基于多重免疫組化技術探討股骨頭壞死愈膠囊治療激素性股骨頭壞死的作用機制

簡羿,馬茂瀟,郭珈宜,劉又文,岳辰

(1.湖南中醫藥大學研究生院,湖南 長沙 410208;2.河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院,河南 洛陽 471002)

股骨頭壞死是骨科臨床中常見的高致殘性疾病之一,創傷、酗酒及激素濫用等是引起股骨頭壞死的主要因素[1]。我國股骨頭壞死患者中約有1/4為激素濫用引起[2]。對于早期激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH)患者,如不能采取有效的干預措施,多數患者會在5年內發生股骨頭塌陷、壞死[3]。股骨頭壞死愈膠囊是平樂郭氏正骨治療“骨蝕”的經典方劑,具有補益肝腎、活血化瘀的作用。我們團隊前期研究發現,股骨頭壞死愈膠囊具有改善髖關節功能、減緩SONFH發病進程、降低股骨頸骨折內固定術后股骨頭壞死發生率的作用[4-5]。但股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH的作用機制尚不清楚。多重免疫組化(multiplex immunohistochemistry,mIHC)是一項先進的病理學檢測技術,在推演上下游信號通路、探索藥物作用機制方面具有一定的優勢[6]。目前,mIHC已被廣泛應用于腫瘤、心血管疾病、腸道疾病等的機制研究[7-9]。我們前期采用mIHC成功揭示了非創傷性股骨頭壞死巨噬細胞異常極化的相關機制[10]。為了探討股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH的作用機制,我們建立了SONFH大鼠模型,并采用mIHC進行了相關實驗研究,現總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

無特定病原SD大鼠100只,購自成都達碩實驗動物有限公司[生產許可SCXK(川)2020-0030]。實驗方案經河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)倫理委員會審查通過,倫理批件號:KY2021-007-01。

1.2 實驗藥物

股骨頭壞死愈膠囊[河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)院內制劑,批號:20200209;規格:每粒裝0.35 g]。

1.3 實驗試劑

甲潑尼龍、蘇木素(北京索萊寶科技有限公司),脂多糖(美國Sigma公司),10%中性福爾馬林[康迪斯化工(湖北)有限公司],Opal多色熒光免疫組化標記試劑盒(美國Akoya Biosciences公司),CD68、CD80、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子初次應答基因88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65抗體(美國Abcam公司),CD206抗體(美國Thermo公司)。

1.4 實驗儀器

HM 340E石蠟切片機、TLZ11攤片儀、ClearVue全自動封片儀(美國Thermo公司),BX51光學顯微鏡(日本Olympus公司),vivaCT40 Micro-CT(瑞士SCANCO Medical AG公司)。

2 方 法

2.1 分組方法

將100只大鼠稱重后按體質量排序編號,從隨機數字表中抄錄100個連續的2位數記錄在大鼠編號下方,將隨機數字除以4,余數為1的隨機數字對應的大鼠納入正常對照組,余數為2的隨機數字對應的大鼠納入模型組,余數為3的隨機數字對應的大鼠納入低劑量藥物治療組,整除的隨機數字對應的大鼠納入高劑量藥物治療組。若分配不均,則繼續抄錄隨機數字并采用余數法進行調整。

2.2 大鼠SONFH造模方法

大鼠適應性飼養1周后,將模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠采用改良的脂多糖聯合甲潑尼龍法建立SONFH模型[11]:按照10 μg·kg-1的劑量給SD大鼠肌肉注射脂多糖,共注射2次,2次間隔7 d,第2次注射脂多糖24 h后,按照25 mg·kg-1的劑量給SD大鼠肌肉注射甲潑尼龍,每日注射1次,連續注射3 d。

2.3 治療方法

造模結束后,低劑量藥物治療組按照0.33 g·kg-1的劑量給予股骨頭壞死愈膠囊溶液(將股骨頭壞死愈膠囊粉劑溶于水中)灌胃,高劑量藥物治療組按照 0.67 g·kg-1的劑量給予股骨頭壞死愈膠囊溶液灌胃,正常對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃2次,連續治療4周。藥物等效劑量均按照人體與SD大鼠的體表面積進行換算。

2.4 評價方法

2.4.1Micro-CT掃描分析大鼠股骨頭松質骨微結構 治療結束后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,分離大鼠雙側股骨,注意避免股骨頭軟骨損傷。將大鼠股骨固定于4%多聚甲醛中24 h后,再置于0.9%生理鹽水中浸泡24 h。采用vivaCT40 Micro-CT對大鼠股骨進行掃描,并進行三維重建。采用儀器自帶軟件分析股骨頭松質骨的骨微結構,并提取大鼠股骨頭松質骨的骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量(1 mm線段與骨小梁交點的個數)及骨小梁分離度(骨小梁之間的平均距離)等指標。

2.4.2組織切片染色觀察大鼠股骨頭組織病理學改變 將大鼠股骨浸入10%中性福爾馬林中浸泡固定48 h,常規脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片。取股骨頭組織切片,采用HE染色觀察股骨頭組織病理學改變,計算空骨陷窩率和骨壞死發生率:在200倍鏡下隨機選取10個視野,計算每個視野中骨小梁空骨陷窩數與骨小梁細胞數的比值,10個視野比值的平均值即為空骨陷窩率;當空骨陷窩率>50%,提示發生股骨頭壞死,任一側發生股骨頭壞死的大鼠數量與組內大鼠數量的比值即為骨壞死發生率。

2.4.3mIHC檢測巨噬細胞極化及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達 取股骨頭組織石蠟切片,脫蠟水化后,加入EDTA抗原修復液,于微波高火下修復抗原;加入抗原封閉液,室溫封閉10 min;加入CD206一抗(抗體稀釋比例為1∶200),4 ℃孵育過夜;PBS緩沖液漂洗后,加入Opal Polymer HRP抗鼠/兔通用型二抗,37 ℃孵育10min;PBS緩沖液避光漂洗后,加入Opal520試劑室溫顯色10 min。再次加入EDTA抗原修復液,于微波高火下修復抗原,按照上述步驟依次完成CD68(抗體稀釋比例為1∶200)、CD80(抗體稀釋比例為1∶100)、TLR4(抗體稀釋比例為1∶100)、MyD88(抗體稀釋比例為1∶100)、NF-κB P65(抗體稀釋比例為1∶200)的標記和顯色。完成所有蛋白的標記和顯色后,PBS緩沖液避光漂洗,滴加DAPI染料,避光孵育5 min;雙蒸水避光漂洗后,加入防淬滅劑后,封片。于熒光顯微鏡下觀察切片,采用Qupath 0.3.4軟件統計CD206、CD68、CD80、TLR4、MyD88、NF-κB P65的熒光強度,分析CD206、CD68、CD80、TLR4、MyD88、NF-κB P65的蛋白相對表達量,并計算M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞的占比。M1型巨噬細胞占比=CD80的相對熒光強度/CD68的相對熒光強度×100%,M2型巨噬細胞占比=CD206的相對熒光強度/CD68的相對熒光強度×100%。

2.5 數據統計

采用SPSS25.0統計軟件對所得數據進行統計學分析。骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量、骨小梁分離度、空骨陷窩率、M1型巨噬細胞占比、M2型巨噬細胞占比及TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量的組間比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗;骨壞死發生率的組間比較采用卡方檢驗,兩兩比較采用卡方分割法。檢驗水準α=0.05,卡方分割檢驗水準α’=0.012 5。

3 結 果

3.1 一般結果

模型組1只大鼠于造模后死亡,低劑量藥物治療組和高劑量藥物治療組分別有3只和2只大鼠在治療過程中死亡。正常對照組大鼠精神狀態良好、進食正常、毛發光澤無脫落,模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠在造模開始后第3天出現神情不振、進食減少、少量脫毛,1周后精神、進食等逐漸恢復。

3.2 大鼠股骨頭松質骨微結構Micro-CT掃描分析結果

大鼠股骨近端CT片顯示,正常對照組股骨頭松質骨的骨小梁呈多孔網架結構,排列規律,骨小梁數量、厚度正常;模型組骨小梁明顯減少、變細,稀疏,排列不規律;高劑量藥物治療組骨小梁較模型組增厚、變粗,致密,排列規律;低劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質骨微結構表現介于模型組與高劑量藥物治療組之間(圖1)。正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量、骨小梁分離度組間比較,差異均有統計學意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量均小于正常對照組(骨體積分數:P=0.000,P=0.000,P=0.000;骨小梁厚度:P=0.000,P=0.003,P=0.026;骨小梁數量:P=0.000,P=0.000,P=0.031),骨小梁分離度均大于正常對照組(P=0.000,P=0.001,P=0.036);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質骨骨體積分數、骨小梁厚度與模型組的差異均無統計學意義(P=0.052,P=0.071),骨小梁數量大于模型組(P=0.012),骨小梁離散度小于模型組(P=0.001);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質骨骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量大于模型組(P=0.001,P=0.011,P=0.000),骨小梁離散度小于模型組(P=0.001),骨體積分數、骨小梁厚度、骨小梁數量、骨小梁離散度與低劑量藥物治療組的差異均無統計學意義(P=0.146,P=0.414,P=0.086,P=0.146)。見表1。

表1 4組大鼠股骨頭松質骨微結構Micro-CT掃描分析結果

圖1 4組大鼠股骨近端CT片

3.3 大鼠股骨頭組織病理學觀察結果

HE染色結果顯示,正常對照組大鼠股骨頭骨小梁內無明顯空骨陷窩,細胞核正常;模型組、低劑量藥物治療組及高劑量藥物治療組大鼠股骨頭骨小梁內出現不同程度的空骨陷窩,細胞核變小、萎縮并移動到細胞邊緣,且以模型組最為明顯(圖2)。正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率、骨壞死發生率組間比較,差異均有統計學意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率、骨壞死發生率均高于正常對照組(空骨陷窩率:P=0.000,P=0.000,P=0.000;骨壞死發生率:P=0.000,P=0.000,P=0.000);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率低于模型組(P=0.000),骨壞死發生率與模型組的差異無統計學意義(P=0.054);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率和骨壞死發生率均低于模型組(P=0.000,P=0.000),空骨陷窩率低于低劑量藥物治療組(P=0.049),骨壞死發生率與低劑量藥物治療組的差異無統計學意義(P=0.556)。見表2。

表2 4組大鼠股骨頭空骨陷窩率和骨壞死發生率

圖2 4組大鼠股骨頭組織切片HE染色結果(×200)

3.4 巨噬細胞極化mIHC檢測結果

正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比組間比較,差異均有統計學意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比均高于正常對照組(M1型巨噬細胞占比:P=0.000,P=0.000,P=0.000;M2型巨噬細胞占比:P=0.000,P=0.000,P=0.000);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比與模型組的差異均無統計學意義(P=0.270,P=0.533);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比低于模型組(P=0.009),M2型巨噬細胞占比高于模型組(P=0.006);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比與低劑量藥物治療組的差異無統計學意義(P=0.131),M2型巨噬細胞占比高于低劑量藥物治療組(P=0.038)。見表3、圖3。

Merge表示融合圖片,DAPI為4,6-二脒基-2-苯基吲哚,TLR4為Toll樣受體4,MyD88為髓樣分化因子初次應答基因88,NF-κB p65為核因子-κB p65。

3.5 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達mIHC檢測結果

正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88、NF-κB p65的蛋白相對表達量組間比較,差異均有統計學意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均高于正常對照組(TLR4蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.028;MyD88蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.001;NF-κB p65蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.001);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88蛋白相對表達量與模型組的差異均無統計學意義(P=0.268,P=0.280),NF-κB p65蛋白相對表達量低于模型組(P=0.034);高劑量藥物治療組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均低于模型組和低劑量藥物治療組(TLR4蛋白相對表達量:P=0.002,P=0.040;MyD88蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.013;NF-κB p65蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.039)。見表4、圖3。

4 討 論

SONFH屬中醫學“骨蝕”“骨痿”“骨痹”范疇,其主要證候為腎虛、血瘀。因此,補腎活血是SONFH的主要治則。股骨頭壞死愈膠囊作為平樂郭氏正骨的經典方劑,臨床實踐顯示其治療SONFH效果顯著。該方由鹿茸、丹參、續斷、杜仲、黃芪、水蛭、雞血藤、玄參、連翹、乳香、沒藥共11味藥物組成。相關研究表明,杜仲的主要活性成分杜仲苷能夠有效抑制SONFH發病進程[12],丹參、川芎等活血類中藥的有效成分也被證實具有抑制炎癥反應的作用[13-14]。但股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH作用機制尚不清楚。

SONFH的發生與持續性慢性炎癥所導致的骨再生障礙密切相關,因而SONFH的炎癥反應機制也成為研究的重點[15]。相關研究發現,M1型巨噬細胞的過度激活是引起SONFH持續性慢性炎癥的主要原因[16-17],而M1型巨噬細胞不能向M2型巨噬細胞極化是導致SONFH微環境內持續慢性炎癥和組織破壞的關鍵,在股骨頭壞死的進程中起著至關重要的作用[18-20]。骨組織損傷后,骨細胞和骨髓細胞釋放的損傷相關模式分子將巨噬細胞招募到損傷區域,并將其極化為M1型巨噬細胞,進而促進炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6的分泌,啟動和維持炎癥反應,并導致骨修復和再生障礙[21]。而促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化,則能夠抑制SONFH慢性炎癥持續、減輕組織破壞,進而促進骨組織的再生與修復[22-23]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是調控炎癥反應的經典通路,在巨噬細胞的極化過程中發揮重要作用[24-25]。Adapala等[26]通過研究豬股骨頭壞死模型發現,在壞死骨組織引起巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化過程中,TLR4的表達量顯著增加,且引起了依賴MyD88途徑的下游信號的改變。Zhu等[27]研究發現,抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可以有效抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放,抑制炎癥反應,促進壞死骨組織內的骨形成,從而延緩SONFH進展。我們采用mIHC探討股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH作用機制,結果顯示,模型組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比、M2型巨噬細胞占比均顯著上升,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達上調;股骨頭壞死愈膠囊治療后能夠顯著抑制巨噬細胞向M1型極化、促進巨噬細胞向M2型極化,能夠抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的上調;且股骨頭壞死愈膠囊對巨噬細胞極化及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的影響具有一定的濃度依賴性。

本研究結果表明,股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH,能夠顯著改善股骨頭骨微結構、抑制骨壞死,其作用具有一定的劑量依賴性;其作用機制與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達及巨噬細胞極化有關。