IL2rg-／-大鼠支持人RSV 在體內的長期感染

熊芮吳勇楊艷偉屈哲劉甦蘇王譽雅馬麗穎付瑞彭宜紅梁春南?范昌發?

（1. 中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所（國家嚙齒類實驗動物資源庫），北京 102629；2. 北京大學醫學部基礎醫學院病原生物學系，北京 100083；3. 中國食品藥品檢定研究院安全評價研究所（國家藥物安全評價監測中心），北京 100176）

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus， hRSV ） 為具有包膜的肺病毒科（Pneumoviridae）、正肺病毒屬（Orthopneumovirus）的單股負鏈病毒[1]。 其感染呈全球性分布，并有季節性流行的特點[2-3]。 hRSV 的主要感染對象為2 歲以下的嬰幼兒，臨床上多表現為較輕的上呼吸道癥狀，如鼻塞、咳嗽等[4]。 hRSV 感染導致的重癥多見于1 ～6 月齡的嬰兒，通常發展為細支氣管肺炎，出現低燒、喘息、胸壁回縮和呼吸急促等[5-6]。

人可能會反復感染hRSV，目前有兩種hRSV疫苗獲批被用于60 歲以上老年人接種免疫。hRSV 疫苗和治療性藥物在臨床試驗階段或臨床前研究中取得有限的進展，這在一定程度上是由于缺乏能夠完全模擬人類臨床感染特征、且持續感染的動物模型。 現有的hRSV 動物模型，包括常見的hRSV 非人靈長類及嚙齒類動物感染模型，各有優勢，但局限性也很突出。 除黑猩猩外，如最常用的棉鼠和BALB／c 小鼠，為hRSV 的半受納宿主，僅部分個體易感。 為了建立hRSV 模型，通常采用大劑量病毒攻毒。 即便如此，hRSV 在很多動物模型的呼吸道靶器官內復制維持時間普遍較短[7]，且組織病理改變輕微[8-10]，與臨床表現存在較大差異。

有研究發現采用hRSV 感染免疫功能受到抑制的棉鼠（環磷酰胺處理），其癥狀與普通棉鼠有明顯不同[11-12]。 最為明顯的變化是hRSV 清除時間延遲，免疫抑制的棉鼠在hRSV 感染6 周后依舊能在其肺部檢測到高滴度病毒，并且肺部病理出現更嚴重的炎癥反應。 這提示在免疫缺陷情況下，可能有利于建立癥狀更加典型的hRSV 感染模型。 白介素2 受體γ 鏈（interleukin 2 receptor subunit gamma chain，IL2rg）是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和IL-21的共同受體亞基，IL2rg基因的缺陷會導致大鼠機體免疫功能嚴重降低，尤其缺乏成熟的NK 細胞[13]。為了制作免疫缺陷效果顯著的動物模型，本研究選擇敲除IL2rg基因，使大鼠缺乏功能性NK 細胞，構建穩定的免疫缺陷環境，以支持hRSV 在體內持續、高水平復制，以建立更加穩定的感染模型，支持hRSV 治療性藥物體內有效性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級Wild-type SD 大鼠（WT）由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所【SCXK（京）2022-0002】提供，純合型SPF 級SD-IL2rgemx／NIFDC大鼠（縮寫為IL2rg-／-）為實驗動物資源研究所模式動物研究室自主構建。 WT 和IL2rg-／-大鼠均為3 周齡各17 只，雌雄各半，體重約為60 ～75 g，動物繁殖及實驗均在中國食品藥品檢定研究院屏障設施【SYXK（京）2022-0014】內進行，溫度24 ～26 ℃，相對濕度40% ～70%，12 h 明／12 h 暗，飼喂60Co 滅菌SPF 級飼料，自由飲滅菌自來水。 動物實驗方案經本院實驗動物福利倫理審查委員會審查批準（IACUC2021-B-004），RSV 感染實驗在ABSL-2 動物實驗室進行。

1.1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（15 mg／mL，75 mg／kg），RNAlaterTMStabilization Solution （Invitrogen）， PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa），TB Green（TaKaRa）， RBC Lysis Buffer （ BioLegend）， Cell Staining Buffer （ BioLegend）， Rat T／B／NK Cell Cocktail 抗體（BD），Bio-Plex Pro Rat Cytokine 24-plex Assay（Bio-rad）。

BD LSRII 流式細胞儀， Roche 羅氏LightCycler480。

1.2 方法

1.2.1 IL2rg-／-大鼠模型的構建和hRSV 感染模型的構建

使用TALEN GoldenGate 系統針對大鼠IL2rg基因外顯子2 設計TALEN。 將對IL2rg 特異的TALEN質粒轉染到大鼠C6 細胞（ATCC，CCL107）中。 用蛋白質印跡分析（Western Blot）確認TALEN 表達，并用MSDase 測定及檢查TALEN 的活性。 在體外轉錄IL2rg-TALEN mRNA 并通過顯微注射將其注射到SD 大鼠的受精卵中，然后將受精卵轉移至假孕SD雌性大鼠。

WT 和IL2rg-／-大鼠的hRSV 攻毒組和DMEM組在滴鼻（Intranasal，I.N.）之前用戊巴比妥鈉溶液淺度麻醉。 將胰島素注射器針頭磨平，吸取40 μL hRSV 病毒（1 × 106TCID50）懸液或DMEM 培養液，緩慢滴進大鼠的鼻孔內。

1.2.2 DNA 提取和基因檢測

苯酚氯仿法提取鼠尾DNA，剪取鼠尾（長度＜0.5 cm）置于1.5 mL Ep 管中，每管加250 μL 裂解液（含蛋白酶K 5 μL，TaKaRa）。 將樣品放置55 ℃水浴鍋過夜，加入250 μL TRIS-酚與氯仿的混合物（125 μL TRIS-酚＋122.5 μL 氯仿＋2.5 μL 異戊醇），充分顛倒混勻，12 000 r／min 離心5 min。 吸取200 μL 上清液至另一新Ep 管中，加入700 μL 冰冷的異丙醇，待有DNA 析出，12 000 r／min 離心10 min，棄上清。 加入冰冷的70% 乙醇（- 20 ℃）1000 μL 漂洗1 次，12 000 r／min 離心10 min，棄上清。 用TE（pH ＝8.0）溶液在55 ℃溶解沉淀2 h，測定濃度并稀釋后用做PCR 模板。 用PCR 法檢測IL2rg基因敲除大鼠F0 代基因，大鼠IL2rg 引物為IL2rg-F（5’-GCTCCAAGGTCCTCATGTCCAG-3’）和IL2rg-R（5’-ATCTTCGCCTTTCTGCCCATGAC-3’），電泳后測序。

1.2.3 細胞與病毒培養

將HEp-2 細胞接種于10% FBS 及1%雙抗的DMEM 培養基，置于37 ℃，5% CO2培養備用。 當細胞達到90%滿瓶時，吸去細胞培養基，用PBS 緩沖液沖洗一遍，加入2 mL 含2% FBS DMEM 培養基稀釋的hRSV 病毒，置于37 ℃培養箱中感染2 h 后棄去上清，用PBS 緩沖液沖洗1 遍，再加入10 mL 2% FBS DMEM 培養基培養2 ～3 d，當在顯微鏡下觀察到病變細胞比例達到80% ～90%時，將培養瓶先后置于-80 ℃冰箱和37 ℃培養箱中交替凍融裂解細胞，取上清病毒液，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 臨床癥狀觀察與體重

當大鼠接種hRSV 或DMEM 培養液后，連續6 d在同一時間段測量體重，后每隔2 d 測量1 次至21 dpi（days post infection）；連續8 d 在同一時間段測量大鼠肛溫，后每隔1 d 測量1 次至18 dpi，同時觀察有無呼吸道癥狀、弓背表現、及精神狀態異常等臨床癥狀。

1.2.5 病毒載量檢測

用戊巴比妥鈉溶液麻醉后處死實驗動物，取鼻腔，氣管和肺組織放入1.5 mL 無菌離心管，加1 mL RNAlater 保存液，4 ℃過夜后棄去RNAlater 保存液并將組織放入-80 ℃冰箱長期保存。 用TRIzol法提取組織RNA，用DEPC 水溶解RNA 后-80 ℃保存。 將hRSV 的RNA 逆轉錄為cDNA 后，采用絕對熒光定量PCR 檢測組織hRSV 病毒載量。 目的基因使用引物hRSV-F（5’-AACGCACCGCTAAGAC AC-3’），hRSV-R（5’-GCCATCATATTCATAGCCT CGG-3’）。

1.2.6 流式法測定免疫細胞含量

用毛細玻璃管從眼內眥取血200 μL，EDTA 抗凝。 用抗體標記細胞，混勻后室溫避光孵育20 min。裂解紅細胞后，Cell Staining Buffer 混勻后避光低溫放置4 h 內上機檢測分析，在BD LSRII 流式細胞儀上采用FACS Diva 6.0 Software 軟件獲取細胞數據。

1.2.7 細胞因子檢測

用毛細玻璃管經眼內眥取血200 μL，室溫放置2 h，7000 r／min，離心20 min，吸取血清后放于-20 ℃冰箱保存。 細胞因子用MSD（Meso Scale Discovery）法檢測。 將微珠加入樣品孔中孵育，結束時加入細胞因子檢測抗體繼續孵育，后用試劑盒中的Streptavidin-PE 熒光色素顯色，使用Bio-Plex 200系統讀板，得最終檢測結果，單位為pg／mL。

1.2.8 組織病理觀察

取鼻和肺組織，用10%中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋切片，厚度0.3 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 獲得NK 細胞缺失的純合IL2rg-／-敲除大鼠

IL2rg基因位于X 染色體上，全長3.7 kb，本模型設計的敲除位點位于2 號外顯子（圖1A）。 設計PCR 引物擴增IL2rg-／-大鼠目標基因切割位點附近序列，從WT 大鼠中擴增獲得長度為929 bp，IL2rg-／-大鼠的PCR 片段長度為927 bp（圖1B），測序獲得敲除序列為5’-TT-3’。 另外，用流式細胞術檢測純合型IL2rg-／-大鼠外周血中的T、B 及NK 細胞表達含量（圖1C，1D）。 結果發現，與WT 大鼠相比，IL2rg-／-大鼠的T 細胞、B 細胞、NK 細胞、及NKT細胞含量均顯著性降低（P＜0.01）。 以上結果表明，IL2rg基因敲除成功，IL2rg-／-大鼠表型符合預期，可以用于后續實驗。

圖1 構建敲除IL2rg 基因的IL2rg-／-大鼠（n ＝4）Note. A. Site of IL2rg gene knockout in rats. B. Genotype identification of IL2rg-／- rats by PCR. C. Flow cytometry test analysis of T，B，NK and NKT cells in the peripheral blood of WT rats and IL2rg-／- rats. D. Flow cytometry test analysis of T， B， NK and NKT cells in the peripheral blood of IL2rg-／- rats. Compared with WT rats， ＃＃P ＜0.01， ＃＃＃P ＜0.001.Figure 1 Construction of IL2rg-／- rats with IL2rg gene knockout（n ＝4）

2.2 建立IL2rg-／-大鼠hRSV 感染模型

將大鼠麻醉后經滴鼻途徑感染hRSV，觀察其臨床特征和病理改變，并檢測部分臟器中的病毒載量，血清細胞因子等參數，用以建立hRSV 的IL2rg-／-大鼠感染模型。 在35 d 觀察期間內，未發現IL2rg-／-大鼠的明顯臨床癥狀。 其體重與WT 大鼠無顯著性差異（P＞0.05）（圖2A），也未出現體溫升高（圖2B）。

圖2 構建IL2rg-／-大鼠的hRSV 感染模型Note. A. Body weight of IL2rg-／- rats and WT rats. B. Rectal temperature of IL2rg-／- rats with hRSV（n ＝5）. C. Total hRSV copies in the target organs of IL2rg-／-（n ＝12） according to RT-qPCR. D. Respiratory histopathology of IL2rg-／- rats and WT rats，degeneration and necrosis of transitional epithelium and inflammatory cell infiltration（red arrows）observed in the nasal cavity of WT rats after hRSV infection.Compared with IL2rg-／- rats with DMEM group（n ＝ 5）， ＄P ＜0.05. Compared with WT rats（n ＝ 12）， ???P ＜0.001， ????P＜0.0001.Figure 2 Construction of an hRSV infection model using IL2rg-／- rats

用RT-qPCR 法檢測大鼠呼吸道各組織的病毒載量（圖2C）。 hRSV 感染IL2rg-／-大鼠后，鼻組織中的病毒載量在11 dpi 達到峰值1 × 1010copies／g 組織；在35 dpi 時，病毒載量仍維持1 × 107copies／g。而在IL2rg-／-大鼠氣管和肺組織中，病毒載量隨hRSV 感染時間延長呈下降趨勢，高拷貝數的病毒載量維持時間短，但在氣管組織中，病毒復制維持到11 dpi 左右，肺組織中，維持在20 dpi 以上。 WT大鼠呼吸道各組織的病毒載量下降迅速，在感染中期均被清除。

hRSV 感染的IL2rg-／-大鼠其鼻、氣管和肺組織未見炎癥細胞浸潤， 組織結構完整， 攻毒組和DMEM 對照組情況一致， 無明顯病變（圖2D）。 WT大鼠鼻組織中，偶見極輕度病理改變，在11 dpi 和20 dpi 時，WT 大鼠鼻組織移行上皮細胞和呼吸上皮細胞出現變性壞死，并伴炎性細胞浸潤。

2.3 hRSV 感染IL2rg-／-大鼠引起的免疫反應

用流式細胞術分析IL2rg-／-大鼠感染hRSV 過程中免疫細胞群的變化，結果如圖3 所示。 IL2rg-／-大鼠感染hRSV 感染后，外周血T 細胞含量基本維持不變（P＞0.05），而4 dpi 的B 細胞含量有上升，達到19.84%，隨后下降。 NK 細胞和NKT 維持在極低水平，且含量較穩定。 而WT 大鼠感染hRSV 后，可見B 細胞含量有上升趨勢，但無統計學意義（P＞0.05），而在IL2rg-／-大鼠的B 細胞含量明顯上升，在4 dpi，其含量增長了近3 倍，在20 dpi 下降到感染前水平。 NK 細胞含量在hRSV 感染后有輕微波動，但無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 hRSV 感染后IL2rg-／-大鼠的免疫細胞改變（n ＝12）Note. A. The contents of T， B， NK and NKT cells in IL2rg-／- peripheral blood on various time points following hRSV infection. B. The abundance of B cells in a representative IL2rg-／- rat at 3 time points after infection. Compared with WT rats， ?P ＜0.05， ??P ＜0.01，???P ＜0.001， ????P ＜0.0001.Figure 3 Abundance of immune cells in IL2rg-／- rats during hRSV infection（n ＝12）

感染hRSV 病毒后，IL2rg-／-大鼠血清24 種細胞因子中（圖4A），絕大多數WT 大鼠無顯著性差異，唯有IL-6 與MCP-1 的含量在病毒感染前后有明顯不同（圖4B）。

圖4 hRSV 感染后IL2rg-／-大鼠的炎癥反應Note. A. Heat map of peripheral blood cytokine concentration of IL2rg-／- and WT rats after infection. B. The expression of IL-6，MCP-1 in peripheral blood of IL2rg-／- rats and WT rats after hRSV infection. Compared with each other at different time points within the groups， ?P＜0.05，???P ＜0.001，????P ＜0.0001.Figure 4 Inflammatory response in IL2rg-／- rats during hRSV infection

WT 大鼠在感染后的0 dpi、4 dpi 和20 dpi 這3個時間點的IL-6 含量均無顯著性差異，IL2rg-／-大鼠的IL-6 含量在4 dpi 明顯高于0 dpi 與20 dpi 時的水平。 IL2rg-／-大鼠和WT 大鼠感染hRSV 病毒后，外周血中MCP-1 的變化趨勢相同，MCP-1 含量都是先升高后降低，但IL2rg-／-大鼠MCP-1 因子升幅高于WT 大鼠。

3 討論

為了獲得能支持hRSV 病毒感染與復制、重現臨床感染癥狀的動物模型，已經開展了大量的研究[7]。 在環磷酰胺處理，抑制宿主免疫系統的情況下，棉鼠對hRSV 易感性增強。 本文采用TALEN 基因編輯技術敲除SD 大鼠的IL2rg基因，經過篩選傳代，獲得可連續傳代并穩定遺傳基因敲除品系。 純合的IL2rg-／-大鼠的NK 細胞呈功能性失活，導致大鼠固有免疫應答缺陷。 在滴鼻感染hRSV 后，其體重與WT 大鼠相比，減緩不明顯，這與現有大多數hRSV 靈長類模型和嚙齒類模型相似。

而在本研究中，觀察到hRSV 能在IL2rg-／-大鼠的呼吸道靶器官內有效增殖，達到很高的滴度。 雖然IL2rg-／-大鼠下呼吸道中hRSV 病毒載量隨感染時間延長而降低，氣管內hRSV 病毒仍可維持2 周左右，與WT 大鼠相比，無論是病毒載量還是維持時間，都顯示出明顯的優勢。 與已有免疫功能正常的hRSV 感染小鼠和棉鼠模型相比[14-15]，IL2rg-／-大鼠肺組織的病毒載量與感染時間也明顯延長至3 周。在前期的工作中，發現hRSV 在T、B 細胞缺陷的小鼠模型中，病毒水平及維持時間均大幅提高[16]，這也說明適應性免疫缺陷對hRSV 感染的影響。

IL2rg-／-大鼠的B 細胞在hRSV 感染后早期有明顯增殖現象，而T 細胞無變化，說明B 細胞可能在抑制hRSV 復制中發揮了作用，這與小鼠感染后表現出T 細胞終止hRSV 復制的重要作用略有不同[17]，大鼠與小鼠的這種差異有待于今后進一步驗證。 hRSV 感染IL2rg-／-大鼠后，鼻、氣管和肺組織病理改變不典型，沒有觀察到合胞體形成等細胞病變，后續尚需進一步優化。

較小鼠而言，大鼠模型具有體積大、臟器大的特點，便于取到足量的材料，實驗大鼠在神經科學研究、藥代藥理學研究領域用途廣泛。 通過基因敲除技術獲得的免疫缺陷動物模型，遺傳穩定，重復性好，方便開展研究。 相較于新生小鼠[18]、老齡化棉鼠[19]，以及需要控制用量、并長時間環磷酰胺處理制成的免疫缺陷棉鼠模型[20]而言，有突出的優勢。 實驗中，可以選取常用的3 ～4 周齡大鼠，便于實驗安排與實驗動物管理。 但是IL2rg-／-大鼠免疫缺陷的特性讓其無法用于疫苗效果評價及需要宿主免疫反應的機制研究，這是免疫缺陷動物模型的局限性，同時也是免疫功能正常動物無可取代的優勢。 但在如抗病毒藥物篩選、抗hRSV 抗體體內效力評價等方面，IL2rg-／-大鼠模型支持hRSV 高水平復制和并長期感染，可以很好的區分藥物治療效果，是評估治療方法的有用工具。