慢性鎘暴露小鼠的肝脂質組學研究

郝蓉蓉,李 玲,田 麗,謝 佳,陳夢妍,余爭平,皮會豐 （陸軍軍醫大學軍事預防醫學系軍隊勞動衛生學教研室/教育部電磁輻射醫學防護重點實驗室，重慶 400038）

鎘屬于有毒重金屬，其化合物被廣泛用于電池、染料、電鍍、化妝品、香煙等，在日常生活中十分常見。含鎘廢物若處理不當會導致鎘污染。富含鎘的飲食和飲水是人鎘暴露的主要途徑[1]。鎘在人體主要蓄積于肝和腎[2]，并對其造成損傷。目前，因脂質代謝異常引發的疾病是最常見的慢病。研究表明，脂質代謝參與了高脂血癥、肥胖、2 型糖尿病、動脈粥樣硬化和皮膚病變的發生及發展[3]。流行病學研究表明，鎘接觸與中年人非酒精性脂肪性肝病的患病有關[4]。既往有研究通過氯化鎘灌胃成功構建了鎘暴露小鼠非酒精性脂肪性肝病模型[5]。還有研究顯示，鎘暴露會加重原有的非酒精性脂肪性肝病[6]。但目前對于鎘暴露誘導肝脂質譜的變化仍然缺乏系統研究。

脂質組學是一種基于高通量分析技術，系統性解析生物體脂質組成與表達變化的研究模式，其可高效研究脂類家族和脂質分子在各種生物過程中的改變與功能，進而闡明相關的生物活動過程與機制[7]。目前，脂質組學分析一般采用液相色譜-質譜聯用技術（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），主要分為非靶向分析和靶向分析兩類。本研究采用基于UPLC-Orbitrap 質譜系統的非靶向脂質組學分析平臺[8]，并結合LipidSearch（Thermo Scientific?）軟件進行脂質鑒定與數據預處理，采用相對定量對組間的差異進行分析，并通過KEGG 富集篩選出差異脂質分子參與的代謝通路，為進一步了解慢性鎘暴露誘導非酒精性脂肪性肝病的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要試劑

本次實驗所用均為SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠（8 周齡），由陸軍軍醫大學實驗動物中心［動物生產許可證號：SCXK(渝)20170002，使用許可證號：SYXK(渝)20170002］提供。本研究實驗設計、實驗過程及動物處死方法均經陸軍軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會審核通過（AMUWEWC2020059）。氯化鎘購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 構建慢性鎘暴露小鼠模型和樣本收集

雄性C57BL/6J小鼠12只，在SPF級環境中適應性飼養1 周后，將小鼠隨機分為對照組（正常水喂養）和實驗組[鎘水（0.6 mg/L CdCl2）喂養]，每組6 只。小鼠自由飲水及進食6 個月后處死，即刻采集肝組織后存放于-80 ℃冰箱中，干冰運送至上海中科新生命有限公司進行LC-MS/MS分析，測定肝脂質組學。

1.3 樣本預處理方法

取適量小鼠肝組織樣本，剪碎后加入200 μL 水渦旋，加入800 μL 甲基叔丁基醚渦旋混合，加入240 μL預冷甲醇渦旋混合，低溫水浴中超聲20 min，室溫放置30 min，14 000 g 10 ℃離心15 min，取上層有機相，氮氣吹干；質譜分析時加入200 μL 90%異丙醇/乙腈溶液復溶，充分渦旋，取90 μL 復溶液，14 000 g 10 ℃離心15 min，取上清進樣分析。

1.4 LC-MS/MS

色譜分析：樣品采用UHPLC Nexera LC-30A 超高效液相色譜系統進行分離。C18色譜柱；柱溫45 ℃；流速300 μL/min。流動相A 為乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4，v/v），流動相B 為乙腈異丙醇溶液（乙腈∶異丙醇=1∶9，v/v）。

質譜分析：采用電噴霧電離（正離子和負離子模式）進行檢測，樣品經UHPLC分離后采用Q Exactive系列質譜儀（Thermo Scientific?）進行質譜分析。按照下列方法確定脂質分子和脂質碎片的質荷比：每次全掃描后采集10 個碎片圖譜（MS2 scan，HCD）。MS1在質荷比為200 時分辨率為70 000，MS2在質荷比為200 時分辨率為17 500。

1.5 脂質組學KEGG分析

通過脂質組學篩選的差異脂質進行KEGG通路富集分析。

1.6 油紅O染色

取對照組和實驗組小鼠肝冰凍切片，然后用4%多聚甲醛固定，放入新配過濾的油紅O 工作液,浸染8~10 min（加蓋避光）后進行背景分化，取出切片停留3 s后浸入60%異丙醇10 min，隨后進行細胞核蘇木素染色3~5 min，最后返藍液返藍1 s,自來水中浸洗。

1.7 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，計量數據以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，每個實驗至少重復3 次。P<0.05 為差異有統計學意義，P<0.01 為差異具有極顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 肝組織油紅O染色

取小鼠部分肝組織進行油紅O染色，結果顯示，對照組和實驗組小鼠肝細胞內未見明顯脂滴沉積或增多，見圖1。

圖1 油紅O染色

2.2 模型質量驗證

本實驗通過脂質組學探究鎘暴露小鼠脂代謝相關的脂質分子的變化，反映鎘暴露對小鼠脂代謝水平的影響。對鑒定到的脂質分子進行主成分分析(principal component analysis,PCA)，對照組和實驗組在PCA 得分圖上均有不同的聚類趨勢（圖2a），說明2 組小鼠的肝組織中脂質成分存在顯著差異。正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）得分圖顯示，實驗組樣本均遠離對照組樣本，提示鎘暴露可明顯改變小鼠體內內源性脂質水平（圖2b）。同時，為避免OPLS-DA中發生過擬合，采用置換檢驗對模型進行檢驗，以保證模型的有效性。經7次循環交互驗證得到的置換檢驗顯示，OPLS-DA 模型評價質量較好(R2y=0.989；Q2=0.921；R2X=0.592)，見圖2c?；鹕綀D顯示，調整后的P值與鎘暴露后相關的脂質含量變化倍數(fold change,FC)之間的關系（FC>1.5、P<0.05）為FC越大，差異越顯著（圖2d）。以上檢驗均提示對照組和實驗組樣本之間存在顯著差異，表明鎘暴露導致肝脂質代謝發生了顯著改變。

圖2 模型質量驗證

2.3 脂質組學結果分析

本研究基于OPLS-DA 模型篩選出與鎘暴露密切相關的差異代謝物，正、負離子模式下鑒定到的樣本中脂質亞類共43種，包含各類中鑒定到的脂質分子共2 709個（圖3a）。脂質組成分析發現，實驗組中排名前10 的脂質亞類為磷脂酰膽堿（PC）37.572%、三酰甘油（TG）32.22%、磷脂酰乙胺醇（PE）8.916%、二酰甘油（DG）5.747%、磷脂酶C（LPC）4.318%、磷脂（SM）2.051%、鞘神經酰胺（Cer）1.513%、磷脂酰肌醇（PI）1.242%、鞘氨醇（SPH）1.212% 和甾醇酯類（ST）0.942%（圖3b）。對照組排名前10 的脂質亞類為三酰甘油（TG）48.316%、磷脂酰膽堿（PC）27.832%、二酰甘油（DG）6.149%、磷脂酰乙胺醇（PE）6.138%、磷脂酶C(LPC)3.864%、鞘磷脂（SM）1.646%、神經酰胺（Cer）0.926%、磷脂酰肌醇（PI）0.85%、鞘氨醇（SPH）0.811%、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）0.704%(圖3c)。與對照組相比，實驗組磷脂酰乙胺醇（PE）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酶C（LPC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘氨醇（SPH）、甾醇酯類（ST）、神經酰胺（Cer）占比增加，二酰甘油（DG）、三酰甘油（TG）占比減少，提示在慢性鎘暴露下肝組織含甘油占比下降。

圖3 脂質亞類組成

2.4 顯著性差異脂質分子的鑒定

以VIP>1 和P<0.05 為篩選標準，篩選到144 個具有顯著性差異的脂質分子，涉及17 種脂質亞類：三酰甘油（TG）、二酰甘油（DG）、甘油一酯（MG）、甘油磷脂（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙胺醇（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）、鞘磷脂（phSM）、鞘氨醇（SPH）、甾醇酯類（ST）、心磷脂（CL）、神經酰胺（Cer）、輔酶（Co）、己糖神經酰胺（Hex1Cer）、磷脂酶C（LPC），見圖4a。實驗組中共有68 種差異脂質分子上調，76種差異脂質分子下調（圖4b）。將差異脂質分子通過KEGG 富集得到6 種通路：甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成、甘油脂代謝、花生四烯酸代謝（圖4c）。

圖4 顯著差異分子表達

2.5 顯著性差異脂質分子的鏈長度分析

對篩選出來的43 種脂質亞類進行分子層面的分析發現，在碳原子數目總和（C）>21的長鏈脂肪酸中含有顯著性差異的脂質亞類16 種（圖5a、b），12

圖5 不同碳鏈長度脂質分子分析

3 討論

鎘作為有毒重金屬，進入人體后在體內蓄積，半衰期為10～30年[9]。肝是脂質代謝最主要的場所。本課題組前期研究顯示，與對照組相比，慢性鎘暴露組小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶含量顯著增加，HE 染色提示肝組織內炎癥細胞浸潤，出現局灶性壞死，肝細胞發生氣球樣變[10]。本研究采用鎘水（0.6 mg /L CdCl2）喂養6個月的方式，深入了解慢性鎘暴露對肝脂質代謝的影響[11]。既往研究報道，小鼠在飲用鎘水（0.6 mg/L CdCl2）13周后測得血鎘濃度為0.3～0.4 μg/L[12]，與美國一般非吸煙者人群血鎘濃度相當[13]。我國成年男性的血鎘濃度為0.38～2.88 μg/L,成年女性的血鎘濃度為0.31～0.92 μg/L[14]。研究表明，鎘污染環境地表水和地下水中鎘濃度為0.025~6.26 mg/L[15]。因此，本研究中使用的鎘濃度相對較低，與環境相關，能夠模擬建立長期鎘暴露環境。既往研究通過給C57BL/6J 小鼠自由飲用鎘水（10 mg/L）20 周，行脂質油紅O 染色發現，實驗組小鼠有大量脂滴沉積于肝組織，且出現非酒精性脂肪性肝病的改變[5]。本研究通過對小鼠進行鎘水喂養24周后對肝組織進行脂質油紅O 染色發現，與對照組相比，實驗組小鼠未見脂滴形成。由于本研究所采用的鎘濃度（0.6 mg/L CdCl2）遠低于10 mg/L,因此考慮劑量差異導致肝組織油紅O 染色未見脂滴形成，但不否定肝代謝發生異常變化。我們進一步對肝組織行脂質組學分析，發現了144種具有顯著差異的脂質分子；進行通路富集發現，這些差異脂質分子主要參與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇生物合成、甘油酯代謝、花生四烯酸代謝。

三酰甘油是一種化合物，由甘油的3 個羥基與3 個脂肪酸分子酯化生成的甘油酯，其增高可使血液黏稠度增加，加速動脈粥樣硬化，從而引發心血管疾病[16-18]。脂肪在肝細胞內大量積聚可導致非酒精性脂肪性肝病的產生[19]。本研究發現，三酰甘油(11:0_10:1_16:0)和三酰甘油(16:0_16:1_18:2)在實驗組中顯著增高，可能成為前期非酒精性脂肪性肝病的潛在生物分子指標。二酰甘油具有多種營養功能，能夠預防肥胖、高血糖、心血管疾病，抑制胰島素抵抗，減輕非酒精性脂肪性肝病的癥狀[20-21]。本研究發現，實驗組的二酰甘油明顯降低，這一改變可能對非酒精性脂肪性肝病的形成提供了條件。磷脂是生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類。甘油磷脂主要包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇，磷脂酰膽堿分布最廣，也是二酰甘油、溶血磷脂酰膽堿和花生四烯酸等脂質信使的前體。有研究表明，磷脂酰乙醇胺n-甲基轉移酶敲除(Pemt（-/-）)小鼠的磷脂酰膽堿(PC)/磷脂酰乙醇胺(PE)下降會導致細胞膜完整性喪失，引發肝損傷，并發展為非酒精性脂肪性肝病[22]。通過給Pemt(-/-)小鼠喂養缺乏膽堿飲食會發生快速非酒精性脂肪性肝病，導致肝功能衰竭[23]。本研究結果顯示，實驗組和對照組中磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)占比均發生改變(實驗組中PC/PE 約為4.21，對照組中PC/PE 約為4.46)。根據本次結果，我們認為慢性鎘暴露有可能會使PC/PE 降低，進而改變肝細胞膜的完整性，誘發肝損傷，造成非酒精性脂肪性肝病。神經酰胺是由長鏈脂肪酸與鞘氨醇的氨基經脫水而形成的一類酰胺化合物[24]，其可以破壞胰島素敏感性、胰腺β細胞功能、血管反應性和線粒體代謝，在大鼠和小鼠中抑制神經酰胺生物合成，誘導神經酰胺降解可以改善許多代謝疾病，包括糖尿病、心肌病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病[25-27]。小鼠體內實驗發現，去除二氫神經酰胺去飽和酶或增加酸性神經酰胺酶活性來降低肝的神經酰胺水平時，肝脂肪變性減少[28]。臨床數據顯示，非酒精性脂肪性肝病患者神經酰胺水平顯著增加[29]。本研究發現，實驗組中神經酰胺水平明顯升高，但未發現明顯脂滴沉積，表明機體存在自我保護機制，有助于抑制因神經酰胺水平升高而引起的非酒精性脂肪性肝病，使機體處于代償期。同時，差異脂質分子參與甘油酯、亞油酸和花生四烯酸的代謝，這3 種代謝通路均與非酒精性脂肪性肝病的形成有關[30-33]。

綜上所述，本研究通過建立慢性鎘暴露雄性小鼠模型分析發現，慢性鎘暴露可引起肝脂質代謝紊亂，由于機體的自我保護能力和疾病發展的病理生理過程，可能鎘暴露的時間進一步延長，其造成的肝脂質紊亂會發展為非酒精性脂肪性肝病。但本研究僅采用雄性小鼠，不能完全代表慢性鎘暴露后小鼠的肝脂質代謝的變化情況。后期我們將優化實驗設計，通過構建雌雄各半的實驗模型，進一步研究慢性鎘暴露誘導肝的脂質改變及其具體機制。