干酪乳桿菌清除蘋果汁展青霉素對蘋果汁品質的影響

李 江，黃佩雯，鄭香峰，楊振泉

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州 225127）

展青霉素（Patulin，PAT）是一種主要由曲霉、青霉和絲衣霉等真菌產生的次級代謝產物，具有急性毒性、慢性毒性、細胞毒性、遺傳毒性等多種生命毒性[1]。同時PAT 易溶于水[2]，使其極易進入并累積在谷物、水果、蔬菜等[3]原料及其衍生品中。此外，PAT具有耐酸性和耐高溫性，使其難以從產品中完全去除，嚴重威脅人的生命健康。目前，已有很多國家制定了水果及其制品中PAT 的最高限量標準[4]。但水果及水果制品（果汁、果醬、蜜餞等）仍然有不同程度的PAT 污染[5]，造成巨大經濟損失的同時嚴重威脅消費者健康。研究食品中PAT 污染的防治方法對整個食品產業和消費者健康具有重要意義。

目前，利用物理、化學和生物等方法去除食品中已存在的PAT 已得到研究人員的廣泛關注，其中一些方法已用于實際生產。這些方法在去除或解毒PAT 方面各有優缺點[6-7]。由于具有效率高、安全性好和可靠性強等優點，生物方法被認為是最有潛力的食品PAT 脫毒的方法之一[8]。Harwig 等[9]發現釀酒酵母在蘋果汁中發酵14 d 后將PAT 完全降解。Sumbu 等[10]報道釀酒酵母發酵能在2 周之內將蘋果汁中的PAT 降解到檢測限以下。長期以來，乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為益生菌，一直被視為食品行業的研究熱點。這些研究不僅集中在新產品的開發上，還集中于它們在食品安全領域的應用上。鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus6224，短乳桿菌L.brevis20023，嗜酸乳桿菌L.acidophilusATCC 4356和植物乳桿菌L.plantarumATCC 8014 被連續報道[11]具有去除溶液或果汁中PAT 的能力。但是在應用這些微生物清除食品中PAT 污染之前，仍然需要評估微生物清除PAT 對產品品質的影響。Gumus等[12]發現嗜酸乳桿菌DSM 20079 會使葡萄汁的pH 和粘度降低，可能會導致果汁品質降低。Wu等[13]報道添加乳酸菌后會改變糖與有機酸的比例，改善酚類化合物，從而增強葡萄汁特有的香氣和風味。雖然使用微生物去除PAT 污染獲得了良好的效果，但是也可能會不可避免地帶來產品質量下降等新問題。因此，進一步探究微生物在清除產品中PAT的過程中對產品品質的影響尤為重要，這為生物法清除霉菌毒素的實際應用提供了參考價值。

在先前的研究中，Zheng 等[14-15]發現一株干酪乳桿菌YZU01 可以高效降解蘋果汁中的PAT，但是干酪乳桿菌YZU01 在清除蘋果汁PAT 過程中是否對蘋果汁品質產生影響，仍不可知。因此，本論文在前期研究結果的基礎上，研究干酪乳桿菌YZU01 清除PAT 對蘋果汁的主要理化指標的影響，包括有機酸含量、糖含量、非酶褐變指數、透光率、酸度和色度。研究結果可為干酪乳桿菌YZU01 清除蘋果汁中PAT 污染的實際應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

商業化蘋果汁（100%純果汁） 杭州味全食品有限公司；菌株 本實驗室篩選，已證明可降解展青霉素的干酪乳桿菌L.caseiYZU01；MRS 培養基；PAT 標準品 青島普瑞邦生物工程有限公司；L（+）-酒石酸、乙酸、一水合檸檬酸、富馬酸、葡萄糖、半乳糖 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蘋果酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；高氯酸（色譜純） 阿拉丁生化試劑有限公司。

PICO 17 離心機 賽默飛世爾科技公司；H/T16MM 臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；YXQ-50SII 高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；ES-E120B 精密微量天平 天津市德安特傳感技術有限公司；GNP-9270BS-III 隔水式恒溫培養箱上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1F 無菌工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀 日本島津公司；Shodex KC-811 色譜柱、Shodex KS-801 色譜柱、Shodex KC-G 6B 緩沖柱、Shodex KS-G 6B 緩沖柱 昭和化工株式會社；CR-400/410 DP-400 色差儀 柯盛行儀器有限公司；PHS-2F 酸度計 上海儀電（集團）有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果汁中L.caseiYZU01 的生長動態測定取100 μL 濃度為1×108CFU/mL 的L.caseiYZU01菌液接種于MRS 培養基，37 ℃下培養36 h 后離心收集菌體。用生理鹽水洗滌菌體，通過離心收集洗滌完的菌體后置于1 mL 0.9%生理鹽水中。將1 mL上述菌體（6×108CFU/mL）接種到5 mL 蘋果汁中，每12 h 取樣（0、12、24、36、48 h）200 μL 測OD600吸光值，另取樣100 μL 按梯度稀釋6 次后，將第六次稀釋完的液體取100 μL 涂布到MRS 固體培養基中，長出菌后，菌落計數，每組3 個重復。以添加1 mL 0.9%生理鹽水的蘋果汁為對照組。

1.2.2 蘋果汁品質相關指標檢測 實驗設計：取100 μL 濃度為1×108CFU/mL 的L.caseiYZU01 菌液接種于MRS 培養基，37 ℃下培養，48 h 后收集L.caseiYZU01 菌液，離心（10000 r/min，10 min，4 ℃）。將細胞沉淀用生理鹽水洗滌3 次，重懸于1 mL 生理鹽水中。本次實驗分為三組，第一組樣品為商業蘋果汁組（Commercial apple juice，CAJ）：僅含蘋果汁；第二組樣品為商業蘋果汁+PAT 組（CAJpatulin）：含10.9 μg/mL PAT 的蘋果汁；第三組樣品為商業蘋果汁+PAT+干酪乳桿菌組（CAJ-patulin-L.caseiYZU01）：含10.9 μg/mL PAT 的蘋果汁和L.caseiYZU01 菌體（濃度為6×108CFU/mL）。團隊前期研究結果表明，L.caseiYZU01 在上述生長動態測定的48 h 內已將展青霉素完全降解[15]，因此可進一步研究L.caseiYZU01 在降解蘋果汁中PAT 的過程中對相關質量指標的影響。對實驗組樣品37 ℃恒溫培養，每隔24 h（0、24、48、72 h）取一次樣。離心（10000 r/min，5 min，4 ℃），取上清液于1.5 mL 離心管中。（上清液:生理鹽水=1:9）配制成1 mL 溶液于1.5 mL 離心管中，渦旋混勻后，經0.22 μm 濾膜進行膜過濾，制得最后檢測樣品。

1.2.2.1 蘋果汁中有機酸含量測定 利用高效液相色譜-紫外光譜法檢測有機酸含量[16]：色譜分析柱Shodex KC-811（8.0 mm×300 mm，6 μm）、緩沖柱Shodex KC-G 6B（6.0 mm×50 mm，10 μm）；紫外檢測波長210 nm；流動相為3 mmol/L 的高氯酸溶液；流動相流速1.0 mL/min；柱溫50 ℃；進樣量10 μL；采集時間20 min，檢測樣品。定性方法：所測有機酸標準品的保留時間；定量方法：建立基于有機酸含量與有機酸峰面積相關性的標準曲線。

1.2.2.2 蘋果汁中葡萄糖和半乳糖含量測定 樣品處理如1.2.2 所述。利用高效液相色譜-示差折光檢測法測定葡萄糖和半乳糖含量[17]：色譜分析柱Shodex KS-801（8.0 mm×300 mm，6 μm）、緩沖柱Shodex KS-G 6B（6.0 mm×50 mm，10 μm）；流動相為超純水；流動相流速0.7 mL/min；柱溫80 ℃；進樣量10 μL；采集時間20 min，檢測樣品。定性方法：葡萄糖和半乳糖標準品的保留時間；定量方法：建立基于葡萄糖和半乳糖含量與葡萄糖和半乳糖峰面積相關性的標準曲線。

1.2.2.3 蘋果汁酸度測定 樣品處理如1.2.2 所述。各處理組每24 h（0、24、48、72 h）取樣用pH 計直接測定，每個樣重復三次。

1.2.2.4 蘋果汁非酶褐變指數測定 樣品處理如1.2.2 所述。各處理組37 ℃恒溫培養，每隔24 h（0、24、48、72 h）取一次樣。離心（10000 r/min，5 min，4 ℃），取上清液于1.5 mL 離心管中。（上清液:生理鹽水=1:9）配制成1 mL 溶液于10 mL 離心管中，再加入1 mL 95%乙醇溶液，渦旋，離心（7800 r/min，10 min，4 ℃），取上清液于10 mL 離心管中。將紫外分管光度計調至波長420 nm，檢測樣品并記錄。

1.2.2.5 蘋果汁透光率測定 樣品處理如1.2.2 所述。各處理組37 ℃恒溫培養，每隔24 h（0、24、48、72 h）取一次樣。離心（10000 r/min，5 min，4 ℃），取上清液于1.5 mL 離心管中。（上清液:生理鹽水=1:9）配制成2 mL 溶液于10 mL 離心管中，渦旋。將紫外分管光度計調至波長650 nm，檢測樣品并記錄。

1.2.2.6 蘋果汁色度測定 樣品處理參考1.2.2.5。用色差儀依次進行樣品的測定，記錄L*、a*、b*值。

1.3 數據處理

數據采用Origin 2018 和SPSS 26.0 對所得的實驗數據進行統計分析，所得數據以圖表和均值±標準偏差（±SD）的形式表示。

2 結果與分析

2.1 L. casei YZU01 在蘋果汁中的生長動態

由圖1 所示，蘋果汁中干酪乳桿菌OD 值維持在0.7～0.9，蘋果汁中菌數在108～109CFU/mL 范圍內。表明L.caseiYZU01 在果汁中緩慢生長，具有良好的發酵性能，為之后蘋果汁發酵過程中對PAT的清除提供了可能。

圖1 L. casei YZU01 在蘋果汁中生長動態分析圖Fig.1 Growth dynamic analysis of L. casei YZU01 in apple juice

2.2 L. casei YZU01 對蘋果汁中有機酸含量的影響

果汁中的有機酸對果汁的感官特性、營養品質有重要影響[17]。本研究對干酪乳桿菌YZU01 在清除蘋果汁中PAT 過程中，對蘋果汁中幾種有機酸（酒石酸、L-蘋果酸、乙酸、富馬酸、檸檬酸）的含量變化進行了研究，結果如圖2 所示。CAJ 組和CAJ-patulin組在72 h 內酒石酸（圖2A）含量穩定在2.4 g/kg、富馬酸（圖2D）含量穩定在0.12 g/kg、檸檬酸（圖2E）含量穩定在0.20 g/kg 左右。而在CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組中，三種酸的含量均有不同程度的上升。在72 h 內，酒石酸含量上升了47.83%，檸檬酸含量呈穩定上升趨勢，較初始值增加了11 倍，富馬酸在前24 h 含量增加后保持穩定，含量在0.15 g/kg左右?？梢园l現的是，檸檬酸的含量在干酪乳桿菌去除PAT 過程中受影響較大，而酒石酸和富馬酸在干酪乳桿菌去除PAT 過程中受影響較小，推測干酪乳桿菌發酵促進了檸檬酸的積累。L-蘋果酸是蘋果汁中最重要且含量最高的有機酸。CAJ 組和CAJpatulin 組中，L-蘋果酸的含量隨時間變化不大，72 h時CAJ 組L-蘋果酸含量僅增加了1.72%，CAJ-patulin 組L-蘋果酸含量僅降低了1.97%。而在加入了干酪乳桿菌YZU01 和PAT 的蘋果汁（CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組）中，L-蘋果酸含量出現了大幅下降，72 h 時L-蘋果酸含量下降了28.04%（圖2B）。在CAJ 組和CAJ-patulin 組中，乙酸含量始終保持為0 g/kg，而在CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組中，乙酸含量從0 g/kg 上升為0.66 g/kg（圖2C）。Herrero等[18]報道蘋果酸含量在乳酸菌和酵母混合發酵過程中顯著下降。Dudley 等[19]研究表明，乳酸菌利用三羧酸循環產生的檸檬酸合成琥珀酸，同時還會產生其他有機酸，直接影響果汁的酸味，從而會對果汁的品質產生一定的影響。在本研究中，L.caseiYZU01 在降解PAT 的過程中進行三羧酸循環，L-蘋果酸作為三羧酸循環的中間體，參與不同的生化反應，最終被分解為其他物質而導致含量下降[20]。乙酸是干酪乳桿菌發酵的產物。在厭氧條件下，乳酸菌代謝丙酮酸而產生乙酸等產物[21]。本次實驗也驗證了這一點。

圖2 L. casei YZU01 對蘋果汁中有機酸含量的影響Fig.2 Effect of L. casei YZU01 on the content of organic acids in apple juice

2.3 L. casei YZU01 對蘋果汁中葡萄糖和半乳糖含量的影響

糖分是反映果汁甜味的最重要的物質[22]。蘋果汁中的糖類物質主要有葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯聚糖等。本文進一步研究了L.caseiYZU01在清除PAT 時，對蘋果汁中葡萄糖和半乳糖的影響。研究結果如圖3 所示。在0～72 h 內，CAJ 組和CAJ-patulin 組的葡萄糖含量變化不大，維持在30 g/kg 左右（圖3A）。而在CAJ-patulin-L.caseiYZU01組中，隨著時間的推移葡萄糖的含量迅速下降，葡萄糖含量由38.59 g/kg 下降為1.59 g/kg，這是因為當乳酸菌進行生長和代謝時，葡萄糖被大量分解。半乳糖含量的變化趨勢與葡萄糖相似，在0～72 h 內，CAJ 組和CAJ-patulin 組半乳糖的含量維持穩定。在CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組中，半乳糖的含量迅速減少，含量下降了58.01%（圖3B）。研究顯示過多地攝入游離糖，尤其是含糖飲料的過量攝入會對身體造成嚴重危害，如患心臟病、糖尿病、肥胖、脂肪肝等及加速衰老。在本實驗中，L.caseiYZU01 處理蘋果汁后含糖量的減少，有益機體健康。

圖3 L. casei YZU01 對蘋果汁中葡萄糖（A）和半乳糖（B）含量的影響Fig.3 Effect of L. casei YZU01 on the content of glucose (A)and galactose (B) in apple juice

2.4 L. casei YZU01 對蘋果汁酸度的影響

進一步對干酪乳桿菌處理蘋果汁后對蘋果汁酸度的影響進行了研究。結果如圖4 所示。在0～72 h內，CAJ 組與CAJ-patulin 組樣品的酸度變化不大，穩定在3.7 左右。CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組樣品的pH 在0～24 h 呈下降趨勢，pH 由3.67 降至3.60，在24～72 h 內pH 穩定在3.6 左右。以上結果說明，蘋果汁中加入L.caseiYZU01，會引起果汁酸度增加。因為乳酸菌的生長需要消耗ATP，而乳酸菌的產能途徑只有糖代謝，乳酸菌生長同時必然伴隨著糖代謝產酸，有機酸是乳酸菌的主要代謝產物。果汁中有機酸的積累造成pH 降低，這也論證了前文中，干酪乳桿菌在降解蘋果汁中PAT 時，檸檬酸、酒石酸、富馬酸和乙酸含量增多會帶來的影響，但總體上來看，pH 僅下降了0.1 左右，對果汁總酸度的影響并不大，不會損害其原口感。

圖4 L. casei YZU01 對蘋果汁酸度（pH）的影響Fig.4 Effect of L. casei YZU01 on the acidity (pH)of apple juice

2.5 L. casei YZU01 對蘋果汁非酶褐變指數的影響

色澤是影響果汁的重要品質之一[23]。果蔬汁加工過程中極易發生褐變現象[24]，而果汁加工貯藏過程中的褐變包括酶促褐變和非酶褐變兩大類。酶促褐變只要熱處理徹底，就不會影響果汁色澤。非酶褐變才是影響果汁品質的主要因素[25]。非酶褐變會產生類黑精色素、紅色素、黃色素等，使果汁顏色加深，對品質產生不良影響。乳酸菌發酵能夠保護果汁色澤、預防褐變[26]。

在本次實驗中，非酶褐變指數測定結果如圖5所示。CAJ-patulin 組和CAJ-patulin-L.caseiYZU01組在0 h 時非酶褐變指數比CAJ 組高，說明PAT 或L.caseiYZU01 的加入可能引入新的參與褐變反應的基團，導致非酶褐變指數的增加。但在0～72 h 之間，CAJ-patulin 組和CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組非酶褐變指數均逐漸下降，這可能是因為參與褐變反應的基團被失活。CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組吸光度由0.6235 下降至-0.1500，且在降解72 h 時比CAJ 組更低。以上結果說明，L.caseiYZU01 清除蘋果汁PAT 過程中不會引起蘋果汁的非酶促褐變反應，不會對果汁色澤產生不良影響。結果說明L.caseiYZU01 處理對蘋果汁非酶褐變指數無不良影響。

圖5 L. casei YZU01 對蘋果汁非酶褐變指數的影響Fig.5 Effect of L. casei YZU01 on the non-enzymatic browning index of apple juice

2.6 L. casei YZU01 對蘋果汁透光率的影響

生物混濁是由于微生物及其代謝引起的混濁現象[27]。在本研究中，干酪乳桿菌對蘋果汁濁度的影響，結果如圖6 所示。CAJ-patulin-L.caseiYZU01組的透光率變化趨勢在0～24 h 由42.61%上升至76.74%，而后迅速下降，在48 h 為13.98%，在48～72 h，透光率稍有上升，最終為44.06%。當干酪乳桿菌生長代謝時，常產生乳酸等物質，引起液體的混濁。本研究中也發現干酪乳桿菌在降解蘋果汁中PAT 過程中，菌體顏色或乳酸產生等引起的生物混濁會導致透光率的大幅度波動，在一定程度上影響蘋果汁的品質。

圖6 L. casei YZU01 對蘋果汁透光率的影響Fig.6 Effect of L. casei YZU01 on the light transmittance of apple juice

2.7 L. casei YZU01 對蘋果汁色度的影響

對于蘋果汁色度的測定，亮度L*值，紅綠值a*，黃藍值b*代表了顏色的變化。本研究測定了樣品的L*，a*，b*結 果 如 圖7 所 示。CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組亮度L*，呈穩定趨勢，且與CAJ 組亮度L*接近，說明干酪乳桿菌清除毒素過程中并不會對果汁的亮度有顯著的影響。紅綠值a*呈負值，a*絕對值越大顏色越接近純綠色。經過72 h 培養，CAJ 組紅綠值a*降低，絕對值變大，綠色加深，可能是因為亞鐵離子的氧化。而CAJ-patulin-L.caseiYZU01 組紅綠值a*的絕對值變低，說明L.caseiYZU01 清除毒素過程中會使蘋果汁綠色變淺，保持亞鐵離子的還原狀態。黃藍值b*為負值，表示藍色，黃藍值b*絕對值越大顏色越接近純藍色，b*=0 時為灰色。三組樣品在72 h 內黃藍值b*變化不大，培養72 h 后，CAJpatulin-L.caseiYZU01 值接近CAJ 的黃藍值b*，說明乳酸菌降解PAT 的過程中并不會很大程度影響原蘋果汁的黃藍值b*。整體來說，在L.caseiYZU01降解PAT 時，對于亮度L*值、黃藍值b*的影響很小，而使紅綠值a*稍稍增大，代表蘋果汁綠色變淺。

圖7 L. casei YZU01 對蘋果汁色度的影響Fig.7 Effect of L. casei YZU01 on the color of apple juice

3 結論

本文研究了具有PTA 降解作用的干酪乳桿菌L.caseiYZU01 清除蘋果汁PAT 過程中對蘋果汁品質的影響。研究結論如下：L.caseiYZU01 在蘋果汁中緩慢生長，為其在蘋果汁中去除PAT 提供了優勢。L.caseiYZU01 清除展青霉素過程中，蘋果汁有機酸的含量呈現不同程度的變化，檸檬酸、酒石酸、富馬酸和乙酸的含量增多，L-蘋果酸的含量減少；葡萄糖和半乳糖的含量大幅減少；蘋果汁透光率大幅度波動，蘋果汁的紅綠值a*增大。但L.caseiYZU01 對蘋果汁亮度L*值、黃藍值b*值的影響較小。并且處理過程不會引起非酶促褐變反應，不會對果汁色澤產生不良影響。以上說明，L.caseiYZU01 能夠應用于果汁生產環節。但是干酪乳桿菌在清除過程中是否會對蘋果汁其他的性質產生影響，仍需進一步探究。本研究為果汁中展青霉素的降解提供了一定的理論依據，在食品質量安全控制領域具有非常重要的意義。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).