共培養條件下肌衛星細胞C2C12對軟骨細胞ATDC5活性的影響

陳澤華,王毅,申震,李俊毅,歐梁

(1.株洲市中醫傷科醫院,湖南 株洲 412007;2.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院,廣東 廣州 510095;3.昆明市中醫醫院,云南 昆明 650599;4.湖南省中醫藥研究院,湖南 長沙 410006)

肌衛星細胞是出生后肌肉組織中唯一一類具有分裂能力的肌肉源性干細胞,可通過激活、增殖和分化,參與肌肉再生、重塑和損傷修復[1]。肌衛星細胞在正常情況下保持靜止狀態,當骨骼肌受到損傷時,肌衛星細胞被激活并增殖,同時表達成肌調節因子,加速其成肌分化,形成新的肌細胞[2]。肌衛星細胞的數量和功能是維持成人骨骼肌質量和功能的關鍵。肌衛星細胞數量減少和增殖、分化的可塑性下降是導致骨骼肌萎縮的重要原因,同時肌衛星細胞數量減少也被認為是老年人骨骼肌衰減的重要原因[3-4]。研究表明,骨骼肌萎縮(包括肌纖維變細和纖維數量減少)與膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)的發生關系密切[5-7]。與健康人群相比,KOA患者股四頭肌中肌衛星細胞密度下降,肌纖維類型改變[8]。肌衛星細胞數量減少會阻礙骨骼肌的再生和修復,進一步加重骨骼肌萎縮。然而,骨骼肌萎縮狀態下肌衛星細胞增殖活力減弱,是否會影響軟骨細胞的活性,目前還不得而知。為此,本研究觀察了共培養條件下肌衛星細胞對軟骨細胞活性的影響,以期為探索肌肉萎縮與KOA之間的關系,以及通過改善肌肉萎縮治療KOA提供依據。

1 材料和儀器

C2C12小鼠成肌細胞、ATDC5小鼠成軟骨細胞系(上海中喬新舟生物科技有限公司),胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Gibco公司),DMEM高糖培養基(Hyclone公司),孔徑8 μm和0.4 μm 的24孔Transwell小室(Corning公司),CCK8試劑(Biosharp公司),地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業有限公司),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司),二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)活性氧熒光探針(北京索萊寶科技有限公司),Varioskan多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司),DMi8熒光顯微鏡(Leica公司)。

2 方 法

2.1 細胞傳代培養

C2C12細胞和ATDC5細胞均采用常規培養基(4 mL胎牛血清+400 μL青霉素-鏈霉素雙抗溶液+35.6 mLDMEM高糖培養基)在37 ℃、CO2體積分數5%的恒溫細胞培養箱中培養,隔天換液1次,當細胞融合度達到90%時按1∶3傳代。取第3代細胞進行后續實驗。

2.2 地塞米松對C2C12細胞活性影響的觀察

2.2.1地塞米松對C2C12細胞增殖的影響 取C2C12細胞,按照每孔5×103個接種至96孔板中,分為對照組和地塞米松組,每組設5個復孔,采用常規培養基培養(條件、方法同2.1)。待細胞融合度達到50%～60%時,對照組繼續以常規培養基培養,地塞米松組改用地塞米松培養基培養(50 μL地塞米松磷酸鈉注射液+48 mL常規培養基)。繼續培養24 h后,2組均改用檢測培養基培養(每孔90 μL常規培養基、10 μL CCK8試劑),設置空白孔,繼續培養1 h后采用酶標儀測定OD值(波長為460 nm)。細胞增殖率=(地塞米松組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

2.2.2地塞米松對C2C12細胞蛋白合成的影響 取C2C12細胞,按照每孔5×103個接種至6孔板中,分為對照組和地塞米松組,每組設3個復孔,采用常規培養基培養(條件、方法同2.1)。待融合度達到90%時,對照組繼續以常規培養基培養,地塞米松組改用地塞米松培養基培養。繼續培養24 h后,吸棄培養基,用PBS漂洗1遍,加入100 μL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),于冰上裂解5 min,刮下細胞轉移至1.5 mL EP管中,以12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑 6 cm)。吸取上清液,稀釋6倍,按照BCA試劑盒操作步驟,在酶標儀中測定OD值(波長562 nm)。根據標準品濃度計算公式計算樣品的測定濃度,測定濃度的6倍即為原液的蛋白含量。

2.2.3地塞米松對C2C12細胞修復能力的影響 取C2C12細胞,按照每孔1×105個接種至24孔板中,分為對照組和地塞米松組,每組設3個復孔,采用常規培養基培養(條件、方法同2.1)。待融合度達到90%時,用200 μL移液槍垂直劃一條直線,用PBS漂洗2次,去除劃下的細胞。對照組繼續以常規培養基培養,地塞米松組改用地塞米松培養基培養。24 h后拍照觀察,采用Image J軟件測量劃痕面積,計算細胞傷口修復率,修復率=(初始面積-24 h面積)/初始面積×100%。

2.2.4地塞米松對C2C12細胞遷移能力的影響 將孔徑為8 μm的Transwell小室置于24孔板中,采用不含胎牛血清的DMEM高糖培養基將C2C12細胞重懸,調整密度,接種至上層小室內(200 μL,約1×105個),分為對照組和地塞米松組,每組設5個復孔。對照組下層小室內加入600 μL常規培養基,地塞米松組下層小室內加入600 μL地塞米松培養基。分別于24 h和48 h后,吸棄下層小室的培養基,用4%多聚甲醛室溫固定15 min,PBS漂洗3遍,0.1%的結晶紫室溫染色10 min,再用PBS漂洗3遍,鏡下每孔隨機選取5個視野拍照,計算每個視野內的細胞數量。

2.3 與C2C12細胞共培養對ATDC5細胞活性影響的觀察

2.3.1與C2C12細胞共培養對ATDC5細胞增殖的影響 采用孔徑為0.4 μm的Transwell小室對C2C12細胞和ATDC5細胞進行共培養。分3組,每組設3個復孔。共培養組和預處理組上層小室內接種C2C12細胞(200 μL,約1×105個),分別以常規培養基和地塞米松培養基培養,培養24 h后棄去培養基,用PBS漂洗2次,然后將Transwell小室轉移至接種ATDC5細胞(600 μL,約2×105個)的培養孔中;對照組上層小室內為無細胞的常規培養基。上下層小室內細胞均以常規培養基繼續培養24 h后,采用CCK8法檢測各組下層小室內ATDC5細胞增殖率,方法同2.2.1。

2.3.2與C2C12細胞共培養對ATDC5細胞內活性氧含量的影響 細胞分組、培養方法同2.3.1。共培養24 h后,吸棄下層小室內的培養基,每孔加入400 μL現配制的DCFH-DA試劑(用PBS稀釋1000倍),避光培養30 min后置于熒光顯微鏡下觀察拍照,用 Image J軟件分析比較各組的熒光強度。

2.4 數據統計

采用SPSS25.0軟件進行數據統計分析。地塞米松組和對照組C2C12細胞增殖率、蛋白含量、傷口修復率、細胞遷移數量的組間比較均采用獨立樣本t檢驗;對照組、共培養組、預處理組ATDC5細胞增殖率、細胞內活性氧含量的總體比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 地塞米松干預后C2C12細胞增殖率和蛋白含量測定結果

地塞米松組C2C12細胞增殖率和蛋白含量均低于對照組[(78.402±5.401)%,(100.000±3.096)%,t=8.498,P=0.000;(5 080.367±296.657)μg·mL-1,(5 775.577±150.476)μg·mL-1,t=3.620,P=0.022]。

3.2 地塞米松干預后C2C12細胞傷口修復率測定結果

與對照組相比,地塞米松組C2C12細胞的修復能力下降(圖1)。地塞米松組C2C12細胞的24 h傷口修復率低于對照組[(53.173±1.800)%,(79.979±10.176)%,t=4.493,P=0.011]。

圖1 2組C2C12細胞24 h修復結果

3.3 地塞米松干預后C2C12細胞遷移數量測定結果

培養24 h和48 h時,地塞米松組C2C12細胞遷移數量均少于對照組[24 h:(24.200±5.630)個,(57.000±2.449)個,t=11.945,P=0.000;48 h:(57.600±8.820)個,(91.000±4.743)個,t=7.457,P=0.000]。見圖2。

圖2 2組C2C12細胞24 h和48 h遷移結果(結晶紫染色 ×400)

3.4 與C2C12細胞共培養條件下ATDC5細胞增殖率測定結果

3組ATDC5細胞增殖率比較,差異有統計學意義。對照組和共培養組ATDC5細胞增殖率均高于預處理組(P=0.037,P=0.006),共培養組ATDC5細胞增殖率高于對照組(P=0.001)。見表1。

表1 與C2C12細胞共培養條件下ATDC5細胞增殖率和細胞內活性氧含量

3.5 與C2C12細胞共培養條件下ATDC5細胞內活性氧含量測定結果

3組ATDC5細胞內活性氧含量比較,差異有統計學意義。預處理組ATDC5細胞內活性氧含量高于對照組和共培養組(P=0.001,P=0.000),對照組和共培養組ATDC5細胞內活性氧含量的差異無統計學意義(P=0.137)。見圖3、表1。

圖3 3組與C2C12細胞共培養的ATDC5細胞二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯活性氧熒光染色結果(×200)

4 討 論

肌衛星細胞的激活、增殖、分化對維持出生后骨骼肌結構與功能起著至關重要的作用。當肌衛星細胞數量減少時,骨骼肌的再生和修復能力下降,其生成和降解平衡遭到破壞,從而導致骨骼肌萎縮。骨骼肌中的肌動蛋白在分子水平上與軟骨及骨相互作用,與KOA的發病密切相關[9]。由此可見,“肌肉-軟骨”在細胞分子水平的交互作用可能是影響KOA發生、發展的重要原因。

本研究發現,地塞米松可抑制肌衛星細胞增殖和蛋白合成,并能抑制肌衛星細胞的修復和遷移?？梢?采用地塞米松對肌衛星細胞進行干預,可體外模擬肌萎縮條件下肌衛星細胞的生長狀態。地塞米松抑制肌衛星細胞增殖,也可能是其引起骨骼肌萎縮的重要原因。糖皮質激素對分解代謝有促進作用,可通過減少蛋白質合成和增加蛋白質降解,使肌纖維尺寸縮小、Ⅱ型纖維選擇性萎縮,誘導骨骼肌萎縮,并能引起骨骼肌內脂肪堆積,降低肌肉質量,促進肌少癥的發生[10]。地塞米松誘導的肌少癥與增齡性肌少癥都有肌肉量減少,肌力降低,肌纖維蛋白合成減少、分解加快,肌纖維再生能力消失等特點,二者在病理特點上具有較高的相似性,因此地塞米松常被用于肌少癥動物模型的構建[11]。同時,采用地塞米松對體外培養且分化成熟的成肌細胞進行干預,可使肌管橫徑減小,形成肌肉萎縮,這一方法被用于肌肉萎縮的體外細胞建模[12-13]。然而,也有研究發現,地塞米松可促進肌衛星細胞分化,增加肌管的橫徑和面積[14]。這可能與該研究中使用的地塞米松濃度較低(5～25 nmol·L-1)及干預時間點(肌衛星細胞分化前)不同有關。這說明地塞米松對肌衛星細胞活性的調節作用對藥物濃度和干預時間點具有依賴性。

為進一步研究“肌肉-軟骨”在細胞水平的相互作用對KOA的影響,本研究構建了肌衛星細胞-軟骨細胞共培養體系。研究結果發現,正常狀態下,肌衛星細胞與軟骨細胞間接共培養時,可促進軟骨細胞增殖,這可能與肌衛星細胞產生的代謝產物能影響軟骨細胞活性有關。國外研究表明,與肌細胞或肌細胞條件培養基共同培養的軟骨細胞對白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子α誘導的軟骨損傷的抵抗作用增強,且肌細胞釋放的細胞因子和生長因子可促進軟骨細胞生成胰島素樣生長因子1,調節軟骨發育[15];在肌細胞條件培養基中培養,能減輕炎癥誘導對人骨髓間充質干細胞來源的軟骨細胞的損傷[16]。此外,肌細胞和軟骨細胞共培養條件下,Ⅱ型和Ⅸ型膠原的表達也明顯增強[17]?？梢?正常狀態下,肌肉組織中的肌細胞和肌衛星細胞均可對軟骨細胞有正向調節作用。同時,本研究還發現,與正常肌細胞共培養的軟骨細胞中的活性氧含量明顯下降。這可能與肌衛星細胞可增強軟骨細胞對損傷的防御作用及減輕軟骨損害有關。當活力降低的肌衛星細胞與軟骨細胞共培養時,會明顯抑制軟骨細胞增殖,同時會明顯提高軟骨細胞中活性氧的水平,增加軟骨細胞氧化性損傷?？梢?骨骼肌萎縮狀態下肌衛星細胞活性降低,可通過“肌肉-軟骨”之間的細胞耦合作用加速軟骨退變,抑制軟骨細胞增殖,并加重其氧化性損傷,從而導致KOA的發生和發展。有研究發現,血管中骨骼肌中免疫細胞釋放的細胞因子能減輕關節軟骨損傷[18]。由此可見,肌肉組織中細胞產生的生物化學物質可隨血液流動至關節。通過調節肌肉萎縮可影響關節軟骨的合成與代謝,進而影響KOA的發病及病理進程。從本研究的結果來看,“肌肉-軟骨”之間可能存在細胞水平的耦合作用,正常狀態下肌細胞對軟骨細胞具有促增殖作用,維持肌肉的健康狀態對關節軟骨有保護作用;當肌肉發生萎縮時,肌衛星細胞活性下降,會降低軟骨細胞活力,加重軟骨細胞損傷。因此,防治骨骼肌萎縮對保護關節軟骨至關重要。

本研究的結果提示,地塞米松可抑制肌衛星細胞C2C12增殖,應用地塞米松干預肌衛星細胞C2C12可體外模擬肌肉萎縮條件下肌衛星細胞的生長狀態。正常狀態下,肌衛星細胞C2C12的代謝產物可促進軟骨細胞ATDC5增殖;肌衛星細胞C2C12活力降低,可抑制軟骨細胞ATDC5增殖,同時會增加軟骨細胞ATDC5氧化性損傷。