芩薊涼血合劑對痔病相近動物模型的影響

周蒙恩，李鵬，金文琪，王若琳，郭修田

（上海中醫藥大學附屬市中醫醫院肛腸科，上海 200071）

痔是臨床最常見的肛門直腸疾病之一，我國成人肛腸疾病的患病率50.10%，其中98.09%的患者具有痔瘡癥狀[1]。 在美國，痔是第三常見的門診胃腸診斷，患病率范圍從4.4% ～40%，每年造成近400 萬次醫院就診，導致巨大的經濟成本和個人痛苦[2-4]。 痔最常見的表現是排便時無痛性直腸出血，伴或不伴肛門組織脫垂[5]。 而對其確切病理生理學知之甚少，主流理論認為痔是由血管的異常擴張和扭曲以及支撐結締組織的肛墊的破壞性變化引起的[6]。 其早期癥狀通常采用非手術方式治療，當非手術治療無效時，通常選擇手術治療[7]，但手術后出現的排便困難、頑固性疼痛、大出血等并發癥讓患者心生恐懼[2]。 從消除或減輕癥狀出發，痔病最常用的治療方法是藥物治療[8]。 西醫一般使用靜脈活性藥物類黃酮來改善靜脈張力，穩定毛細血管通透性和增加淋巴引流，進行痔出血治療[9-10]。而中醫對痔的認識由來已久，可以緩解痔病患者的癥狀，在藥物保守治療方面優勢突出[11]。 芩薊涼血合劑為上海市中醫醫院院內制劑，具有清熱涼血、收斂止血、散瘀消癰等功效，臨床療效顯著，但是臨床提供的依據有限，因此，本研究通過建立急性痔病模型，旨在探討其治療抗痔的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

80 只SPF 級雌性SD 健康大鼠，7 周齡，體重180 ～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK（滬）2022-0004】，24 只SPF 級C57BL／6雄性健康小鼠，6 周齡，體重18 ～20 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司【SCXK（滬）2023-0004】，大鼠和小鼠均飼養于上海市中醫醫院動物實驗室【SYXK（滬）2020-0014】，飼養環境：晝夜各半循環照明，濕度控制在40% ～70%，溫度控制在22 ～25 ℃， 本研究經過上海市中醫醫院倫理委員會批準（IACUC-2023002）。

1.1.2 主要試劑與儀器

巴豆油（C12229973，上海麥克林生化），吡啶（C865142，上海麥克林生化），乙醚（20210716，國藥化學試劑有限公司），乙酸（20080913，上海強順化工），地奧司明（H2005471，南京鄭達天晴制藥），腎上腺色腙片（H32023286，江蘇亞邦愛普森藥業），IL-6 （ 20220926-30219B， 上海酶聯）， TNF-α（20220926-31063B，上海酶聯），蘇木素染色液（22040716，中杉金橋生物技術），伊紅染色液（22062319，中杉金橋生物技術）。 芩薊涼血合劑（Qinji Liangxue mixture，QLM）已在上海市藥品監督管理局（備案號：滬藥制劑字： Z20210039000。 執行標準： SYZ-ZF-217-2005），由上海市中醫醫院藥劑科提供（藥物組成：地黃、大薊草、黃芩、火麻仁、茜草（炭）、地榆（炭）、槐角（炭）、側柏葉（炭）、仙鶴草、甘草（蜜炙），比例為3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 ∶5 ∶1。

RM2016 病理切片機（Leica，德國），生物組織攤烤片機（YT-6C，亞光醫用電子技術），防脫載玻片（P031IH，湖南艾佳生物科技），鼓風干燥箱（DHC-9070A，天津津立儀器設備科技），光學顯微鏡（AE41，麥克奧迪實業集團）。

1.2 方法

1.2.1 巴豆油誘導急性痔瘡模型

巴豆油制劑（croton oil preparation，COP）由去離子水、吡啶、乙醚和6%巴豆油按1 ∶4 ∶5 ∶10 的比例配制而成。 將40 只SD 大鼠分為5 組，每組8 只，在使用COP 之前，大鼠禁食1 夜，將浸有160 μL COP 無菌棉簽（直徑4 mm），插入研究動物的肛門（肛門直腸部分，距離肛門20 mm），并保持10 s[12]。誘導后24 h，各組的動物被灌胃治療7 d，藥物的劑量根據《藥理實驗方法》[13]進行換算。 分組如下：對照組1（CA 組），模型組1（CB 組），QLM 低劑量組1-1（CC 組）：4.45 g／（kg·d），QLM 高劑量組1-2（CD 組）：17.8 g／（kg·d），地奧司明組1（CE 組）：100 mg／（kg·d）。 除了CA 組外，其他組均使用COP處理，CA 組及CB 組給予等量生理鹽水。

1.2.2 冰醋酸誘導急性痔瘡模型

將40 只SD 大鼠分為5 組，每組8 只，在冰醋酸誘導急性痔病模型之前，大鼠禁食1 夜，將直徑6 mm 濾紙片浸泡于99.0%醋酸溶液中，將浸泡后的濾紙片放到大鼠肛門周圍，使濾紙片緊密接觸肛周皮膚及黏膜，每次用濾紙1 片，每只鼠于0.5、1 min時換1 次濾紙片，共更換2 次[14]。 誘導后24 h，各組的動物被灌胃治療7 d，藥物劑量根據《藥理實驗方法》[13]進行換算。 分組如下：對照組2（GA 組），模型組2（GB 組），QLM 低劑量組2-1（GC 組）：4.45 g／（kg·d），QLM 高劑量組2-2（GD 組）：17.8 g／（kg·d），地奧司明組2（GE 組）：100 mg／（kg·d）。 除了GA 組外，其他組均使用冰醋酸處理，GA 組及GB 組給予等量生理鹽水。 結束后對大鼠肛門潰瘍的最大直徑進行測量，并計算潰瘍面積［潰瘍面積（mm2） ＝ π（最大直徑／2）2］。

1.2.3 小鼠分組及給藥

將24 只C57BL／6 小鼠分為4 組，藥物劑量根據《藥理實驗方法》[13]進行換算：對照組（A 組）：等量生理鹽水；QLM 低劑量組（B 組）：6.4 g／（kg·d）；QLM 高劑量組（C 組）：25.6 g／（kg·d）；腎上腺色腙片組（D 組）：1.5 mg／（kg·d）；連續灌胃7 d。

1.2.4 肛門直腸組織病理學評估

大鼠肛門直腸組織先使用4%多聚甲醛固定，再經過包埋、切片進行HE 染色，然后進行封片鏡檢。 觀察巴豆油誘導的SD 大鼠肛門直腸組織病理學形態，參照文獻[14]并進行分級評分：“-”肛門直腸黏膜上皮正常記為0 分；“ ＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性，伴有少量炎性細胞浸潤記為1 分；“＋＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性、排列紊亂，黏膜下見大量炎性細胞浸潤記為2 分；“＋＋＋”肛門直腸黏膜上皮部分變性、缺損、壞死，黏膜下見大量炎性細胞浸潤，結締組織增生記為3 分。

1.2.5 血清炎癥因子檢測

按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，測定各組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平。

1.2.6 止血療效評估

參照文獻[15-16]使用毛細玻管法檢測凝血時間，小鼠斷尾法測出血時間，對QLM 的止血療效進行評價。

毛細管法測凝血時間：在末次給藥后1 h，用毛細玻璃管從小鼠內眼球的后靜脈叢中取血。 當血液充滿玻璃管時，立即計時。 每隔30 s 將兩端的玻璃管（約5 mm）折斷，慢慢左右拉動，觀察破裂處是否有血凝塊。 從血液充滿玻璃管到出現血凝塊的時間為凝血時間。

小鼠斷尾法測出血時間：末次給藥后1 h，將小鼠麻醉，距離小鼠尾尖5 mm 處剪斷，立即開始計時，每30 s 用濾紙擦拭斷尾直至濾紙上無血為止，經過的時間為出血時間。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0、Graphpad Prism 8 軟件進行統計分析、作圖，計量資料符合正態分布且方差齊，采用平均值± 標準差（±s）描述，差異比較采用t檢驗；不符合正態分布和方差不齊，采用中位數（上四分位數，下四分位數）［M （P25， P75）］表示，差異比較采用秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型病理形態學的影響

由圖1 可見，CA 組大鼠肛門直腸區組織結構正常；CB 組大鼠結直腸區黏膜嚴重糜爛、破損，伴有明顯的炎性浸潤，鱗狀上皮化生，黏膜下層水腫明顯，血管擴張明顯；CC 組的組織病理學顯示明顯的黏膜上皮再生，中度的脫屑和變性，較少的炎癥浸潤，較少的血管擴張，并且沒有明顯的充血和出血；CD 組的組織病理學顯示黏膜結構完整，上皮細胞和內分泌細胞排列有序，黏膜下微血管不充血；CE 組黏膜上皮明顯再生，結構較完整，輕度脫屑變性，炎癥浸潤血管擴張明顯減少，未見明顯充血出血。

2.2 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型病變程度評分的影響

如表1 所示，與CA 組相比，CB 組病變程度評分顯著升高（P＜0.05），與CB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低其病變程度評分（P＜0.05）。

表1 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型病變程度評分的影響［M （P25， P75），n ＝8］Table 1 Effect of QLM on the pathological grade score of rat hemorrhoid model induced by COP ［M （P25， P75），n ＝8］

2.3 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型炎癥因子的影響

如表2 所示，與CA 組相比，CB 組IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），與CB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低IL-6、TNF-α 水平（P＜0.05）。

表2 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影響（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

表2 QLM 對COP 誘導的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影響（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

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2.4 QLM 對冰醋酸誘導的大鼠痔病模型病理形態學的影響

如圖2 所示，GA 組肛周組織結構正常，GB 組肛周組織紋理紊亂、糜爛、缺損、水腫，黏膜與肌層分離，伴有大量炎性細胞浸潤及毛細血管擴張；GC組肛周組織糜爛、缺損、水腫較明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，未見明顯毛細血管擴張；GD 組及GE 組肛周組織未見明顯缺損、水腫及炎性浸潤。

圖2 QLM 對冰醋酸誘導的大鼠痔病模型病理形態學的影響Figure 2 Effect of QLM on pathomorphology of rat hemorrhoid model induced by glacial acetic acid

2.5 QLM 對冰醋酸誘導的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響

如表3 所示，與GA 組相比，GB 組肛周潰瘍面積顯著升高（P＜0.05），與GB 組相比，QLM 治療后能夠顯著降低其肛周潰瘍面積（P＜0.05）。

表3 QLM 對冰醋酸誘導的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

表3 QLM 對冰醋酸誘導的大鼠痔病模型肛周潰瘍面積的影響（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

注：與GA 組相比，aP ＜0.05；與GB 組相比，bP ＜0.05。Note. Compared with group GA， aP ＜0.05. Compared with group GB，bP ＜0.05.

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2.6 QLM 止血療效評價

使用毛細管法和小鼠斷尾法對QLM 止血效果進行評價，結果顯示QLM 可以顯著縮短凝血時間、出血時間（P＜0.05），見表4。

表4 QLM 止血療效評價（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

表4 QLM 止血療效評價（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

注：與A 組相比，cP ＜0.05。Note. Compared with group A， cP ＜0.05.

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3 討論

我國對痔的認識可以追溯到夏商時期，最早出現在非醫學典籍《山海經》[17]。 中醫學對痔病病因病機的認識由來已久，《素問·生氣通天論》最早有“因而飽食，筋脈橫解，腸澼為痔”的記載。 后世進一步概括為臟腑本虛，飲食勞逸，導致臟腑功能失調，風濕燥熱下迫大腸，瘀阻魄門，瘀血濁氣結滯不散，筋脈縱橫而成痔；臨床上分為治療上以清熱利濕，涼血止血，活血祛風，補中益氣等為主[18]。

前期臨床研究發現QLM 能有效緩解出血性痔瘡患者大便帶血的癥狀，改善痔瘡黏膜充血、縮小痔瘡體積等，有效干預痔瘡的臨床進展，降低住院手術比例，改善患者的生活，治療期間無明顯副作用[19-21]。 其中大薊草涼血止血，散瘀解毒消癰為君藥，現代藥理學研究發現大薊有效成分具有抗炎、止血等作用[22-23]。 黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，涼血止血依為君藥，現代藥理學研究發現黃芩有效成分具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調節以及心腦血管保護等作用[24]。 生地黃為治熱入營血之要藥，可以清熱涼血止血，與大薊、黃芩同為君藥。 現代藥理學研究發現地黃具有抗炎、止血、抗氧化等作用[25]。地榆（炭）、側柏葉既能涼血止血，又能收斂止血為臣藥。 現代研究發現地榆、側柏葉中的有效成分具有抗炎止血、抗氧化、抗菌等多種藥理活性[26-27]?；苯牵ㄌ浚鲅寡?，清腸疏風，仙鶴草收斂止血，意在加強收澀止血治標之功，共為“臣藥”。 現代藥理學研究發現槐角具有止血、抗炎等作用[28]，仙鶴草具有抗炎、抗氧化等作用，同時具有抗凝促凝雙重特性[29]。 此外，涼血止血藥易于涼遏戀邪，有止血留瘀之弊。 茜草（炭）味苦性寒，功能涼血止血，祛瘀通經。 現代藥理學研究發現茜草具有良好的化瘀止血作用[30]。 治療急性出血同時，具有化瘀的作用，起到止血不留瘀，祛瘀生新血的療效。 火麻仁為“佐藥”，與生地、槐角相配功能潤腸通便，緩解長期出血的痔病患者血燥津虧，引起的便秘癥狀。 甘草調和藥性，緩和諸藥之寒，顧護脾胃陽氣，是為“使藥”。 諸藥合用共達涼血止血，清熱祛風，散瘀消癰，潤腸通便等功效的功效。

有研究報道在痔組織血管壁及周圍結締組織發現嚴重炎癥反應[31]。 國內學者通過對380 例痔病患者痔組織進行病理學檢查發現195 例痔組織中存在慢性炎癥[32]。 免疫組化[33-34]分析也發現痔組織中IL-6、TNF-α 等炎癥因子表達水平升高，這提示炎癥因子可能參與了痔病的發生發展。 本課題組通過綜述近年來中藥復方或草藥制劑治療痔病的機制[35]，發現抑制炎癥因子也是其治療痔病的機制之一。 一些中藥復方如加味補中益氣湯[36]可以很好的改善痔相近動物模型出血、局部潰瘍及水腫狀況；ZHANG 等[37]能夠降低COP 誘導的痔病動物模型炎癥因子水平，減輕組織損傷；生姜外用可以減輕大、小鼠痔病模型肛周腫脹及潰瘍程度[38]；銀芷顆粒熏洗劑可以緩解急性痔病模型癥狀，具有良好的抗炎、鎮痛、止血作用[39]。 此外，國外一些研究發現葡萄葉醇提物、魔芋塊莖以及茄子也具有良好的抗痔活性，可能與其抗炎、抗氧化、降低血清炎癥因子等作用密切相關[40-42]。

本研究按照《中藥痔瘡動物模型制備規范（草案）起草說明》[14]使用COP 誘導了大鼠肛門腫脹模型，使用冰醋酸誘導了大鼠肛門潰瘍模型，QLM 治療后能夠顯著改善COP、冰醋酸誘導的大鼠肛門直腸病理損傷，降低COP 誘導的大鼠痔病模型病變程度評分，IL-6、TNF-α 水平以及冰醋酸誘導的大鼠肛周潰瘍面積。 此外，使用毛細管法測凝血時間，小鼠斷尾法測出血時間，發現了QLM 顯示出良好的止血療效。 因而，QLM 具有的抗痔活性，其作用可能是通過抗炎、止血、減少組織損傷實現的。