淫羊藿苷調控NLRP3 炎癥小體抗腦缺血再灌注損傷機制

曾奇吳雅晨胡茂華笪小云劉楊楊欣鄧穎劉明?

（1. 貴州中醫藥大學，貴陽 550025；2. 貴州中醫藥大學中藥、民族藥藥理作用及作用機制研究中心，貴陽 550025）

腦卒中是嚴重危害我國國民健康的常見心腦血管疾病，是我國成人高致殘率及高致死率的首位病因，現患病人數高居世界首位[1]。 其中，缺血性腦卒中的患病人數占全部腦卒中的70% ～80%。缺血性腦卒中發病后，如果錯失最佳治療時機，70%～80%患者會遺有不同程度的認知或運動功能障礙，嚴重影響患者的生活質量[2]。 現階段針對缺血性腦卒中的有效治療為溶栓治療，快速恢復供血[3]，但在此期間由炎癥反應引起的腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）嚴重威脅著患者的預后。

NLRP3 介導的炎癥聯級反應在缺血再灌注損傷中扮演著極為重要的調控角色。 研究指出，NLRP3 炎癥小體一經被激活即能與效應分子pro-Caspase-1 直接結合， 形成炎癥小體和成熟的Caspase-1，Caspase-1 在疾病進程中起重要作用[4]；Caspase-1 蛋白的激活可促使白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素18（interleukin-18，IL-18）水解釋放，引起細胞焦亡，這也是一種細胞死亡，影響急性和慢性腦部疾病發生發展[5]。 因此，通過調控NLRP3 炎癥小體及其上下游通路，可能為腦缺血再灌注損傷的研究提供重要依據[6-7]。

淫羊藿，也稱仙靈脾，屬小檗科植物。 有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功，在中國有2000 多年的藥用歷史。 淫羊藿的化學成分包括黃酮、木脂素、苯酚苷等[8]。 其中，黃酮類成分如淫羊藿苷（icariin，ICA） 是其重要的活性物質[9]。 ICA 分子式C33H40O15，相對分子質量為676.65，研究證實ICA具有抗腦缺血損傷、改善血液流變學抗血栓形成、抗腦衰老及血管性癡呆等作用[10-13]。 課題組前期研究發現ICA 可能通過調控TLR4／NF-κB 信號通路及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 的表達，改善大鼠腦缺血再灌注后的神經功能缺陷，抑制炎癥反應和神經細胞凋亡[10，14]。 但其作用機制是否與調控NFκB 信號通路下游靶點NLRP3 炎癥小體有關尚不清楚。 因此，本實驗利用線栓法模擬單側大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO），MCAO 閉塞2 h 后取出線栓，造成再灌注損傷，構建CIRI 大鼠模型，觀察ICA 對CIRI 大鼠神經功能及病理損傷的影響，測定大腦皮層中炎癥小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達，探討淫羊藿苷治療大鼠腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

80 只7 周齡SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重250 ～280 g，均購于湖南天勤生物技術有限公司【SCXK（湘）2019-0014】，飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所屏障環境【SYXK（黔）2021-0005】，5 只／籠， 采用12 h 晝夜間斷照明，溫度為（20 ±2） ℃，相對濕度為（55 ± 5）%，期間自由進食飲水。本動物實驗獲得貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（20220102）。

1.1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿苷（西安欣祿生物科技有限公司，批號YYH20180518，純度≥98%）；蘇木素-伊紅（HE）染液（均購買于武漢塞維爾生物科技有限公司，批號分別為：ZH202509、CR2011064）；丁苯酞軟膠囊（石藥集團恩必普藥業有限公司，批號：20190218）；NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-1β、IL-18 一抗（美國Affinity 公司， 批號分別為： DF7438， AF5103，AF5418，A13615，A0208）；β-actin 內參（abclonal，批號為AC026）；羊抗兔二抗（艾博抗（上海）貿易有限公司，批號：ab6721）。

RM2016 型病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；BMJ-A 型包埋機，常州郊區中威電子儀器廠；BX51T-PHD-J11 型顯微鏡，日本Olympus 公司；H2050R 高速低溫離心機，湖南湘儀實驗儀器廠生產；Image-Pro Plus 多功能真彩色細胞圖象分析管理系統，美國Media Cybernetics 公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；IMS-25 制冰機，蘇州麥艾仕電器有限公司；Varioska 酶標儀，美國Thermo 公司；MCAO 栓線（250 ～280 g），北京西濃科技有限公司；4-0 帶針外科縫線，上海復星醫藥（集團）股份有限公司淮明醫療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組

參照文獻[10，15]改良制作CIRI 大鼠模型，即：20%烏拉坦腹腔注射（0.6 mL／100 g）麻醉后，在頸部正中略向右側做1.5 cm 縱向切口，通過溫和的鈍性分離處理皮下結締組織和肌肉，精確定位右側頸總動脈（common carotid artery，CCA），頸外動脈和頸內動脈。 使用縫線對頸外動脈和CCA 近心端進行結扎，CCA 近心端的上部用動脈夾夾閉，CCA 分叉處預留活節（不系緊）縫線固定MCAO 栓線，在動脈夾與CCA 結扎點中間處剪一“V”型小口，插入MCAO 栓線，將栓線從分叉處經頸內動脈緩慢送入18 ～20 mm，縫線外科結固定栓線，阻斷大腦中動脈血流2 h 后取出栓線，結扎頸內動脈，縫合。 假手術組僅分離右側頸總動脈與頸外動脈處理后逐層縫合。 術后24 h，參照LONGA 等[15]評分標準進行神經功能評分，具體操作：肢體活動無異常，計0 分；提大鼠尾部時，不能完全伸展左前爪，計1 分；伴行走時出現向左側旋轉行為，計2 分；發生向左側跌倒的情況，計3 分；完全不能自由正?；顒踊驘o意識表現，計4 分。

選取評分為1 ～3 分的成功模型，隨機分為5組， 即模型組 （ Model group ）、 丁苯酞組（Butylphthalide group，70 mg／kg）、ICA 高劑量組（ICA-high dose group，80 mg／kg）、ICA 中劑量組（ICA-medium dose group，40 mg／kg）和ICA 低劑量組（ICA-low dose group，20 mg／kg），加上假手術組（Sham operation group）共6 組，每組12 只。 灌胃體積10 mL／kg，每天灌胃給藥1 次，連續13 d。 假手術組和模型組給予等容積的生理鹽水。

1.2.2 神經功能評分

末次給藥1 h 后，按上述方法再次對大鼠進行神經功能評分。

1.2.3 HE 染色法進行病理學觀察

每組隨機取5 只大鼠，麻醉處死后取大腦，4%多聚甲醛固定48 h 以上，梯度乙醇脫水，石蠟包埋冰凍后，切片4 μm，脫蠟，按試劑盒說明進行HE 染色操作，光學顯微鏡下觀察缺血周圍區大腦皮層相同部位視野病理學變化并拍照，計數神經元和完整神經元數目。

1.2.4 免疫組化法測定IL-1β、IL-18 蛋白表達

取“1.2.3”項下大鼠大腦空白切片，在經過脫蠟和脫水后，進行抗原修復。 接著滴加5% BSA 封閉液，隨后滴加一抗：抗IL-1β（1 ∶100）、抗IL-18（1 ∶100），最后將切片放置于4 ℃冰箱過夜。 接著滴加生物素標記的二抗，在37 ℃環境中孵育20 min。隨后進行PBS 沖洗，滴加SABC，在25 ℃環境中孵育20 min，PBS 洗滌，使用DAB 顯色，然后經蘇木素復染、分化、封片、晾干處理后，使用光鏡進行觀察。在隨機選擇的5 個不重疊缺血周圍區大腦皮層視野中，利用IPP 6.0 圖像分析系統對陽性著色細胞（胞質及突起內充滿棕黃色陽性反應顆粒）進行光密度計數，取得每個樣本的平均光密度計數平均值，用以反映大腦皮層IL-1β 和IL-18 蛋白的表達量。

1.2.5 Western Blot 法測定NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達水平

每組隨機選取5 個缺血側大腦皮層組織，勻漿離心取上清，進行BCA 蛋白定量測定，并于SDSPAGE 凝膠里電泳、轉膜、封閉；分別加入一抗NLRP3、ASC、Caspase-1、β-actin（均按1 ∶1000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次后加入1 ∶5000羊抗兔二抗室溫中速搖晃1 h，再次TBST 洗滌3次，進行顯影。 采用Image J 軟件對條帶進行分析。

1.3 統計學分析

使用SPSS 26.0 軟件，所有數據以平均值± 標準差（±s）表示，對多組間的均值進行比較時，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 大鼠神經功能評分結果

相對于假手術組，模型組大鼠的神經功能評分上升趨勢顯著（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組、ICA 高劑量組、ICA 中劑量組和ICA 低劑量組的神經功能呈下降趨勢，其中以ICA 高劑量組和ICA中劑量組的降低最明顯（P＜0.01，P＜0.05），這提示ICA 可能在改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能損傷方面具有顯著效果。 見圖1。

圖1 大鼠神經功能評分Note. Compared with sham operation group， ??P ＜0.01.In contrast to the model group，＃ P ＜0.05，＃＃ P ＜0.01.（The same in the following figures）Figure 1 Neurological function score of rats

2.2 大鼠缺血周圍區大腦皮層病理表現

假手術組腦組織無缺血性征象，神經元密集，神經元胞漿豐富，淡染，胞核居中，核仁清楚。 模型組的缺血周圍區大腦皮層出現為神經元和神經纖維大量發生變性壞死，同時神經元呈稀疏分布。 胞膜胞核輪廓顯示不清，胞體皺縮，胞核固縮深染，且神經元脫失現象明顯。 與模型組比較，各給藥組大鼠缺血周圍區大腦皮層正常與壞死細胞相間存在，神經元不同程度壞死或膠質細胞增生。 其中，丁苯酞組及ICA 高劑量組、ICA 中劑量組結構完整可辨的神經元數量較多（P＜0.01，P＜0.05）。 見圖2，圖3。

圖2 大鼠缺血周圍區腦組織完整神經元Figure 2 Intact neurons in ischemic peripheral brain tissue of rats

圖3 大鼠缺血周圍區腦組織完整神經元Figure 3 Intact neurons in the periischemic brain tissue of rats

2.3 大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 陽性表達結果

IL-1β、IL-18 的陰性細胞呈藍色，底物呈白色，陽性細胞表現為黃色或棕黃色，其陽性產物主要集中分布在細胞質及細胞間質。 模型組和假手術組相比，大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 陽性表達明顯升高（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組及ICA 高劑量組、ICA 中劑量組、ICA 低劑量組大鼠大腦皮層IL-1β 陽性均降低，其中以丁苯酞組及ICA 高劑量組下降顯著（P＜0.01），丁苯酞組和ICA 高劑量組、ICA 中劑量組大鼠大腦皮層IL-18 陽性表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。 見圖4。

圖4 大鼠大腦皮層IL-1β、IL-18 含量檢測結果Figure 4 Detection results of IL-1β and IL-18 contents in cerebral cortex of rats

2.4 大鼠大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達量

相對于假手術組，模型組大鼠大腦皮層中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達量見顯著升高（P＜0.01）。 與模型組相比，丁苯酞組和ICA 高劑量組、ICA 中劑量組大鼠大腦皮層中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達均降低明顯（P＜0.01，P＜0.05）；ICA 低劑量組Caspase-1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。 見圖5。

圖5 大鼠大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達結果Figure 5 Results of NLRP3， ASC， Caspase-1 protein expression in cerebral cortex of rats

3 討論

根據《中國腦卒中防治報告2021》最新概要報道，我國是卒中發病大國，患病人數居世界首位，卒中是我國成人致死、致殘首要病因，嚴重影響我國居民健康[1]。 缺血性腦卒中在卒中的比例呈逐年升高趨勢，即使給與血管內藥物溶栓和介入取栓等有效的治療，諸多患者仍會遺留相關后遺癥。 腦缺血再灌注損傷的發生是多機制共同參與的復雜過程，此過程密切相關的因素有氧化應激、鈣超載、炎癥反應激活及能量代謝異常。 最終這些復雜的生物學變化導致神經元凋亡，不可逆的使神經功能損傷[16-17]。

其中，一系列的炎癥聯級反應在缺血性腦卒中神經損傷的起重要作用[18]。 缺血性腦卒中發生后，伴隨著能量被大量消耗，以及出現神經細胞損傷或死亡，引發腦實質外周循環白細胞浸潤，腦組織小膠質細胞和星形膠質細胞活化，觸發一系列炎癥級聯反應，加重外周白細胞浸潤和神經細胞的損傷或死亡[19]。 藥物在腦缺血再灌注損傷中起神經保護作用的關鍵機制是促進抑制炎癥因子的表達，從而產生抗炎作用。 國內外以往的研究中證實了NLRP3 炎癥小體在腦缺血再灌注損傷中的介導作用，同時在腦缺血再灌注的炎癥反應中扮演著關鍵的角色[20-21]。 因此，本實驗通過建立大鼠CIRI 模型，探究ICA 對NLRP3 炎癥小體的調控作用，進一步研究其對CIRI 的影響機制[22]。

炎癥小體是一種分布于細胞漿中的復合物，通過對細胞內外信號刺激的調控，以調節細胞的生理狀態。 目前，已陸續發現多個炎癥小體家族成員，主要分布在NLRs（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors） 家族和 AIM2 （ absentin melanoma 2）家族。 這些家族的成員在感應和調控炎癥反應以及維持免疫平衡方面發揮著重要作用。NLRP3 在NLRs 家族中扮演著關鍵角色，是當前備受關注的炎癥小體之一。 NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC 和Caspase-1 前體組合而成的多蛋白復合物[23]。 這一多蛋白復合物在炎癥反應調控中發揮關鍵作用，當NLRP3 炎癥小體被激活時，能剪切并活化Caspase-1 前體，生成p20 活性片段，進一步催化促炎因子IL-1β 和IL-18 的形成與成熟，促使排放到細胞外參與炎癥反應[23-24]。

本研究旨在深入探討淫羊藿苷對NLRP3 炎癥小體的調控作用，以及其在治療大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用機制。 已有研究顯示，在腦缺血再灌注損傷實驗中，NLRP3 炎癥小體各相關蛋白以及活化產物的表達水平均上升[25]，此外，ICA 可以調控NLRP3 炎癥小體的激活，進而影響炎癥反應[26]，也能較好地改善LPS 和IFN-γ 聯合誘導的MANF 模型細胞炎癥反應，其抑制神經炎癥的作用效果明顯，其作用機制也與抑制NLRP3 炎癥小體及下游相關蛋白表達有關[27]。 本研究結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠存在較嚴重的神經功能缺損，缺血側大腦皮層病理變化明顯，NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達顯著增加。 經過ICA 的治療后，大鼠腦缺血再灌注后的神經功能缺損和缺血側大腦皮層病理損傷可顯著改善，并降低了缺血側大腦皮層NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白的表達，這表明ICA 能夠阻斷NLRP3 炎癥小體信號通路，抑制炎癥反應，改善大鼠神經功能缺陷，從而發揮卒中后的腦保護作用。 本實驗研究結果提示，腦缺血再灌注損傷時NLRP3 炎癥小體處于被激活狀態，ICA 能抑制NLRP3 炎癥小體的活化，這可能是其在腦缺血再灌注損傷中發揮神經功能保護的重要機制之一。

綜上所述，淫羊藿苷對腦缺血再灌注損傷導致的神經功能缺損癥狀可有效改善，同時還能減輕大腦皮層神經元病理性損傷，其機制可能與抑制缺血側大腦皮層中NLRP3 炎癥小體，發揮抗炎作用有關。 本實驗從神經炎癥切入，首次證實淫羊藿苷作用于NLRP3 炎癥小體這一新靶點，發揮抗腦缺血再灌注損傷。 需要指出的是，本研究僅初步探索其對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側大腦皮層NLRP3 炎癥小體的影響，作用機制仍有待進一步闡明。 因此，后續實驗將深入研究淫羊藿苷抗神經炎癥的機制，如淫羊藿苷調控SIRT1／NLRP3 信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注炎癥損傷的機制，觀察其對神經細胞焦亡、自噬的影響。