體能夠通過腎素血管緊張素系統激活還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶復合體，從而產生ROS，導致硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1，Trx1）與硫氧還蛋白結合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）分離，進而使細胞中與NLRP3結合的TXNIP水平上升，這增加了NLRP3-TXNIP的關聯，最終導致NLRP3炎癥小體的激活［15］，對腎小管上皮細胞造成炎癥性損傷，進而促進CaOx結石的形成［16-17］。此外，暴露于高濃度草酸的腎小管上皮細胞也會啟動氧化應激反應產生ROS，ROS會通過激活P38絲裂原活化蛋白酶通路增加細胞對晶體的黏附性，并且促進晶體的連接和聚集［18］，而晶體的過度飽和與持續累積最終導致腎臟中結石的形成［19］。然而，暴露于高水平的Ca2+、草酸和CaOx晶體都會對腎小管上皮細胞造成損害，其中Ca2+和CaOx晶體均是通過ROS影響，但兩者之間沒有協同作用［14］。本研究結果顯示，不同濃度Ca2+對腎小管上皮細胞均有細胞毒性作用，并且會促進細胞凋亡；Ca2+濃度越高，對細胞的毒性越大，細胞凋亡程度也越高。相關研究表明，0.5 g/L的Ca2+水平高于腎小管上皮細胞可能接觸到的正常生理水平，然而在高鈣尿（男女性的尿鈣平均排泄量分別達到300mg/24 h和250 mg/24 h）條件下，腎結石和高鈣尿癥患者體內腎小管上皮細胞所暴露的Ca2+水平能達到1.0 g/L［14］。本研究結果亦顯示，高鈣（1.0、2.0 g/L CaCl2）會使腎小管上皮細胞發生氧化應激損傷產生ROS，而ROS能激活NLRP3炎癥小體；透射電鏡可見高鈣刺激腎小管上皮細胞后會出現細胞膜破裂、空泡產生及內容物釋放等焦亡形態樣改變；qRT-PCR和Western blot結果同樣證實，高鈣會激活HK-2細胞NLRP/Caspase-1/GSDMD焦亡經典通路，并上調焦亡相關炎性因子IL-1β、IL-18的表達來促進腎小管上皮細胞發生焦亡及炎癥反應，表明高鈣能通過細胞焦亡誘發的炎癥反應促進腎結石的形成。相關研究顯示，腎小管上皮細胞焦亡和炎癥程度與Ca2+濃度呈正相關，而炎癥反應在腎結石的形成過程中起至關重要的作用［11-12］。此外，腎小管上皮細胞黏附性的增加能促進CaOx晶體黏附于細胞表面，在CaOx腎結石的形成中發揮著重要作用［20］；而OPN、CD44、MCP-1的表達與腎小管上皮細胞的黏附性變化密切相關，是CaOx晶體附著所依賴的最廣泛的蛋白［21-22］。本研究結果顯示，高鈣作用于腎小管上皮細胞后黏附相關因子OPN、CD44及MCP-1的mRNA與蛋白表達水平均明顯上調，表明高鈣亦能通過促進腎小管上皮細胞的黏附性發生變化，從而間接促進腎結石的發生發展。

綜上所述，高鈣能通過促進HK-2細胞內ROS的產生來誘導NLRP3炎癥小體的激活，進而激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD經典細胞焦亡途徑，誘發炎癥反應，同時高鈣能使腎小管上皮細胞的黏附性發生變化，最終在含鈣腎結石的形成過程中發揮重要作用。

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（2023-07-12收稿 2023-09-26修回）

（本文編輯 陸榮展）