蠲痹方含藥血清對絕經后膝骨關節炎大鼠軟骨細胞自噬的影響及其作用機制

馬靖哲,康武林,姚彬,黃文博,李越,陳小林,李思聰,袁普衛

(1.陜西中醫藥大學附屬醫院,陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫藥大學藥學院,陜西 咸陽 712046)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種以關節軟骨退變、軟骨下骨改變、滑膜炎癥等為特征的慢性退行性疾病[1-3],主要表現為關節疼痛、僵硬和活動受限[4]。調查顯示,我國40歲以上人群中女性KOA的患病率明顯高于男性[5]。伴隨著雌激素水平的下降,女性KOA的發病率呈陡增趨勢[6]。骨關節炎的發病與炎癥及軟骨細胞外基質合成和降解的失衡密切相關[7-8]。軟骨細胞外基質代謝異?？蓪е玛P節軟骨細胞分解代謝加速[9]。自噬是維持細胞內環境穩定的重要過程,細胞可通過吞噬和降解功能失調的蛋白質與衰老受損的細胞器來維持自身的代謝需求[10]。軟骨細胞自噬功能異常與KOA的發生密切相關,通過激活細胞自噬可以抑制軟骨細胞的凋亡,延緩關節軟骨退變[11]。蠲痹膠囊為陜西中醫藥大學附屬醫院院內制劑,在臨床上用于KOA的治療取得了滿意的療效[12-13]。本團隊前期研究[14]證實,蠲痹膠囊治療KOA的作用機制可能與降低滑膜中炎癥因子的表達,抑制炎癥反應有關。但該藥對軟骨細胞的影響,尚缺乏相關研究。我們根據蠲痹膠囊的組方藥物制備蠲痹方含藥血清,觀察其對絕經后KOA大鼠軟骨細胞自噬的影響,并對其作用機制進行了探討,現總結報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

8周齡SD雌性大鼠25只,體質量(200±30)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004。實驗動物于陜西中醫藥大學動物實驗中心喂養,使用許可證號:SCXK(陜)2021-001。實驗室溫度18～25℃,相對濕度50%～80%,適應性飼養1周后開始實驗。本研究實驗方案經陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查通過,倫理批件號:SUCMDL20220621002。

1.2 實驗藥物

蠲痹膠囊藥物組成:熟地黃12 g、肉蓯蓉10 g、骨碎補15 g、淫羊藿15 g、白芍12 g、生黃芪30 g、當歸15 g、牛膝12 g、甘草片6 g。以上藥物由陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供。藥物加水浸泡30 min,文火煎煮2次,2次煎煮的藥液合并后,用100 ℃恒溫水浴將藥液加熱濃縮至每毫升含生藥1.0 g的蠲痹方藥物濃縮液,4 ℃保存備用。

1.3 實驗試劑

細胞計數試劑盒(cell counting kit,CCK)-8購自北京博奧森生物科技有限公司,Compound C購自上海皓元生物醫藥科技有限公司,Ⅱ型膠原蛋白抗體購自常州市祥泰生物技術有限公司,G蛋白耦聯受體30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)抗體購自美國Abcam公司,微管相關蛋白輕鏈3β(microtubule-associated protein light chain 3 beta,MAPLC3β)抗體、Beclin-1抗體、p62、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抗體、磷酸化AMP活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗體購自美國CST公司。

1.4 實驗儀器

生物安全柜、CO2培養箱(新加坡ESCO公司),倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司),全自動酶標儀(美國ELX808公司),電泳儀(美國BIO-RAD公司),微量移液器(德國Eppendorf公司),YP601N電子天平(哈爾濱眾匯衡器公司),3K15冷凍離心機(德國Sigma公司),Western Blot儀器(美國BIO-RAD公司),BG-gdsAUTO 710 MINI 發光成像儀(北京百晶生物公司)。

2 方 法

2.1 絕經后KOA動物模型建造

25只SD雌性大鼠,按照體質量由高至低排序,依次編號1～25。從隨機數字表中隨機選取1行隨機數字,連續抄錄25個隨機數字與大鼠編號依次對應,將抄錄的隨機數字由大到小排序(隨機數字相同則按照出現順序排序)。對隨機數字排序在前20位的大鼠,采用摘取卵巢及切斷內側副韌帶、前交叉韌帶,摘除內側半月板的方法[15]進行絕經后KOA造模,其余大鼠不做處理。

2.2 蠲痹方含藥血清制備

造模成功后,根據蠲痹膠囊成人口服劑量及成人和大鼠等效劑量公式[16]計算出大鼠用藥劑量,按上述隨機方法隨機選取15只模型大鼠進行蠲痹方藥物濃縮液(0.014 mL·g-1)灌胃,其余大鼠正常喂養。灌胃每日早晚各1次,連續7 d。末次給藥1 h后腹主動脈取血,采集血漿,4 ℃下靜置2 h后,于低溫離心機4 ℃、3500 r·min-1(離心半徑155 mm)離心 15 min。離心后轉移至超凈工作臺內取上清液。將離心好的血清用移液槍轉移到事先標記好的無菌離心管中,56 ℃水浴滅活30 min后用0.22 μm的濾膜過濾,移入無菌離心管中,置于-80 ℃冰箱內保存備用。

2.3 大鼠軟骨細胞提取

采用過量麻醉法處死大鼠,取下大鼠整個膝關節,分別進行軟骨細胞提取。將大鼠膝關節浸泡于75%乙醇中15 min后,轉移至生物安全柜中。用手術剪剔除皮毛,暴露并打開膝關節,剝離膝關節表面的透明軟骨層。將剝離的透明軟骨層置于15 mL無菌離心管中,加入胰蛋白酶,于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育30 min,然后用0.2%的Ⅱ型膠原酶消化 3 h,過200目濾網,1500 r·min-1(離心半徑155 mm)離心10 min。PBS緩沖液洗滌3次,收集細胞。模型大鼠和正常大鼠分別進行軟骨細胞提取。

2.4 蠲痹方含藥血清最佳作用濃度篩選

將模型大鼠軟骨細胞以5000個·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組及1.25%、2.5%、5%、10%、20%含藥血清組6組,每組設3個復孔。待細胞貼壁后,除模型組用新鮮DMEM完全培養基培養外,其余組分別加入相應體積分數的蠲痹方含藥血清進行干預。24 h后,參照CCK-8試劑盒說明,每孔避光加入CCK-8溶液10 μL,在培養箱內繼續孵育1 h后,用酶標儀檢測450 nm處的光密度。光密度值越高,細胞活力越強。

2.5 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細胞GPR30表達影響的檢測

將模型大鼠軟骨細胞以5000個·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組及1.25%、2.5%、5%、10%含藥血清組,并取正常大鼠軟骨細胞設為空白組,每組設3個復孔。除空白組和模型組用新鮮DMEM完全培養基培養外,其余組分別加入相應體積分數的蠲痹方含藥血清進行干預。24 h后,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參蛋白,用蛋白免疫印跡法檢測各組軟骨細胞GPR30的相對表達量。

2.6 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細胞自噬相關蛋白表達及AMPK/mTOR信號通路影響的檢測

將模型大鼠軟骨細胞以5000個·孔-1的濃度接種至96孔板,分為模型組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組、Compound C組,并取正常大鼠軟骨細胞設為空白組,每組每項實驗設3個復孔。除模型組和空白組用新鮮DMEM完全培養基培養外,含藥血清組、含藥血清+Compound C組、Compound C組分別加入10%蠲痹方含藥血清、10%蠲痹方含藥血清+Compound C及Compound C進行干預。24 h后,采用蛋白免疫印跡法,GAPDH為內參蛋白,檢測軟骨細胞中自噬相關蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的相對表達量;分別以AMPK、mTOR為內參蛋白檢測AMPK/mTOR信號通路相關蛋白p-AMPK、p-mTOR的相對表達量。

2.7 數據統計

采用SPSS26.0統計軟件處理數據。各組軟骨細胞細胞活力、GPR30、MAPLC3β、Beclin-1、p62、p-AMPK、p-mTOR相對表達量的組間總體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 動物模型鑒定結果

造模8周后,處死造模大鼠1只,見造模大鼠膝關節表面軟骨毛糙或缺損,關節間隙變窄,滑膜增生,絕經后KOA大鼠模型造模成功。

3.2 軟骨細胞鑒定結果

所提取的原代細胞,甲苯胺藍染色見細胞漿呈淺藍色,細胞核呈深藍色[圖1(1)];CollagenⅡ免疫熒光染色見細胞漿和細胞膜上有CollagenⅡ的特征性表達[圖1(2)];鑒定為軟骨細胞。

圖1 大鼠軟骨細胞染色圖片

3.3 蠲痹方含藥血清最佳作用濃度篩選結果

5組軟骨細胞細胞活力的組間總體比較,差異有統計學意義(表1)。5%、10%、20%含藥血清組細胞活力均高于1.25%、2.5%含藥血清組和模型組(LSD-t=6.767,P=0.003,LSD-t=7.666,P=0.002,LSD-t=5.091,P=0.007;LSD-t=5.080,P=0.007,LSD-t=6.690,P=0.003,LSD-t=3.433,P=0.027;LSD-t=7.590,P=0.002,LSD-t=8.200,P=0.001,LSD-t=6.031,P=0.004);1.25%、2.5%含藥血清組細胞活力與模型組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=1.182,P=0.303,LSD-t=1.785,P=0.187);10%含藥血清組細胞活力高于5%含藥血清組和20%含藥血清組(LSD-t=3.204,P=0.033,LSD-t=4.671,P=0.010)。

表1 不同濃度蠲痹方含藥血清干預后大鼠軟骨細胞活力

3.4 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細胞GPR30表達影響的檢測結果 各組大鼠軟骨細胞GPR30相對表達量組間總體比較,差異有統計學意義(表2、圖2)。模型組GPR30相對表達量低于空白組及5%、10%含藥血清組(LSD-t=5.695,P=0.005,LSD-t=5.400,P=0.006,LSD-t=9.006,P=0.001);模型組GPR30

表2 不同濃度蠲痹方含藥血清干預后大鼠軟骨細胞G蛋白耦聯受體30的相對表達量

GPR30為G蛋白耦聯受體30,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,①為空白組,②為模型組,③為1.25%含藥血清組,④為2.5%含藥血清組,⑤為5%含藥血清組,⑥為10%含藥血清組。

相對表達量與1.25%、2.5%含藥血清組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=0.776,P=0.481,LSD-t=1.585,P=0.170);5%、10%含藥血清組GPR30相對表達量均高于1.25%含藥血清組(LSD-t=2.782,P=0.049,LSD-t=4.473,P=0.011);10%含藥血清組GPR30相對表達量高于2.5%含藥血清組(LSD-t=4.544,P=0.011);5%含藥血清組GPR30相對表達量與2.5%含藥血清組比較,差異無統計學意義(LSD-t=2.521,P=0.065);5%、10%含藥血清組GPR30相對表達量與空白組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=2.274,P=0.085,LSD-t=0.997,P=0.375);5%含藥血清組GPR30相對表達量與10%含藥血清組比較,差異無統計學意義(LSD-t=2.578,P=0.062)。

3.5 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細胞自噬相關蛋白表達影響的檢測結果

各組軟骨細胞MAPLC3β、Beclin-1、p62相對表達量組間總體比較,差異均有統計學意義(表3、圖3)。

表3 5組大鼠軟骨細胞自噬相關蛋白的相對表達量

MAPLC3β為微管相關蛋白輕鏈3β,GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,①為空白組,②為模型組,③為含藥血清組,④為含藥血清+Compound C組,⑤為Compound C組。

p-AMPK為磷酸化AMP活化蛋白激酶,AMPK為AMP活化蛋白激酶,mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,p-mTOR為磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,①為空白組,②為模型組,③為含藥血清組,④為含藥血清+Compound C組,⑤為Compound C組。

模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組MAPLC3β相對表達量均低于空白組、含藥血清組(LSD-t=6.855,P=0.002,LSD-t=8.675,P=0.001;LSD-t=5.096,P=0.007,LSD-t=5.931,P=0.004;LSD-t=5.560,P=0.005,LSD-t=5.354,P=0.006);模型組、Compound C組MAPLC3β相對表達量均低于含藥血清+Compound C組(LSD-t=4.627,P=0.010,LSD-t=8.677,P=0.001);模型組MAPLC3β相對表達量與Compound C組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=2.605,P=0.060);含藥血清組MAPLC3β相對表達量與空白組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=1.677,P=0.169)。

模型組、Compound C組Beclin-1相對表達量低于空白組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組(LSD-t=12.912,P=0.000,LSD-t=7.401,P=0.002,LSD-t=5.360,P=0.006;LSD-t=2.950,P=0.042,LSD-t=5.484,P=0.005,LSD-t=3.903,P=0.018);含藥血清+Compound C組Beclin-1相對表達量低于空白組(LSD-t=26.840,P=0.000)。模型組Beclin-1相對表達量與Compound C組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=0.346,P=0.767);含藥血清組Beclin-1相對表達量與含藥血清+Compound C組、空白組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=4.648,P=0.358,LSD-t=1.032,P=0.361)。

含藥血清組、空白組p62相對表達量低于模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=3.925,P=0.017,LSD-t=3.985,P=0.019,LSD-t=0.016,P=0.001;LSD-t=3.149,P=0.035,LSD-t=5.094,P=0.007,LSD-t=8.740,P=0.001),含藥血清+Compound C組p62相對表達量低于Compound C組(LSD-t=3.455,P=0.026)。模型組p62相對表達量與含藥血清+Compound C組、Compound C組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=0.787,P=0.476,LSD-t=1.565,P=0.193);空白組p62相對表達量與含藥血清組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=1.972,P=0.120)。

3.6 蠲痹方含藥血清對大鼠軟骨細胞AMPK/mTOR信號通路影響的檢測結果

5組軟骨細胞p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR相對表達量組間總體比較,差異均有統計學意義(表4、圖4)。

表4 5組大鼠軟骨細胞AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的相對表達量

含藥血清組p-AMPK相對表達量高于模型組、Compound C組(LSD-t=3.623,P=0.022,LSD-t=6.537,P=0.003),空白組p-AMPK相對表達量高于模型組、含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=4.149,P=0.014,LSD-t=2.791,P=0.049,LSD-t=5.734,P=0.004);含藥血清+Compound C組p-AMPK相對表達量高于Compound C組(LSD-t=5.958,P=0.004)。模型組p-AMPK相對表達量與含藥血清+Compound C組、Compound C組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=2.739,P=0.052,LSD-t=2.774,P=0.050);含藥血清組p-AMPK相對表達量與空白組、含藥血清+Compound C組比較,組間差異均無統計學意義(LSD-t=2.055,P=0.109,LSD-t=1.236,P=0.284)。

空白組、含藥血清組、含藥血清+Compound C組p-mTOR相對表達量均低于模型組(LSD-t=8.722,P=0.001,LSD-t=8.849,P=0.001,LSD-t=5.558,P=0.005);含藥血清組、空白組p-mTOR相對表達量低于含藥血清+Compound C組、Compound C組(LSD-t=4.201,P=0.014,LSD-t=10.030,P=0.001;LSD-t=4.879,P=0.008,LSD-t=9.782,P=0.001);含藥血清+Compound C組p-mTOR相對表達量低于Compound C組(LSD-t=6.934,P=0.002)。模型組p-mTOR相對表達量與Compound C組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=1.476,P=0.214);含藥血清組p-mTOR相對表達量與空白組比較,組間差異無統計學意義(LSD-t=1.708,P=0.150)。

4 討 論

KOA屬中醫學“骨痹”“痹癥”的范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩?“女子七七,任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也?！苯^經后KOA的內因為肝腎虧虛、精血不足,外因為風寒濕邪外侵,多為本虛標實之證[17]。蠲痹膠囊的藥物組成由陜西省名老中醫李堪印教授的臨床經驗方加減而得,具有補腎益氣、舒筋通絡之功效[18]。本研究結果表明蠲痹方含藥血清可增強絕經后KOA大鼠軟骨細胞的活力,最佳作用濃度為10%。

GPR30是一種7次跨膜G蛋白耦聯雌激素受體,能介導快速細胞反應。成冬等[19]的研究表明,17β-雌二醇通過GPR30和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路保護ATDC5軟骨細胞免于線粒體自噬。本研究結果表明蠲痹方含藥血清可上調絕經后KOA大鼠軟骨細胞GPR30的表達,最低作用濃度為5%。

軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞類型,炎癥和氧化應激等病理因素可導致軟骨細胞過度凋亡、細胞密度降低和細胞外基質降解,從而加速骨關節炎的發展。因此,預防軟骨細胞過度凋亡可能是預防骨關節炎進展的有效方法[20]。細胞自噬是細胞內損壞的蛋白或細胞器經溶酶體降解成可循環利用的細胞成分的過程[21]。關節軟骨細胞處于特殊的低氧環境中,營養物質缺乏,細胞自噬對于維持軟骨細胞的生存和功能十分重要[22]。軟骨細胞自噬活性降低,清除自身衰老、受損的細胞器的能力下降,細胞穩態被打破,代謝失衡,可致細胞發生炎性反應,出現細胞損傷。Luo等[23]的研究表明,自噬在維持關節軟骨細胞的穩態中起著重要作用,軟骨細胞自噬能力增強,可增強其基質代謝活性,從而延緩KOA的進展。細胞中自噬相關蛋白MAPLC3β、Beclin-1、p62的表達量可反映細胞自噬情況[24]。軟骨細胞中MAPLC3β、Beclin-1的表達量上調,p62的表達量下調,說明細胞自噬能力增強。

AMPK是一種異源三聚體復合物,包含1個催化亞基α和2個調節亞基β和γ,每個亞基由2個或3個不同的基因編碼,導致不同AMPK復合物有12種不同的α/β/γ組合[25]。AMPK能感知能量穩態調節因子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的水平,當細胞ATP處于低水平時,AMPK可以通過調節代謝酶來對ATP與磷酸腺苷比率下降作出反應,以促進ATP的產生并抑制ATP的消耗[26]。當細胞能量較低時,α亞基中的Thr172被磷酸化,導致AMPK復合物的激活。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細胞自噬的過程中發揮著關鍵作用。mTOR有兩種蛋白質復合物亞基,即mTOR復合體1和mTOR復合體2[27]。mTOR復合體1受生長因子調節,并對不利于細胞生長的環境(如DNA損傷、缺氧、低ATP水平和氨基酸耗盡等)作出反應,可促進細胞中脂質和核苷酸的合成,并通過促進葡萄糖代謝促進細胞生長[28]。mTOR復合體2主要通過磷酸化和激活蛋白激酶B來調節細胞增殖[26]。此外,mTOR復合體2通過磷酸化AGC蛋白激酶家族成員來控制細胞生長和代謝[28]。AMPK是自噬激活因子,mTOR復合體1是主要的自噬抑制因子。當AMPK激活后,可阻斷mTOR信號通路的磷酸化,抑制細胞中mTOR的表達,增強AMPK和細胞自噬相關蛋白之間的相互作用,進而激活細胞自噬[29-30]。Li等[31]的研究表明,二甲雙胍通過以AMPK介導的方式抑制mTOR信號通路,誘導細胞自噬,從而延緩H2O2誘導的脂肪間充質干細胞衰老。本研究結果表明,蠲痹方含藥血清可上調絕經后KOA大鼠軟骨細胞中AMPK磷酸化水平,下調mTOR磷酸化水平,引入AMPK抑制劑Compound C干預后,發現Compound C抑制了絕經后KOA大鼠軟骨細胞的自噬并減弱了蠲痹方含藥血清的作用。

本研究結果表明,蠲痹方含藥血清作用于絕經后KOA大鼠軟骨細胞,可增加細胞活力,并通過上調MAPLC3β、Beclin-1的表達和抑制p62的表達增強細胞自噬能力;其作用機制可能與促進GPR30表達,上調AMPK磷酸化水平,下調mTOR磷酸化水平,激活GPR30和AMPK/mTOR信號通路有關。本研究分別提取了正常大鼠與絕經后KOA模型大鼠的膝關節軟骨細胞,由于未對2組大鼠軟骨細胞的形態及炎癥因子水平進行比較,不能確認所提取模型大鼠的軟骨細胞完全反映了絕經后KOA軟骨細胞的狀態,但經鑒定所提取的細胞均為軟骨細胞。未來的研究需要繼續完善實驗設計,進一步闡明蠲痹方含藥血清影響絕經后KOA大鼠軟骨細胞自噬的具體作用機制。