蠟樣芽孢桿菌GW-01 全基因組測序及生物學特性分析

劉 珊，蔣楊丹，顏佶沙，謝宇宣，趙思佳，何啟田，趙甲元,*

（1.西南土地資源評價與監測教育部重點實驗室（四川師范大學），四川成都 610101；2.四川師范大學生命科學學院，四川成都 610101；3.浙江大學生物系統工程與食品工程學院，浙江杭州 310000）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）為兼性厭氧，產芽孢的革蘭氏陽性菌桿菌，在土壤、空氣及動物腸道中普遍存在[1]，該菌能形成熱穩定性孢子，具有很強的環境適應性[2]。蠟樣芽孢桿菌與炭疽芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、細胞毒性芽孢桿菌等細菌的16S rRNA 相似度極高，難以區分[3]。蠟樣芽孢桿菌是一種傳統的食源性致病菌，通常認為食物中Bc 含量超過105CFU/g 可引起動物和人類的食物中毒，出現腹瀉和嘔吐等癥狀[4]。由于蠟樣芽孢桿菌次級代謝產物豐富，也是益生菌常用菌種之一[5]，常被用作人和畜禽的口服菌劑，具有促進腸道優勢菌群的生長[6]、抑制病原菌增殖[7]、減輕術后炎癥[8]、緩解腸道炎癥反應[9]、增強腸道上皮屏障功能和先天免疫功能[8]。蠟樣芽孢桿菌能大量表達蛋白酶與脂肪酶，Shahn等[10]利用益生菌蠟狀芽孢桿菌DM423 與植物乳桿菌共發酵香腸，促進了香腸風味物質的形成。蠟樣芽孢桿菌還可分泌細菌素、抗菌肽或其他具有抑菌能力的物質來發揮抑菌功能，進而預防腸道微生物感染[11]。本團隊前期從健康的雌性綿羊瘤胃中篩選到可降解高效氯氰菊酯（β-CY）的蠟樣芽孢桿菌GW-01[12-13]，并發現其作為口服菌劑可有效降低小鼠體內β-CY 的積累[14]。然而，其能否應用于人體需要更多的證據。

隨著基因組測序技術、生物信息學的不斷發展與進步，利用微生物全基因組對Bc 的安全性分析成為可能。傳統的實驗和鑒定方法很難全面地分析GW-01 生物學特性，也不能充分挖掘其功能基因，為了從基因層面深入了解該菌，本文采用二代Illumina Hiseq 與三代Pacbio 平臺相結合的測序技術，對蠟樣芽孢桿菌GW-01 進行全基因組測序，利用NR、Swiss-Prot、COG、GO 和KEGG 數據庫進行基因功能注釋，并預測其毒力因子與抗性基因，為GW-01的安全性分析提供全基因組維度的證據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌GW-01 從5 歲健康雌性綿羊（中國武威）的瘤胃食糜中分離得到，篩選時表現出對氯氰菊酯有一定的降解作用，現由四川師范大學生命科學學院微生物實驗室保存；高效氯氰菊酯 國家標準物質中心；乙腈、甲醇 色譜純，上海吉至生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker DL2000，寶日醫生物技術（北京）有限公司；6×DNA Loading Buffer北京蘭杰柯科技有限公司；熒光染料（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit） 美國賽默飛公司。Agilent 1200 HPLC 高效液相色譜儀 安捷倫生物科技有限公司；NanoDrop 2000 紫外分光光度計美國賽默飛公司；ABI9700 PCR 儀 美國應用生物系統公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Illumina HiSeq X Ten 測序儀 Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株GW-01 培養及對β-CY 降解率的測定將甘油保存的GW-01 菌株劃線于LB 固體培養基中，培養條件37 ℃、24 h，然后用無菌生理鹽水洗下并用紫外分光光度計將細胞濃度調節至OD600nm約0.8 制成種子液。

將GW-01 種子液按5%的接種量接種于含100 μg/mL 的β-CY 的LB 培養基中，分裝于30 mL/瓶。同時接種5%無菌生理鹽水作為空白對照，37 ℃、135 r/min 條件下培養，測定不同培養時間條件下GW-01 對β-CY 的降解情況。

將30 mL 培養液加入等量的乙腈，超聲處理破碎30 min，取10 mL 超聲破碎后的培養液于6000 r/min 離心10 min，并用0.45 μm 的有機相濾膜過濾上清液以去除樣品中的雜質，用液相色譜檢測上清濾液中β-CY 的含量。通過采用配有二極管陣列檢測器（DAD）的Agilent1200 高效液相色譜儀，以乙腈-水（85:15，v/v）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測時間為15 min，色譜柱為Eclipse plus C18，紫外檢測器波長為220 nm。

式中：A0為高效氯氰菊酯初始濃度（μg/mL）；A 為高效氯氰菊酯降解后濃度（μg/mL）。

1.2.2 菌株總DNA 提取 依據細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書對菌株GW-01 進行總DNA 提取。首先DNA 的純凈度通過使用NanoDrop 2000 進行檢測，OD260/280=1.8～2.0，OD260/230=2.0～2.2；用熒光染料（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）檢測DNA 的濃度，濃度應大于50 ng/μL；最后用核酸電泳法檢測DNA 完整度，將5 μL 的基因組樣品與1 μL 6×DNA Loading Buffer 吹打混勻后加入到1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，觀察基因組DNA 有無彌散，以此來檢測DNA 是否降解。

1.2.3 菌株GW-01 基因組文庫制備及測序 本次測序委托成都邁樂賽生物科技有限公司完成。樣本質檢合格后，利用Covaris 打斷DNA 樣品，使其呈現片段化，進行文庫構建。采用第二代 Illumina NovaSeq 平臺與第三代PacBio 平臺相結合的測序技術進行測序。

1.2.4 基因組序列拼接及分析 使用HGAP[15]、CANU[16]軟件將Pacbio 獲得的下機數據進行拼裝以得到contig 序列。使用pilon[17]軟件將二代獲得的高質量數據和三代contig 序列進行校正，最終進行拼接以得到完整序列，并對拼接最終得到的完整序列進行拼裝效果評價。

1.2.5 基因功能分析 通過BLAST 軟件（Basic Local Alignment Search Tool）與 Gene Ontology（GO）[18]、Cluster of Orthologous Groups of Proteins（COG）[19]，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）[20]通路分析工具、Non-Redundant Protein Database（NR）[21]非冗余蛋白數據庫，Carbohydrate-Active EnZymes Database（CAZy）[22]碳水化合物活性酶、Swiss-Prot[23]蛋白質序列功能信息數據庫、毒力因子數據庫（VFDB）[24]和綜合抗生素抗性基因數據庫（CARD）[25]，進行對比分析，使用Diamond 軟件對致病系統進行比對分析，獲得相應的注釋結果。

1.2.6 菌株GW-01 的進化和比較基因組學分析根據菌株GW-01 全基因組注釋信息，選擇gyrA基因序列及NCBI 數據庫比對分析結果，利用MEGA 11.0 軟件的Neighbor-Joining 法構建系統發育樹。

1.3 數據處理

GW-01 菌株對β-CY 降解率測定用Origin 2021軟件進行數據分析，所得數據為均值±標準差（±SD）。

2 結果與分析

2.1 菌株GW-01 對β-CY 降解率的測定

由圖1 所示，蠟樣芽孢桿菌GW-01 能降解100 μg/mL 的β-CY，并且隨著培養時間的增加，菌株GW-01 對β-CY 的降解率逐漸增加，在第6 d 達到最大降解率48.4%。

圖1 GW-01 在不同時間內對β-CY 的降解率Fig.1 Degradation rate of β-CY by GW-01 at different times

2.2 菌株GW-01 全基因組概況

采用第二代Illumina NovaSeq 測序平臺與第三代PacBio 測序平臺相結合，對菌株GW-01 進行全基因組測序。如圖2 所示，GW-01 菌株全基因組大小為5244145 bp，基因組類型為環狀，GC 的平均含量為36.43%，編碼的基因為5314 個，含有104 個tRNA 基因，313 個ncRNA。

圖2 蠟樣芽孢桿菌GW-01 基因組圈圖Fig.2 Genomic circle diagram of Bacillus cereus GW-01

2.3 菌株GW-01 的進化和比較基因組學分析

芽孢桿菌屬內的種間親緣關系較近，不能采用16S rRNA 基因來分析芽孢桿菌屬物種間的進化關系，因此保守蛋白編碼基因在系統發育分析時具有更高的分辨率[26]，其中gyrA是常用于芽孢桿菌鑒定的保守蛋白編碼基因，可以用于區分桿菌種間的差異[27-28]。將菌株GW-01 與五株蠟樣芽孢桿菌來源的gyrA 蛋白序列構建進化樹如圖3 所示，菌株GW-01 與CC-1 和M3 聚在一起，表明GW-01 與這兩株菌在進化時尚存在密切的關系。推測GW-01可能出現在CC-1 之前，M3 之后。

圖3 基于GW-01 及近緣種gyrA 蛋白氨基酸序列構建進化樹Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed based on gyrA protein sequence of GW-01 and its related bacterial species

選取與菌株GW-01 親緣關系非常相近的四株蠟樣芽孢桿菌CC-1、M3、G1-1、M13 進行分析，并從NCBI 上下載這四株Bc 的基因組概況如表1 所示，GW-01 與CC-1 基因組大小和tRNA 數最為接近，GW-01 的GC 含量比例高于其他菌株，編碼蛋白數與M3 最為接近。蠟樣芽孢桿菌GW-01 與其他四株菌獨有基因和共有基因如圖4 所示，共有的基因有630 個，GW-01、CC-1、M3、M13 和G1-1 獨有的基因分別為554、627、954、409 和598。

表1 蠟樣芽孢桿菌GW-01 全基因組特征及其與其他近緣芽孢桿菌比較Table 1 Genome characteristics of Bacillus cereus GW-01 and comparison with other Bacillus relatives

圖4 五株蠟樣芽孢桿菌菌株獨有基因和共有基因的韋恩圖Fig.4 Venn diagram of unique and shared genes of five kinds of Bacillus cereus strains

2.4 基因組的功能注釋

將預測基因的蛋白序列與GO、KEGG、NR、CAZy、CARD、VFDB 和Swiss-Prot 各功能數據庫進行比對分析（Evalue≤1e-5），選取蛋白質序列匹配程度高即Score 最高的比對結果（默認Identity≥40%，Coverage≥40%）進行注釋。最終發現菌株GW-01 基因組共有5314 個基因比對成功得到注釋，其中在GO、KEGG、NR、COG 和Swiss-Prot 中得到功能注釋的基因較多，分別為3536、4714、5290、4434 和3854 個，占基因總數的66.60%、38.72%、99.62%、83.50%、72.58%

2.4.1 GO 注釋結果 將菌株GW-01 蛋白序列與GO（Gene Ontology）數據庫進行比對，統計分析發現，被注釋的基因共有3536。如表2 所示，GO 數據庫按照生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）對蛋白進行注釋，共計80 條目，每組分別包括42、13 和25 個。在BP 中注釋的基因數為9320，涉及最多基因的條目包括生物過程（Biological_process）、細胞氮化合物代謝過程（Cellular nitrogen compound metabolic process）和生物合成過程（Biosynthetic process），分別有3321、1103 和1060 個；CC 中，注釋基因數為3930，其中與細胞（Cell）、細胞組分（Cellular_component）、細胞內部分（Intracellular）、細胞質（Cytoplasm）相關的基因表現出最高相關性，各有1067、1023、698、491 個；MF 大類中注釋的基因數為7116，其中涉及最多基因的條目為分子功能（Molecular_function）、離子結合（Ion binding）、DNA 結合（DNA binding）和氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity），其數量分別為3166、1007、474 和455。

表2 菌株Bacillus cereus GW-01 GO 功能分類Table 2 GO functional classification of Bacillus cereus GW-01

2.4.2 COG 注釋結果 對菌株GW-01 基因組中編碼功能性蛋白的基因進行COG 注釋，發現被注釋到具有生物學活性的蛋白編碼基因共4434 個。如圖5所示，基因功能注釋信息分為25 類，分別有0、0、213、35、342、112、246、123、104、196、368、176、253、30、110、273、62、0、1448、185、32、116、10、0、0 個基因注釋分類到A～Z。較豐富的幾個類別依次是轉錄（Transcription）共368 個基因，占注釋基因總數的6.93%；氨基酸代謝及轉運（Amino Acid Transport and Metabolism）共342 個基因，占注釋基因總數的6.44%；而關于無機離子轉運與代謝（273 個基因，5.14%）、碳水化合物運輸和代謝（246 個基因，4.63%）、蛋白質翻譯、核糖體結構和生物合成（196 個基因，3.69%）的基因也得到較多的注釋。此外，還有1448 個基因（27.25%）尚未確定功能，這些基因可能賦予菌株某些特殊的生物學功能，有待今后進一步的研究。

2.4.3 KEGG 注釋結果 將菌株GW-01 所獲得的基因組信息與KEGG 數據庫進行比對并分析，如圖6所示，4714 個基因對應到KEGG 通路，富集在48 條代謝通路中。KEGG 富集分析顯示，信號和細胞過程（Signaling and cellular processes）、遺傳信息處理（Genetic information processing）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）是最主要的3 種代謝通路，分別有668、616 和433 個基因注釋結果；此外，氨 基 酸 代 謝（ Amino acid metabolism） 、 代 謝（Metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）、輔助因子和維生素的代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、信號轉導（Signal transduction）通路與GW-01 菌株基因組相比，具有較高相關度。

圖6 菌株 Bacillus cereus GW-01 基因組KEGG 功能分類Fig.6 KEGG functional classification of Bacillus cereus GW-01

2.4.4 CAZy 功能分析 CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes Database）即專門用于研究和分類碳水化合物活性酶的數據庫。該數據庫提供了廣泛的酶家族和分類，包含了與糖苷鍵降解、修飾及生成等相關的酶類家族。主要包含5 大分類：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）、糖基轉移酶（Glycosyl Transferases，GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs）、輔助活性酶（Auxiliary Activities，AAs）。在碳水化合物的降解、合成修飾過程中發揮重要的作用。此外，CAZy 還包含了與碳水化合物結合相關的酶（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs）。

將菌株GW-01 基因組序列通過CAZy 數據庫進行比對功能注釋，如圖7 所示，發現其蛋白質結構域屬于CAZy 家族的編碼基因共有135 個，包括糖苷水解酶（GHs）家族的蛋白34 個、碳水化合物酯酶（CEs）38 個、11 類糖苷轉移酶家族的蛋白（GTs）43 個、多糖裂解酶（PLs）0 個、輔助酶8 個、3 類碳水化合物結合組件（CBMs）12 個。

圖7 菌株Bacillus cereus GW-01 基因組CAZy 注釋Fig.7 CAZy annotation of Bacillus cereus GW-01

2.5 毒力因子分析

毒力因子是指微生物（如細菌、病毒、真菌等）能夠在特定物種的宿主內建立自身并增強其引起毒性或致病性潛力的基因產物，在致病機制中發揮關鍵作用，使微生物能夠侵入宿主、定位到特定組織或細胞，并導致病原性或毒性反應。毒力因素包括細菌毒素、幫助細菌附著宿主的細胞表面蛋白、細胞表面碳水化合物和參與宿主侵入免疫逃逸的蛋白、以及可能有助于細菌在致病機制中發揮關鍵作用的的水解酶[29-30]。

在蠟樣芽胞桿菌中，導致機體發生食物中毒的原因主要是該菌會產生腸毒素，包括引起腹瀉癥狀的溶血型腸毒素Hbl（hemolysin BL）、非溶血型腸毒素Nhe（nonhemolytic enterotoxin）、細胞毒素CytK（cytotoxin）、腸毒素FM（entFM）及一些特殊蛋白酶，引起嘔吐的嘔吐毒素ces（cereulide）[31-32]，其中，毒力最強的是引起嘔吐的毒素基因ces。對于不同腸致病性蠟樣芽孢桿菌，其攜帶的毒力基因數目、毒力基因表達情況各不相同，因此各菌株對宿主的致病性也不盡相同[33]。

將菌株 GW-01 和四株近緣菌株的基因組與VFDB 數據庫進行比對分析，毒力因子相 關基因數預測如表3、表4 所示，與其他四株菌相比，菌株GW-01 毒力因子相關基因數占整體基因比率最低，僅占 0.49%，在典型腸毒素基因鑒定中菌株 GW-01中只檢出了Nhe（A、B和C）。研究表明腸毒素基因或某種毒素基因譜的存在并不一定證實蠟樣芽孢桿菌菌株具有毒性活性[34]。

表3 蠟樣芽孢桿菌GW-01 及其與其他近緣芽孢桿菌毒力因子Table 3 Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence factors

表4 蠟樣芽孢桿菌GW-01 及其與其他近緣芽孢桿菌毒力基因型Table 4 Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence genotypes

2.6 抗性基因分析

在遺傳、環境等選擇壓力的情況下蠟樣芽胞桿菌會發生基因突變。濫用抗生素或長時間暴露于抗生素下，蠟樣芽胞桿菌對藥物的敏感性會逐漸降低，從而加速細菌耐藥性的發展使菌株產生耐藥性[35]。

將菌株GW-01 和其他四株菌通過CARD 數據庫進行注釋，結果如表5 所示，與其他四株近緣菌相比，菌株GW-01 與耐藥相關的基因最少共96 個，僅占0.18%?？赡艿哪褪芩幬镉辛挚擅顾?、利福平、達托霉素、止夫西地酸、磷霉素、青霉素、磺胺、氟喹諾酮、四環素、桿菌肽、大環內酯、鏈霉素共12 種。目前認為，靶基因突變在細菌對抗生素耐藥中起重要作用，通過對靶基因的調控表達可能改變菌株抗性，在菌株GW-01 中有24 個抗生素靶基因，可能成為改變菌株抗生素抗性的突破點。

表5 蠟樣芽孢桿菌GW-01 及其與其他近緣芽孢桿菌抗生素抗性分析Table 5 Antibiotic resistance analysis of Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus

3 討論

食源性微生物的安全問題引起越來越多關注。Bc 是常見的食源性致病菌，廣泛存在于發酵食品、土壤、空氣、水、植物和畜禽瘤胃腸道[3,36-37]。食品尤其是高淀粉食品在生產、運輸、銷售和儲存等環節均會被該菌污染。作為食源性致病菌，Bc 引發食物中毒占全球食物中毒的1.4%～12%[38]；在中國，2003年至2017 年期間發生的13307 起食源性疾病中，由Bc 引起的占3.0%[39]。以Bc 為主體的微生態制劑如“口服蠟樣芽孢桿菌活菌片”、“蠟樣芽胞桿菌片”等益生菌產品在醫療保健、農業和養殖業等各行各業有著極其廣闊的應用[3,36-37]。目前，Bc 口服菌劑在市場上大量銷售，用于治療腸炎、腹瀉和腸功能紊亂，作為人類和牲畜益生菌使用[40]。然而，幾乎所有Bc 菌株都含有毒素編碼基因，約85%～100%含有Nhe，約40%～70%分別含有Hbl和cytK[34]，因此，很難解釋Bc 具有益生性的原因。

近年來，許多科學家致力于Bc 致病或益生性的研究。Bc 安全性分析主要集中于動物實驗和基因組分析。動物實驗方面，多采用小鼠[14,36]、刺參[41]、彭澤鯽[42]和銀鯽[43]等動物研究Bc 的益生特性。本課題組前期從健康雌性綿羊瘤胃中篩選到可降解β-CY 的蠟樣芽孢桿菌GW-01，從宿主來源看該菌株無致病性，并通過實驗表明口服Bc 菌株GW-01 能有效降低小鼠體內β-CY 的積累并促進小鼠體重增加[13]。為了深入研究該菌，本研究利用全基因組測序和生物信息學分析技術得到了菌株GW-01 的基因組序列，確定菌株基因組大小為5244145 bp，共編碼5314 個基因，同時將基因組數據與GO、COG、KEGG、NR 等數據庫進行比對分析，完成菌株GW-01 基因組功能注釋及數據統計工作，并基于gyrA基因構建系統發育進化樹，確定了GW-01 菌株與蠟樣芽孢桿菌CC-1、蠟樣芽孢桿菌M3、蠟樣芽孢桿菌G1-1、蠟樣芽孢桿菌M13 的近緣關系。

CAZy 家族主要參與糖苷鍵降解、修飾及生成的酶類，在宿主微生物的適應性和致病性方面發揮重要作用[44-45]。對于具有致病性的菌株，其體內糖苷水解酶可對宿主細胞的多糖進行水解，從而獲得自身所需營養或影響糖類在宿主中發揮作用[46-47]。細菌的CAZy 協同作用可將復雜的碳水化合物降解為簡單糖類，供給宿主動物吸收利用[48]。在菌株GW-01 基因組中共獲得CAZy 家族的編碼基因135 個，糖苷水解酶34 個、碳水化合物酯酶38 個、類糖苷轉移酶家族的蛋白43 個、輔助酶8 個、碳水化合物結合組件12 個，推測這些酶類家族與菌株GW-01 的益生性相關。

根據蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的癥狀可分為致嘔吐型腸毒素和致腹瀉型腸毒素，主要毒素包括ces、Hbl 和Nhe 以及CytK。ces 在淀粉和乳制品中檢出率較高，常用的食品加工方法很難使ces 失活，人體攝后宿主會出現惡心和嘔吐等癥狀。Nhe 和Hbl是引起腹瀉的重要毒素，具有高度的同源性，主要通過溶解結合部位的細胞膜形成孔洞，導致K+外流，進而直接刺激NLRP3 炎癥小體，導致宿主的死亡，該毒力因子主要受PlcR、CCPA、ResD和FNR等毒力調節因子的影響[49]。CytK 的毒性作用與Hbl 和Nhe相類似，具有細胞毒性和溶血活性，可使皮膚發生壞死。毒素因子需要不同基因之間相互調控如AbrB、Spo0A、PlcR和CodY調控系統對ces基因簇的轉錄進行調控[50]，CodY的功能是傳輸和調節ces基因簇所在質粒與細菌染色體間的信號，控制崗體進行營養和能量的代謝，進而影響毒素的合成[51-52]。

大量的研究顯示幾乎所有的Bc 都能分泌一種或多種毒素，益生性Bc 中毒素的存在情況仍不清楚。采用VFDB 數據庫對菌株GW-01 的毒力因子進行預測，菌株GW-01 大部分潛在的毒力因子僅編碼菌株正常生長所需的蛋白功能，還有一些可以增強細菌粘附和侵襲的能力，如Hsp60，可提高細菌對宿主細胞的粘附能力。相比于其他四株近緣菌株，在GW-01 中，只檢測到與致病性芽孢桿菌相關的毒素基因Nhe，且Nhe存在于約80%～100%的蠟樣芽孢桿菌中[34]。蠟樣芽孢桿菌毒性基因在表達上沉默或只有在特定情況下才能表達，Cui 等[53]認為蠟樣芽孢桿菌益生菌菌株的毒性基因在轉錄上是沉默，不會產生活性毒素，Tsilia 等[54]利用蠟狀芽孢桿菌NVH 0500/00 在胃腸道模擬過程中，發現其可以粘附黏蛋白，但不能產生腸毒素。plcR是芽孢桿菌細胞外毒力因子的多效性調節因子，同時調控HBL和Nhe的轉錄，plcR基因的轉錄發生在穩定期，而在孢子形成期可被孢子形成因子Spo0A抑制[9]。GW-01 菌株的Nhe基因由于菌株的調控系統影響其毒素基因的表達，推測菌株GW-01 較其他蠟樣芽孢桿菌安全性較高。

4 結論

本文采用第二代 Illumina 與第三代 PacBio 平臺相結合的測序技術，對菌株GW-01 進行全基因組測序，得到了基因組序列信息，并確定為蠟樣芽孢桿菌。通過COG、GO、KEGG 等數據庫完成了功能注釋與比對分析，了解了菌株GW-01 的生物學特性。通過與CAZy 數據庫的比對共獲得了CAZy 家族編碼基因135 個，其糖苷水解酶、糖苷轉移酶等的協同作用可能與菌株GW-01 的益生性相關。采用VFDB數據庫對菌株GW-01 的毒力因子進行預測，與其他Bc 相比，GW-01 潛在的毒力因子占比率最少，且大部分僅編碼菌株正常生長所需的蛋白，因此GW-01 雖具有毒力因子但其致病性有限，在開發成為益生菌方面具有很大的應用潛力。

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