PINK1/Parkin 介導的線粒體自噬在力學失衡誘導終板軟骨退變中的作用

鄭 權,吳明凡,邵 松,孫良業,許俊勝 （安徽醫科大學附屬六安醫院骨科，安徽 六安 237001）

椎間盤退變是引起頸腰痛及神經損害的重要因素，而椎間盤退變主要由異常應力、細胞衰老、炎性介質分泌以及營養供應障礙等引起。目前認為終板途徑是椎間盤營養供應的主要途徑，終板軟骨為透明軟骨，終板軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原（type Ⅱ collagen,COL-2A）、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）等細胞外基質對于椎間盤的營養供應以及形態維持都具有重要的作用[1]。有研究表明，終板軟骨的損傷可使相鄰椎間盤的壓力分布發生改變，髓核內營養供應減少，從而誘導椎間盤退變[2]。研究顯示，異常力學刺激是導致終板軟骨退變的主要因素，脊柱穩定性降低會導致椎間盤內應力異常，直接導致終板軟骨及椎間盤退變[3]。然而異常應力誘導終板軟骨退變的機制仍需進一步深入研究。

自噬是細胞降解和再利用功能異常蛋白質和其他大分子物質的過程，通過自噬降解及重復利用細胞內部結構，有助于細胞適應外界的刺激及存活。線粒體自噬作為一種選擇性自噬，能夠清除細胞內受損的線粒體，維持細胞內環境及功能穩定。目前認為線粒體自噬主要是由PINK1/Parkin 信號通路以及不依賴PINK1 的受體介導[4]。PINK1/Parkin 信號通路作為介導線粒體自噬重要且較為成熟的信號通路，具有維持軟骨細胞功能的作用[5]。有研究表明，在關節軟骨退變過程中，由PINK1/Parkin 信號通路介導的線粒體自噬水平明顯降低，過表達Parkin 基因能夠明顯提高軟骨細胞COL-2A、ACAN 等細胞外基質的水平，從而減輕關節軟骨退變[6]。終板軟骨與關節軟骨同屬透明軟骨，但線粒體自噬對于應力刺激誘導終板軟骨退變的影響及作用機制目前尚未見報道。本研究通過構建大鼠脊柱失穩模型，探討力學失衡條件下PINK1/Parkin信號通路介導線粒體自噬對于終板軟骨退變的影響，以期為椎間盤退變的相關機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠18只（10周齡），雌雄不限，體質量（180±20）g，上海西普爾一必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2022-0035。本研究獲安徽醫科大學附屬六安醫院實驗動物倫理委員會批準（20220407001）。

1.2 試劑和儀器

DMEM/F12（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Gibico 公司）；胰蛋白酶、COL-2A 酶（美國Sigma-Aldrich 公司）；TRIzol（美國Invitrogen 公司）；PCR 反應體系和反轉錄試劑盒（美國Fermentas 公司）；RT-PCR儀（德國Roche 公司，LightCycler 480）；NanoDrop 2000（美國Thermo&Scientific 公司）；Odyssey 紅外成像系統（英國Li-Cor 公司）；羰基氰化物3-氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）；兔抗鼠COL-2A抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，1：1 000）；兔抗鼠ACAN、Parkin 抗體（英國Abcam 公司，1：1 000），兔抗鼠PINK1、Tomm20、Timm23 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，1：1 000），山羊抗兔二抗（美國Bioworld Technology公司，1：5 000）。

1.3 大鼠脊柱失穩模型的構建及分組

取18只SD大鼠，分為正常組、退變組及CCCP組，每組6 只。正常組大鼠未做任何處理。退變組：大鼠以6.5%的水合氯醛0.055 mL/kg 腹腔注射麻醉后取俯臥位，固定四肢，腰背部剃毛備皮約4 cm×8 cm，消毒鋪單，沿腰背部棘突作后正中切口，切開皮膚后，沿骨膜下剝離。用咬骨鉗去除L2~L5的棘上韌帶、棘間韌帶以及兩側關節突，切斷棘突兩側的棘旁肌，逐層縫合皮下筋膜、皮膚。術后連續3 d，每只SD大鼠給予青霉素5 萬U 肌肉注射。CCCP 組：在退變組手術基礎上，參考Kim 等[7]的方法沿纖維環緊貼終板軟骨向椎間盤注射CCCP（10 μmol/L）5 μL。所有大鼠單籠飼養，連續飼養16周。

1.4 石蠟切片的制作及組織染色

包埋與切片：實驗結束后處死各組大鼠，獲取L2~L5椎間盤組織，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA 液中脫鈣1 個月，流水沖洗干凈，常規脫水、透明、浸蠟、包埋。將蠟塊置于切片機上切片，取5 μm 厚的切片，置于載玻片上，37 ℃烘片過夜，標記后進行組織染色。HE染色：切片脫蠟、脫水，蘇木精染色3 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗10 min，伊紅染色2～3 min，自來水沖洗，梯度脫水后中性樹膠封片后觀察。番紅-固綠染色：石蠟切片常規脫蠟，自來水沖洗30 s，固綠染色5 min；自來水沖洗1 min，番紅染色5 min。1%冰醋酸分色1 s，95%乙醇脫水2 次，每次1 min，100%乙醇脫水2 次，每次1 min，二甲苯透明2次，每次5 min，中性樹膠封固后觀察。

1.5 RNA提取及 RT-PCR

取各組大鼠的椎間盤組織，在4 倍解剖顯微鏡下用尖刀切開，刮除髓核及纖維環，獲取終板軟骨放入研缽中，研磨至粉末狀。常規TRIzol 法提取終板軟骨組織的RNA，NanoDrop 2000 檢測RNA 的濃度與純度；取1 μg 總RNA，采用一步法20 μL 體系[DEPC 水12.5 μL，Oligo dT（100 mol/L）1 μL，5×反轉錄緩沖液4 μL，200 U反轉錄酶0.5 μL，dNTP（濃度為10 mmol/L）2 μL]反轉錄合成cDNA，將cDNA 稀釋5 倍，按20 μL體系在設定的程序下進行PCR 擴增，相關引物見表1。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸25 s，擴增50 個循環。以GAPDH 為內參，滅菌超純水作為陰性對照，每個模板設置3個復孔，結果使用相對定量2-△△Ct法分析。

表1 RT-PCR 引物序列

1.6 蛋白提取及Western blot

分離獲取終板軟骨組織，盡量剪碎研磨至粉末狀，采用RIPA 蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑PMSF提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取20 μg 蛋白樣品，十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗后4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗室溫孵育1 h，Odyssey 機器成像。采用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，目標蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值為蛋白相對表達水平。

1.7 統計學處理

實驗數據采用SPSS 22.0 軟件進行分析，結果以均數±標準差（）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。α=0.05 為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 力學失衡對大鼠椎間盤組織形態的影響

HE 染色顯示，退變組大鼠脊柱失穩誘導的椎間盤組織破壞明顯，終板軟骨及纖維環結構也明顯受損；而CCCP 組大鼠椎間盤與退變組比較，髓核較為完整，終板軟骨及纖維環結構受損較輕，見圖1。

圖1 各組大鼠椎間盤組織HE染色

番紅-固綠染色結果顯示，退變組大鼠脊柱失穩誘導的髓核及終板軟骨細胞外基質分泌均較正常組明顯減少，CCCP 組大鼠中終板軟骨細胞外基質分泌較退變組明顯增多，見圖2。

圖2 各組大鼠椎間盤組織番紅-固綠染色

2.2 力學失衡誘導大鼠終板軟骨退變

RT-PCR 結果顯示，與正常組比較，退變組大鼠脊柱失穩誘導的終板軟骨組織中ACAN、COL-2A mRNA的表達明顯下調（P<0.05）；而CCCP 組大鼠終板軟骨組織中ACAN、COL-2A mRNA 的表達明顯增高(P<0.05），見圖3a。Western blot 結果顯示，退變組大鼠終板軟骨中ACAN、COL-2A 蛋白水平較正常組明顯降低（P<0.05），而CCCP 組大鼠終板軟骨中ACAN、COL-2A 蛋白水平較退變組明顯增高（P<0.05），見圖3b、c。

圖3 各組終板軟骨組織中ACAN和COL-2A mRNA及蛋白表達

2.3 PINK1/Parkin 信號通路介導的線粒體自噬在終板軟骨組織中的表達

RT-PCR 結果顯示，與正常組比較，退變組大鼠終板軟骨PINK1、Parkin mRNA 表達明顯降低（P<0.05）；CCCP 組大鼠終板軟骨組織PINK1、Parkin mRNA 表達較退變組明顯增高（P<0.05），見圖4a。此外，Western blot 結果顯示，退變組大鼠終板軟骨PINK1 及Parkin蛋白水平較正常組均明顯降低（P<0.05），而線粒體蛋白Tomm20 及Timm23 水平較正常組增高（P<0.05）；CCCP 組大鼠終板軟骨中PINK1 及Parkin 蛋白水平較退變組明顯增高（P<0.05），線粒體蛋白Tomm20 及Timm23水平較退變組明顯降低（P<0.05），見圖4b、c。

圖4 各組終板軟骨組織中線粒體自噬相關mRNA及蛋白表達量

3 討論

椎間盤作為人體最大的無血管組織，其營養供應主要依賴椎體兩端終板軟骨以及外層纖維環的滲透作用。終板軟骨是連接椎體與椎間盤的薄層透明軟骨，其特殊結構能夠維持椎間盤的形態及功能的穩定。一方面，終板軟骨分泌的COL-2A、ACAN 等細胞外基質有利于營養物質向椎間盤的運輸[8]；另一方面，終板軟骨對于椎體與椎間盤之間的力學傳遞具有重要的緩沖作用[8]。研究顯示，終板退變是椎間盤退變的始動因素，維持終板軟骨的正常功能對于椎間盤退變的防治起著決定性作用[9]。在肌肉及周圍韌帶的保護下，椎間盤通常處于靜態平衡或者動態平衡，而一旦這種平衡被打破，脊柱穩定性喪失，就會導致椎間關節退變，椎間盤異常應力，進而引起椎間盤退變[10]。本研究通過破壞大鼠脊柱后方結構，構建脊柱失穩模型，結果顯示，脊柱失穩能夠明顯誘導椎間盤退變，終板軟骨細胞外基質的主要成分COL-2A 以及ACAN 的合成減少；因此，我們認為脊柱失穩引起的力學失衡導致終板軟骨退變，終板營養途徑障礙誘導椎間盤退變，改善終板軟骨的功能可延緩椎間盤退變。

線粒體是真核動物細胞進行生物氧化和能量轉換的主要場所，線粒體功能障礙與軟骨細胞退變密切相關。線粒體受損以及功能障礙導致細胞內活性氧及氧化應激水平增高，進而影響軟骨細胞合成及分解代謝，最終導致軟骨細胞退變[11]。因此，適時清除老化和損傷的線粒體對于軟骨細胞功能維持具有重要的作用。線粒體自噬能夠選擇性地清除細胞內受損或功能障礙的線粒體，降低細胞內活性氧水平，從而維持軟骨細胞的內環境及功能穩定[12]。有研究表明，PINK1/Parkin 信號通路介導的線粒體自噬水平降低能夠抑制關節軟骨合成代謝，從而促進關節軟骨退變[13]。然而，在力學失衡誘導的終板軟骨退變過程中線粒體自噬水平的變化及作用機制目前仍不清楚。本研究結果顯示，脊柱失穩模型中終板軟骨細胞中PINK1/Parkin 信號通路被抑制，線粒體膜蛋白Tomm20 和Timm23水平增高，說明線粒體自噬水平降低導致線粒體蛋白降解減少；在脊柱失穩模型中給予線粒體自噬激動劑CCCP 激活線粒體自噬后，終板軟骨中COL-2A及ACAN 表達升高，終板軟骨及椎間盤的退變均明顯減輕。由此可見，脊柱失穩導致的異常應力能夠通過抑制線粒體自噬影響終板軟骨細胞合成及分解代謝，進而誘導終板軟骨退變，但異常應力刺激調控PINK1/Parkin 信號通路介導線粒體自噬的具體機制仍待進一步研究。