小鼠甲狀腺功能減退模型的建立

蘭浩淼張立毛雨謝林浚車紅纓?

（1. 四川省自貢市第一人民醫院甲乳外科， 四川自貢 643000；2. 西南醫科大學附屬醫院甲狀腺外科，四川瀘州 646000；3. 西南醫科大學附屬醫院臨床醫學研究中心， 四川瀘州 646000）

甲狀腺功能減退（簡稱甲減）是一種甲狀腺激素缺乏的病理狀態，除了會引起黏液性水腫、記憶力減退和心動過緩等一系列甲狀腺激素減少所帶來的癥狀外[1]，甲狀腺激素的減少和促甲狀腺激素的增加也是全身多個系統疾病的獨立危險因素[2]。

近年來，甲減的人群數量持續上升，對于甲減及其相關并發癥的研究越來越多，所以需要相應的動物模型助力研究。 通過小鼠建立甲減模型的主流方式是藥物造模，但藥物造模無法避免藥物對于甲狀腺以外組織產生的一系列作用從而影響實驗結果。 甲狀腺全切模型主要被應用于大鼠造模。而小鼠與大鼠相比，與人的基因同源性更高[3]。 小鼠在腫瘤學、生理學及免疫學等領域研究應用較多。 在探討甲減與各系統疾病之間關系時，甲狀腺全切后能夠造成更為穩定的甲減狀態。 但是對于小鼠甲狀腺全切模型的建立卻少有報道。 因此，在本研究中，利用C57BL／6 和KM 小鼠，進行甲狀腺全切術，通過對兩種小鼠甲狀腺血供及周圍組織進行探索，并對甲狀腺手術方式進行描述，通過記錄和分析手術前后小鼠的體重，檢測血清甲狀腺相關激素及對頸部切除物行HE 染色驗證小鼠甲狀腺功能減退模型是否成功，并通過對比兩種術式成功率差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級C57BL／6（體重約16 g）和KM（體重約30 g）雄性小鼠各25 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】。飼喂條件：光照時間12 h／12 h，相對濕度45% ～50%，環境溫度22 ～23 ℃；所有小鼠都自由飲水和采食，飼養于西南醫科大學動物實驗中心【SYXK（川）2018-065】。 手術前所有小鼠均飲用純凈水和普通小鼠維持飼料，術后假手術組繼續術前飲食，術式Ⅰ組和術式Ⅱ組小鼠以0.1%葡萄糖酸鈣水和普通小鼠維持飼料喂養。 本實驗所有涉及研究動物操作均按照西南醫科大學實驗動物倫理委員會倫理管理要求進行并經過審批（20210223-112）。

1.1.2 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛（Biosharp，BL539A），小鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）ELISA KIT（Dogesce，DG30448M-96），小鼠甲狀腺素（T4） ELISA KIT（Dogesce，DG30445M-96），小鼠促甲狀腺素（TSH）ELISA KIT（Dogesce，DG30463M-96）。

胰島素注射針（FEIYUBIO，中國），數碼顯微鏡（瑞沃德生命科技，DOM-1001，中國），眼科顯微剪（輝諾，中國），眼科顯微鑷（輝諾，中國），小動物手術用非吸收性帶線縫合針6-0（邁越生物，中國），1.5 mL Ep 管（DEWEIBIO，中國）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的分組及建立

將C57BL／6 雄性小鼠各分為假手術組（C-Sham組，n＝5）、術式I 組（C-SⅠ，n＝10）和術式Ⅱ組（C-SⅡ，n＝10）；將KM 雄性小鼠各分為假手術組（K-Sham 組，n＝5）、術式I 組（K-SⅠ，n＝10）和術式Ⅱ組（K-SⅡ，n＝10），手術前所有小鼠均飲用純凈水和普通小鼠維持飼料，術后假手術組繼續術前飲食，術式Ⅰ和術式Ⅱ組小鼠以0.1%葡萄糖酸鈣水和普通小鼠維持飼料喂養。

由于C57BL／6 小鼠和KM 小鼠體型及甲狀腺解剖結構相似，故其手術方法一致。 甲狀腺的暴露：利用麻醉劑腹腔注射麻醉小鼠并固定，在小鼠對應頸后墊一塊5 cm × 1 cm × 0.5 cm 紗布墊使術野更為暴露，自小鼠胸骨上窩的頸正中為起點，向上切開皮膚約1 cm，切開后可見左右兩下頜腺由被膜相連，用眼科顯微直剪鈍性分離，分離后可見完整頸前肌，用眼科顯微彎鑷自切口視野正中輕輕提起頸前肌，眼科顯微彎剪垂直于頸前肌正中剛好刺入肌組織，然后鈍性分離約1 cm。 此時氣管和甲狀腺暴露于術野。 將覆蓋于甲狀腺外側的帶狀肌鈍性分離，直至甲狀腺與其完全分離，并用小拉鉤將帶狀肌及其外側組織拉開，充分暴露甲狀腺。 假手術組至此步驟后縫合。

術式Ⅰ：將甲狀腺側葉提起并輕輕翻轉，暴露該側甲狀腺背側于視野，從上極入針點結扎甲狀腺上極動脈并沿線頭近甲狀腺側將血管離斷，注意應盡量靠近上極血管，并完全避免結扎除血管、被膜之外的任何組織。 用同樣手法結扎另一側甲狀腺上動脈，緊貼結扎處，在線頭靠甲狀腺側銳性離斷上極血管，從一側甲狀腺上極開始沿被膜將甲狀腺撕離氣管，注意整個過程應保證甲狀腺后被膜的完整性，并避免接觸喉返神經，直至剝離至離斷另一側上極血管。 將摘除甲狀腺于4%多聚甲醛中固定。

術式Ⅱ：首先提起一側腺體，暴露上極血管，銳性離斷上極血管，快速提起另一側上極血管，并銳性離斷血管，小棉簽雙側輕輕按壓止血30 ～120 s，出血減少后，用與術式Ⅰ同樣手法剝離甲狀腺組織。

最后確認氣管無甲狀腺組織附著、無活動性出血后（如有出血可輕按壓止血），輕取紗布墊，復位氣管和帶狀肌，逐層縫合肌肉、下頜腺和皮膚，碘伏消毒皮膚，紗布覆蓋。 分別記錄各組每只小鼠手術用時。

1.2.2 觀察各組小鼠死亡率和體重變化

于小鼠入組開始，每日記錄小鼠死亡情況；于術前第7 天、術后第7、14、21、28 天分別記錄各組小鼠體重情況。

1.2.3 血清甲狀腺相關激素分析

術前第7 天和術后第28 天，通過眼眶取血。 用1.5 mL Ep 管收集血液，利用酶聯免疫吸附實驗檢測小鼠血清中TT3、TT4 及TSH 含量。

1.2.4 組織學分析

術中摘除小鼠甲狀腺組織，離體后用4%多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋。 進行常規2 μm 切片后，進行HE 染色。

1.3 統計學分析

使用SPSS 25.0 統計軟件（IBM，Armonk，NY，USA）進行統計分析。 采用W檢驗分析各指標的正態性。 符合正態分布的數據用平均值± 標準差（ˉx±s）描述，兩組比較采用T檢驗，多組間獨立數據比較采用方差分析（ANOVA）。 兩組模型組間生存率采用校正χ2檢驗，P＜0.05 為異具有顯著性差。

2 結果

2.1 各組小鼠術后28 d 內存活情況

假手術組：C57BL／6 小鼠（C-Sham）：術中死亡1 只，術后28 d 內死亡總計1 只；KM 小鼠（KSham）：無。 術式Ⅰ組：C57BL／6 小鼠（C-SⅠ）：術中死亡1 只，術后第1 天死亡2 只，術后第3 天死亡2 只， 術后第4 天死亡1 只，術后28 d 內死亡總計6 只； KM 小鼠（K-SⅠ）：術中死亡0 只，術后第1 天死亡3 只，術后第3 天死亡2 只，術后28 d 內死亡總計5 只。 術式Ⅱ組：C57BL／6 小鼠（C-SⅡ）：術中死亡2 只，術后第3 死亡2 只，術后28 d 內死亡總計4 只； KM 小鼠（K-SⅡ）：術中死亡1 只，術后第3 天死亡4 只，術后第9 天死亡1 只，術后28 d 內死亡總計6 只。 術式Ⅰ組和術式Ⅱ組小鼠術后28 d 內存活率分別為C57BL／6 小鼠：40%和60%（圖1A）；KM 小鼠：50%和40%（圖1B），不同術式及不同品種小鼠同種手術方式組間存活率均無顯著性差異。

圖1 C57BL／6 和KM 小鼠術后28 d 生存率Note. A. C57BL／6 mice survival rate. B. KM mice survival rate.Figure 1 Survival rate at 28 days after operation in C57BL／6 mice and KM mice

2.2 兩種小鼠甲狀腺解剖及血管結扎點

兩種小鼠甲狀腺均呈淡紅色，形似“U”，由左、右側葉和中間的峽部組成，上極位于甲狀軟骨中部兩側，下極至甲狀軟骨下方第3 ～4 氣管軟骨，峽部與兩側甲狀腺葉下極相連，位于氣管正前方，兩界達氣管中后方（圖2A，2F）。 小鼠甲狀腺供血主要來源于頸外動脈發出的甲狀腺上動脈，甲狀腺靜脈位于雙側甲狀腺下極下方，緊鄰喉返神經走行，小鼠喉返神經走行于甲狀腺側葉后方。 氣管與甲狀腺上動脈所形成交叉“三角地帶”為甲狀腺上動脈結扎入針點（圖2B，2G）。 術式Ⅱ時，應暴露該三角后，緊貼甲狀腺上極銳性離斷甲狀腺上極血管，并用無菌小棉簽按壓止血。 術式Ⅰ結扎甲狀腺上極血管后，兩種屬小鼠甲狀腺均充血，略變大（圖2C，2H）。 將甲狀腺鈍性剝離氣管后，可見喉返神經完整走行與氣管食管溝內，在甲狀軟骨下方入喉（圖2D，2I）。 兩種屬小鼠剝離下的甲狀腺形狀類似，峽部將甲狀腺兩側葉下極連接，呈“U”型，且甲狀腺表面背膜完整（圖2E，2J）。 圖3 為兩不同種屬小鼠的甲狀腺模擬圖。

圖3 C57BL／6 和KM 小鼠甲狀腺解剖模擬圖Figure 3 Thyroid anatomic simulation of C57BL／6 mice and KM mice

2.3 各組小鼠體重變化情況

在術前第7 天時，各組間體重變化無顯著性差異（表1）。 在術后第28 天時，C57BL／6 小鼠中，術式Ⅰ組和術式Ⅱ組小鼠的體重較對照組均較高，但僅術式Ⅱ組與對照組間差異具有顯著性（P＜0.05）。 在KM 小鼠中，手術組小鼠體重均數也較對照組高，其中術式Ⅰ組與對照組間差異具有顯著性（P＜0.001）（表1）。

2.4 各組小鼠血清甲狀腺相關激素變化

分別于術前第7 天和術后第28 天對6 組小鼠進行血清TT3、TT4、TSH 檢測。 術前7 d 相同品系小鼠三組血清各項指標差異均無顯著性（圖4A ～4C）。術后第28 天，模型組大鼠TT3 和TT4 均明顯降低，且與假手術組相比，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖4D，4E），模型組大鼠TSH 水平與假手術組相比明顯上升，且差異具有顯著性（P＜0.001）（圖4F）。

圖4 C57BL／6 和KM 小鼠術前第7 天及術后第28 天血清TT3、TT4 及TSH 水平Note. A ～C. Serum TT3， TT4 and TSH levels of mice in 2 groups on the 7th day before surgery. D ～F. Serum TT3， TT4 and TSH levels of mice in 2 groups on the 28th day after surgery. Compared with C-Sham group， ???P ＜0.001. Compared with K-Sham group， ＃＃P ＜0.01.Figure 4 Serum TT3， TT4 and TSH levels of C57BL／6 and KM mice on the 7th day before surgery and the 28th day after surgery

2.5 HE 染色

將C57BL／6 和KM 小鼠術中剝離的頸部組織行HE 染色觀察發現，發現大量類圓形濾泡結構，絕大多數濾泡內含豐富膠質，濾泡間可見毛細血管和散在的濾泡旁細胞（圖5），該組織學特點符合甲狀腺組織學特征。

圖5 C57BL／6 和KM 小鼠頸部剝離組織HE 染色Figure 5 HE staining of C57BL／6 mice and KM mice

3 討論

甲狀腺功能減退癥是指體內甲狀腺激素缺乏而表現的一種疾病。 甲狀腺功能減退所引起的癥狀常常是非特異性的，最常見的包括疲勞、耐寒和便秘。 未經治療的甲狀腺功能減退，特別是臨床顯性的甲狀腺功能減退，無論是短期或是長期，均可導致多個器官系統的嚴重不良影響，甚至死亡[1]。作為人體內十分重要的內分泌器官，所分泌的甲狀腺激素與機體各個系統、器官所發生的許多疾病都有著密切聯系。 為了研究甲狀腺功能減退癥以及該疾病與其他疾病的聯系，甲狀腺功能減退的動物模型是必不可少的研究工具和手段[4-7]。

在動物模型中，誘導甲狀腺功能減退的方法較多。 通過敲除特異性甲狀腺受體或去碘酶等基因[8-9]，可構建穩定的甲狀腺功能減退動物模型，但是基因敲除造模程序復雜，需要耗費大量人力和時間，通常獲取一個基因剔除的純合子小鼠需要大約1 年時間，且基因敲除純合小鼠很難通過自身繁殖獲得純合敲除的后代[10]，所以，很難將基因敲除所造甲狀腺功能減退模型小鼠進行大面積推廣，但基因敲除造成甲狀腺功能減退模型對于研究中樞性甲狀腺功能減退或去碘酶缺乏等特殊類型的甲狀腺功能減退具有不可替代的優勢。 除此之外，抗甲狀腺藥物、放射性碘或低碘飲食均可造成實驗動物甲狀腺功能減退。 抗甲狀腺藥物主要包括用丙硫氧嘧啶或甲巰咪唑喂養實驗動物，造成動物血清TT3、TT4 下降，TSH 升高[11-12]，該方法的優點是造模方法簡單、成功率高，但該方法造模所需時間較長，且一旦停止喂藥，甲狀腺激素水平極為不穩定，甲狀腺功能減退狀態很快會消失，更為重要的是，無法排除抗甲狀腺藥物對于動物機體其他器官及組織所產生的干擾性影響。 放射性碘注入實驗動物體內后，被甲狀腺所凝聚，造成甲狀腺細胞壞死，從而引起甲狀腺功能的減退[13]，但該方法對于造模設備要求較高，且存在放射性物質污染風險，在一般實驗中應用較少。 低碘飲食造模，主要通過喂食實驗動物低碘飲食實現，造模方法簡單，但可控性較差，且用時較長，主要被用于研究碘缺乏相關疾病。

手術切除甲狀腺可以快速造成實驗動物甲狀腺功能減退，且甲狀腺功能減退狀態較為穩定，該方法在許多實驗中被應用，其中Wistar 大鼠或SD大鼠被應用最多，甲狀腺全切模型的建立不僅要求盡可能完整的將甲狀腺切除，而且要求在手術同時，要盡可能的保護甲狀腺周圍的重要器官、組織，如氣管、喉返神經、甲狀旁腺及食管等，損傷這些重要器官或組織，將大大增加實驗動物的致死率，甲狀腺全切的小鼠模型報道較少也可能與其手術高死亡率有關。 在本實驗中，術式Ⅰ小鼠在術中死亡1 只，而術式Ⅱ小鼠在術中死亡3 只。 術式Ⅰ通過先結扎小鼠甲狀腺動脈，在鈍性剝離甲狀腺組織，其操作步驟中，易引起小鼠死亡因素較少，而術式Ⅱ，通過先銳性離斷甲狀腺動脈，再迅速銳性離斷另一側血管，首先該過程，出血對于術區視野干擾較大，易造成甲狀腺周圍臟器的損傷，其次，壓迫止血所需時間較長，術中死亡3 只小鼠均系止血過程中死亡，不能排除止血時對于氣道的壓迫減少了麻醉中小鼠的潮氣量所造成。 另外，在成功止血并剝離甲狀腺后，殘端血管再次出血風險也極高，研究人員在對術式Ⅱ組小鼠術后3 d 內死亡小鼠進行解剖時發現，43%的小鼠氣管周圍布滿血凝塊。 術式Ⅱ手術時間長、出血和再出血風險是造成其高死亡率的主要原因，術式Ⅰ的手術時間較術式Ⅱ沒有明顯優勢，但其出血和再出血風險極小。 在本研究中，兩種術式的小鼠最終存活率并沒有明顯差異，這可能與本研究使用小鼠樣數量偏少有關。 在本研究中，術后第9 天，KM 小鼠術式Ⅱ組仍有手術組小鼠死亡，考慮可能系術后感染所致，小鼠因其術后依從性極差，應在術中特別注意無菌操作，在術后盡量將手術小鼠單獨或少量同籠飼養，避免斗毆等引起的術后感染發生。 在不影響實驗者研究目的的情況下，可考慮予以術后小鼠飲水中添加適量抗生素預防感染[14]。

小鼠99%的基因能在人類基因組中找到同源基因[3，15]，在內分泌、免疫等疾病研究中具有難以替代的地位。 而小鼠甲狀腺較小，手術完整切除具有一定難度，手術切除后死亡率較高等一系列問題也造成了小鼠甲狀腺全切模型難以大面積推廣。 熟悉小鼠甲狀腺解剖情況及手術操作步驟，有利于提高造模成功率和降低死亡率。 本研究中，主要對于C57BL／6 小鼠和KM 小鼠兩種不同品系的小鼠進行了甲狀腺全切的操作。 研究發現，兩種不同品系小鼠甲狀腺解剖結構基本相似，均由頸內動脈發出的甲狀腺上動脈供血，甲狀腺上動脈是C57BL／6 小鼠和KM 小鼠甲狀腺的最重要的供應血管，對其結扎或銳性離斷后再沿著氣管表面鈍性剝離，剝離過程中盡量保證甲狀腺背膜的完整性，以避免甲狀腺組織的殘留。 在剝離過程中，將甲狀腺背膜外組織盡量原位保留，避免損傷甲狀旁腺等重要器官。 小鼠喉返神經緊貼于甲狀腺后方，在鈍性剝離甲狀腺時要輕提甲狀腺組織，盡量暴露位于后方的喉返神經，從而減少操作中損傷機會。 由于小鼠甲狀旁腺過小，無法確切保留，但之前有研究表明，C57BL／6小鼠甲狀旁腺一般有2 ～3 枚，主要位于甲狀腺上緣附近，其次位于甲狀腺下緣附近，以上兩個位置甲狀旁腺均貼近甲狀腺，少部分甲狀旁腺遠離甲狀腺[16]，故手術中較難避免損傷甲狀旁腺，故術后通過飲水中加入葡萄糖酸鈣（水中濃度為0.1%）預防小鼠發生嚴重性低鈣血癥，從而降低了低鈣造成的死亡風險[5]。

對于手術后的模型驗證，主要選擇利用酶聯免疫吸附法（ELISA 法）對小鼠術前第7 天及術后第28 天血清TT3、TT4 及TSH 進行檢測。 在其他研究中，甲狀腺全切后檢測實驗動物血清激素的方法還有化學發光法、放射性免疫法等[17-18]，而ELISA 法具有的優勢在于設備易獲得，對于血清激素檢測的特異度和靈敏度均較高，檢測結果較為穩定等優點[19]。 在本研究中，兩種屬小鼠術前驗血中，TT3、TT4 及TSH 差距較小且組間均沒有統計學意義。而在術后，兩種屬小鼠無論是術式Ⅰ或術式Ⅱ組，較Sham 組小鼠TT3 和TT4 均明顯下降（P＜0.05），而TSH 則較Sham 組明顯上升（P＜0.001）。根據甲狀腺功能減退的定義，可以認為造模成功。另外，根據對于兩種屬小鼠術前及術后體重的記錄，本研究發現，在C57BL／6 和KM 小鼠中，兩手術組在術后28 d 后體重均數都較假手術組上升，但CSⅠ組較C-Sham 組和K-SⅡ組較K-Sham 組體重差異無統計學意義，統計學無意義可能是由于該組體重標準差較大造成，而造成組內體重差異較大的原因可能是小鼠在術后斗毆或取食不均所造成。 最后，將從兩種屬小鼠體頸部取出組織行HE 染色后發現其符合甲狀腺組織的細胞、組織形態學特征，且將剛離體的甲狀腺組織置于顯微鏡下，可看到完整的甲狀腺背膜附著于其上，進一步驗證了造模的成功。

4 結論

綜上，通過兩種手術方式均可造成C57BL／6 和KM 小鼠甲狀腺功能減退。 本研究小鼠死亡率相比大鼠甲狀腺全切死亡率明顯較高[20]，降低小鼠死亡率是推廣該造模方法的重點。 術式Ⅱ較術式Ⅰ相比，止血時需要按壓甲狀腺游離血管斷端，增加手術時間的同時，加大了小鼠術中窒息死亡的風險。而術式Ⅰ的手術方式，需要操作者熟練的掌握小鼠甲狀腺解剖及操作步驟，從而避免誤傷結扎血管以外組織并縮短手術時間，有望進一步降低模型小鼠死亡率。