九蒸九制對雞頭黃精理化性質及抗氧化性的影響

王俊楠，盧琪，薛淑靜，陳曉春，張春蘭，楊德*

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北武漢 430064）

（2.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300）

（3.恩施州源惠科技開發有限公司，湖北恩施 445000）

黃精為百合科植物，廣泛分布于南方熱帶外的地區，資源豐富。經研究發現黃精中含有多糖、總酚、黃酮、皂苷、木脂素、氨基酸等多種對人體有益的化學成分。中醫認為，黃精味甘、平，補氣益腎、耐寒暑、助筋骨，可作久服補養之品，并且無大補溫燥之品可能帶來的副作用?，F代藥理研究也證明，黃精具有抗自由基、延緩衰老、提高自身免疫力、改善記憶力、降血糖、降血脂、防止動脈粥樣硬化等功效[1,2]，在保健食品中被廣泛應用[3]，具有廣闊的市場前景。生黃精具有麻舌感、咽喉刺激性，不宜直接食用，通過炮制可消除其原有刺激性和致敏性，減輕其毒副作用，使有效成分積累，增強藥效[4,5]。黃精炮制方法眾多，有單蒸、酒制、九蒸九制、重蒸、發酵等，主要以“九蒸九制”為代表，這些炮制方法對黃精有效成分均有一定影響，但對炮制過程中功效成分變化的研究較少。

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學之后又一重要研究方向，可對生物體或細胞中的所有小分子量代謝物進行定量、定性的分析研究?？梢岳么x組技術迅速獲取生物體代謝組信息，并對樣本進行分類，在食品加工理化特性方面應用廣泛。利用非靶代謝組對黃精細胞內外的全部代謝物進行了定性和半定量的研究，得到了其體內和體外的全部代謝物的信息。

本文采用常壓蒸制結合熱泵干燥法進行炮制，并探究隨著蒸制次數增加其黃精中有效成分含量變化規律，并利用非靶向代謝組學的方法及高效液相色譜串聯質譜技術，檢測分析始末蒸次黃精代謝物組分及變化規律，為深入挖掘黃精功能成分及藥理作用機制，提高黃精利用率和開發功能性黃精產品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：取自四年生雞頭黃精塊莖；果糖、葡萄糖、蔗糖、Vc、蘆?。藴势罚?8%），上海源葉生物科技有限公司；ABTS+· 試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Folin-Ciocalteu 試劑、2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)、1,3,5-三(2-吡啶基)-2.4.6-三嗪(TPTZ)，上海源葉生物科技有限公司；DNS試劑，索萊寶生物科技有限公司；香草醛、冰醋酸、碳酸鈉、鹽酸、高氯酸、濃硫酸、無水乙醇、福林酚、六水合三氯化鐵等均分析純試劑，國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan GO 酶標儀，美國Thermo Fisher 公司；XHF-DY 高速均質機，寧波新芝生物科技有限公司；KQ5200DE 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；CR-400 色差儀，日本Minolta Camera公司；LC-20AT 高效液相色譜儀，日本島津公司；DHG-9140 熱泵干燥機，上海一恒科學儀器有限公司；Thermo Vanquish UHPLC 超高效液相色譜儀、Q-Exactive HF 高分辨質譜，美國Thermo Fisher 公司；Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1 mm×100 mm）色譜柱，Agilent technologies 公司；TGL-16M 離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；JXFSTPRP-48 全自動樣品快速研磨儀,上海凈信實業發展有限公司；FD-IA-50 冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；NMI20-025V-1 核磁共振成像儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備及感官評價

選取品質良好、無霉變的雞頭黃精生品，洗凈、去除根須，100 ℃常壓蒸制2 h 后于60 ℃熱泵干燥機中干燥使其水分含量達到20%左右，即得一蒸一制黃精，如此反復九次即得九蒸九制次黃精樣品，記錄并描述其感官特征[6]。

1.3.2 色度分析

將制得的黃精樣品用多功能粉碎機粉碎，過40目篩，備用。色差儀[7]測定黃精粉條件：光源D65，口徑30 mm，標準觀察角10°，使用前用黑白比色板校準，取一定量樣品平鋪于培養皿進行測定，記錄L*（顏色亮度）、a*（紅綠色值）、b*（黃藍色值）相應值，測量5 次，取其平均值，計算總色差值E*ab。

1.3.3 水分形態

將九蒸九制后的黃精切成長寬1 cm 左右的厚片，采用低場核磁共振成像儀對黃精樣品中水分形態進行分析，CPMG 序列參數如下：SW（kHz）=100，SF（MHz）=20，P1（us）=8.00，P2（us）=15.52，DRG1=3，PRG=1，TW（ms）=1 500.000，TE（ms）=0.300，NECH=5 000，NS=4，重復三次掃描，弛豫時間范圍為0.001～10 000 ms，反演個數=200，迭代次數=1 000 000，根據弛豫時間（T2）和振幅面積（S）進行分析。

1.3.4 還原糖含量測定

參照吳豐鵬等[8]的方法制備黃精還原糖、多糖待測液。配置葡萄糖標準溶液（1.00 mg/mL），參考文獻[9]的方法測定，得線性回歸方程為：Y=2.519X-0.041 6（R2=0.999 3），在0.1～0.6 mg/mL范圍內線性關系關系良好。

1.3.5 多糖含量測定

配置葡萄糖標準溶液（1.00 mg/mL），參照潘東梅[10]方法測定，得標準曲線為：Y=3.459 1X+0.033 3（R2=0.998 8），在0.0～0.7 mg/mL 范圍內線性關系關系良好。

1.3.6 單糖組分分析

1.3.6.1 色譜條件

色譜柱：Shodex NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm），保護柱：NH2P-50G 4A（4.6 mm×10 mm），流動相為水（A 相）和乙腈（B 相），A:B=25:75，流速：0.8 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量5 μL，ELSD 參數：霧化管溫度=40 ℃，載氣流速=2.5 L/min。

1.3.6.2 標準溶液的配制

精密稱取D-果糖、D-葡萄糖、D-蔗糖標準品用超純水定容于2 mL 容量瓶中，得混合標準溶液（果糖2.0 mg/mL、葡萄糖2.5 mg/mL、蔗糖2.4 mg/mL）。

1.3.6.3 供試樣品的制備

精密稱取0.1 g 黃精粉，加2 mL 超純水，渦旋混勻后用細胞破碎機8 000 r/min，破碎1 min，離心，取上清液，經0.45 μm 微孔水相濾膜過濾，作為黃精粉中單糖待測液。

1.3.7 水提液pH值測定

參照徐明鋒等[1]的方法略作修改，取九蒸九制后的黃精粉0.5 g，加12.5 mL 蒸餾水，沸水浴回流2.5 h，冷卻至室溫，抽濾，補足所失水分，測定各個水提液pH 值，重復測定三次，取其平均值。

1.3.8 總酚含量（TPC）測定

總酚含量的測定采用Folin-Ciocalten 法[11]，樣品總酚含量以每克干樣品中沒食子酸毫克數表示（mg GAE/g DW）。所得標準曲線：Y=0.007 9X+0.075 9（R2=0.999 1），在10～200 mg/L范圍內線性關系良好。

1.3.9 總黃酮含量（TFC）測定

參照文獻[12]的最優方案，并略作修改。稱取一定量的黃精粉末，加入20 倍體積的φ=80%乙醇溶液，于70 ℃下超聲1 h，提取2 次，合并濾液。按照文獻[10]的測定方法進行黃酮含量的測定并計算含量，得標準曲線Y=0.864 3X+0.002 7（R2=0.998 3）。

1.3.10 抗氧化性研究

ABTS 自由基清除能力參照試劑盒說明書進行操作[13-15]，樣品抗氧化能力（Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity，TEAC）來表示，結果表示為mmol/L。所得標準曲線：Y=0.779 3X-0.003 5（R2=0.999 5），在0.15～1.5 mmol/L 濃度范圍內線性關系良好。

DPPH 自由基清除能力測定參照王若男等[16]的方法測定。

FRAP 鐵離子還原/ 抗氧化能力測定參照Tang 等[17]和Wang 等[18]的方法，略作修改，結果用Vc 標品濃度（mmol/L）定義FRAP 值。得線性回歸方程為：Y=0.002 8X+0.261（R2=0.999 1），在0.12～0.6 mmol/L 濃度范圍內線性關系關系良好。

1.3.11 色譜-質譜分析

1.3.11.1 樣品提取

分別稱取一制（對照）和九制（九蒸）的樣品100 mg 置于2 mL 離心管中加入1.0 mLφ=70%甲醇和3 mm 規格鋼珠，用全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-48，70 Hz）震蕩破碎3 min，冷卻后低溫超聲（40 kHZ）10 min。4 ℃低溫下12 000 r/min離心10 min，取上層清液稀釋2～100 倍，過0.22 μm PTFE 濾頭上機檢測。

1.3.11.2 色譜-質譜分析條件

色譜柱：C18 色譜柱（Zorbax Eclipse C18 ，1.8 μm×2.1 mm×100 mm），流動相組成為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），流動相洗脫程序：0～2 min，5% B；2～7 min，30% B；7～14 min，78%B；14～20 min，95% B；20～ 25 min，5% B，柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL，自動進樣器溫度4 ℃。

正、負模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。

1.3.12 數據統計分析

2 結果與討論

2.1 感官評價

由圖1 可以看出，黃精在九蒸九制過程中色澤逐漸變深，并且伴有一定的焦香、香甜味。麻舌感逐漸降低，苦味上升，質地變軟，內部孔隙逐漸變大。表1 從色澤、氣味、口感和組織狀態對黃精蒸制過程中的變化進行記錄，發現蒸制5～6 次黃精開始無麻口，口感微甜，蒸制6 次后焦糊味和苦味增強?！秾嵱弥兴幣谥茖W》中也曾提到黃精蒸制終點“蒸至藥物黑透或蒸至藥物質地變軟”[19]，并沒有對黃精蒸制次數的要求，因此建議黃精炮制6 次即可。

表1 1～9 次蒸制黃精感官性狀描述Table 1 Sensory characteristics of Polygonatum steamed for 1～9 times

圖1 1～9 蒸制黃精Fig.1 Polygonatums steamed for 1～9 times

2.2 色澤變化

實驗測得1～9 蒸次黃精的a*（紅綠值）、b*（黃藍值）、L*（顏色亮度）及E*ab（總色差值）見表2。從測定結果可以看出，隨著蒸制次數的增加，a*從一制到七制逐漸增加，八九制略有下降，呈顯著上升趨勢（P＜0.05）與蒸制過程中樣品顏色由淡黃色轉變為黑褐色外觀變化基本保持一致。L*整體呈現遞減趨勢，從一制49.67 到九制10.97，四制和七制明度值相較于前一制有所提高分別為40.12 和28.61，從二制開始各個蒸制品的明度有明顯差異，呈顯著下降趨勢（P＜0.05）?？偵钣兄黠@的差異，總體大小的趨勢逐漸降低（P＜0.05）。蒸制次數對黃精a*、b*、L*及E*ab 值均有顯著性差異（P＜0.05）。黃精顏色隨著蒸制時間的增加逐漸加深，可能與炮制過程中美拉德反應有關，致使黃精內部類黑精含量增加，該結論與Jin 等[20]研究結果相似。

表2 1～9次蒸制黃精色度值Table 2 The chroma value of Polygonatum for 1～9 times

2.3 水分形態分析

核磁中弛豫時間（T2）反映了樣品內氫質子的約束力和自由度，與食品中的自由水含量有著密切關系，即弛豫時間越長，水分活度越高，自由水含量也隨之增加[21,22]。如圖2 所示，經多次蒸制后弛豫時間（T2）向左偏移，表明蒸制后黃精水分自由度降低；并且隨著蒸制次數的增加，黃精橫向弛豫時間縮短，信號振幅也顯著性降低，說明在干燥初期黃精中游離水流動性較大，大分子物質束縛作用較低，弛豫時間較長，后期蒸制次數增加，水流動性降低，黃精中水分子與蛋白質、多糖等結合，使其弛豫時間縮短。表明隨著蒸制次數的增加，黃精樣品中水分活度和含量顯著降低，這種變化可能和蒸制過程中大分子變化有關，這與李芷芊等[23]研究的微波干燥過程中黃精切片水態和組織結構變化結論一致。

圖2 1～9 次蒸制黃精水態分析Fig.2 Water status of Polygonatum for 1～9 times

2.4 還原糖含量變化

如圖3 所示，隨著蒸制次數的增加，還原糖含量總體呈現遞增趨勢，還原糖含量由1.99%增加到28.69%，還原糖含量增加了約14 倍，可能是由于黃精經炮制后黏多糖大量水解成低聚糖、單糖。馬靈珍等[24]也研究發現熟地黃還原糖含量隨著蒸制次數增加呈波動式上升，與本研究得到的結果類似。因此還原糖可以作為黃精質量控制指標之一。

圖3 1～9 制黃精還原糖含量變化Fig.3 Reducing sugar content changes of Polygonatum steamed for 1～9 times

2.5 多糖含量變化

如圖4 所示，多糖的含量隨蒸制次數的增加而降低，三制后多糖的含量趨于穩定，從六制到九制中間有所起落。多糖含量增加可能是由于黃精經多次蒸制后質量下降，且黃精多糖分子中含有大量羥基，分子間相互作用形成不同程度聚集體，進而導致多糖含量增加。多糖含量的逐漸遞減是由于在蒸制過程中黃精處于高溫高濕狀態下，使其水解成單糖和低聚糖，這與吳豐鵬等[8]和陳瑞瑞等[10]對九蒸九制多糖含量變化研究結果一致。且部分糖類成分隨著蒸制溶于水中，造成一定量損失。單佳樂[25]研究表明在蒸制過程中黃精多糖不僅發生降解還有聚集。

圖4 1～9 制黃精多糖含量變化Fig.4 Polysaccharide content Changes of Polygonatum steamed for 1～9 times

2.6 單糖分析

2.6.1 線性回歸方程和相關系數

吸取5、10、15、20 μL 混合標準品，分別進樣分析，得到以峰面積對數（Y）為縱坐標，進樣質量對數（X）為橫坐標的線性回歸方程（表3），色譜圖見圖5。

表3 4 種單糖線性回歸方程、相關系數和線性范圍Table 3 Regression equation，correlation coefficient and linear range for four monosaccharides

圖5 混合標準溶液的HPLC-ELSD 分離色譜圖Fig.5 HPLC-ELSD separation chromatogram of mixed standard solution

2.6.2 樣品含量檢測

取待測樣液5 μL，重復測定2 次，按照1.3.6.1色譜條件測定并記錄相應峰面積，代入標準回歸方程得出各種糖含量，結果見表4，色譜圖見圖6。

表4 1～9制水溶性糖分析結果Table 4 Analysis results of 1～9 water-soluble sugars (n=2, mg/g)

圖6 1～9 制黃精HPLC-ELSD 分離色譜圖Fig.6 HPLC-ELSD separation chromatogram of Polygonatum for 1～9times

在蒸制過程中，隨著蒸制次數增加，果糖含量逐漸增加，在七制時達到峰值247.72 mg/g，隨后果糖含量小幅度起伏，黃精中葡萄糖含量大體呈現逐步遞增趨勢，在四制時有小幅度下降約為0.12 mg/g，此現象說明在高溫條件下，黃精細胞壁遭到破壞，使其糖類物質釋放。并且隨著時間延長，黃精中的多糖組分經過水解，變成果糖、葡萄糖等一系列的單糖。果糖和葡萄糖含量在蒸制過程中出現小幅度下降可能是由于單糖成分與氨基酸類成分發生美拉德反應所導致[26]，使其發生異構化和降解，吳豐鵬等[8]也研究時發現葡萄糖含量在前兩次蒸制出現降低，但隨著蒸制次數的增加其含量也逐步提高,與本實驗結果相似。另外黃精中蔗糖含量隨著蒸制次數的增加呈現先增大后降低的趨勢[25]。詹慧慧等[27]也在對黃精、滇黃精和多花黃精中游離糖含量測定動態中發現黃精在炆制不同時間后發現蔗糖含量也出現先增加后降低的現象，表明蔗糖含量因水解作用降低，而作為水解產物的葡萄糖和果糖含量隨之增大。

2.7 水提液pH值變化

如圖7 所示，隨著蒸制次數的增加，黃精水提液pH 值不斷減小，從一制的5.26 到九制4.07，在八制時水提液pH 值達到最低值4.03。研究表明美拉德反應過程中pH 值的大小與堿性氨基酸含量及甲酸、乙酸等有關[28,29]。

圖7 1～9 次蒸制黃精水提液pH 值Fig.7 pH value of extract of Polygonatum steamed for 1～9 times

2.8 總酚含量變化

如圖8 所示，隨著蒸制次數的增加，總酚提取量呈波動式上升。在第八次蒸制后總酚含量達到最大為12.16 mg/g，九制達到10.02 mg/g，其中在第七次和第九次蒸制后總酚提取量較前一次有小幅度的降低，但總體上仍呈現上升趨勢。這是因為在熱處理工藝中，某些細胞成分和細胞壁組分發生，或通過高溫作用而降解，從而加速了游離態多酚的釋放。李芷芊等[23]研究表明，適當的提高蒸制時間并對樣品進行熱風干燥處理有利于提高黃精切片中多酚含量的結果一致。張忠義等[30]研究表明大蒜經蒸汽熱處理后會提高TPC 含量。

圖8 1～9 次蒸制黃精總酚含量Fig.8 Total phenolic content of Polygonatum steamed for 1～9 times

2.9 黃酮含量變化

如圖9 所示，隨著蒸制次數的增加，黃酮含量呈現波動式增長，變化范圍為0.10%～0.82%，在第八制時達到最大含量0.82%?？赡苁怯捎诟邷貤l件下，黃精細胞壁被破壞，使內部黃酮類物質溶解釋放。郭旭琴[31]研究表明溫度調節因子是影響黃酮類化合物合成的首要因子，且與樣品處理時間有很大關系。

圖9 1～9 次蒸制黃精黃酮含量Fig.9 Flavonid content of Polygonatum steamed for 1～9 times

2.10 抗氧化性與總酚、黃酮等的相關性分析

ABTS 在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+，并能在一定程度上抑制其生成。如圖10a所示，蒸制次數越多，清除ABTS+的能力越強，總抗氧化能力范圍在0.38～0.73 mmol/L。從一制到五制樣品總抗氧化能力呈跨越式增長，五制之后總抗氧化能力趨于平緩，小幅度增長，在七制時抗氧化能力最強為0.73 mmol/L。

圖10 1～9 次蒸制黃精抗氧化活性Fig.10 Antioxidant activity of Polygonatum steamed for 1～9 times

DPPH 自由基與抗氧化劑發生反應，使其被還原成非自由基，可以通過吸光度變化范圍來定量[32]。如圖10b 所示，不同蒸制次數均有清除DPPH 自由基的作用，且清除效率呈現顯著性量效關系，即隨著蒸制次數的增加，對DPPH 自由基清除的能力越強，清除率變化范圍在31.03%～81.95%，在八制時清除率達到最大為81.95%。

FRAP 體現了抗氧化劑的還原性，利用單電子轉移（SET）的原理[33]。如圖10c 所示，經不同蒸制次數處理得到的黃精樣品FRAP 值，蒸制次數大體上與FRAP 值呈現正相關關系，FRAP 結果變化范圍為0.25～1.97 mmol/L，在第七制時相較于前一制略有下降達到1.18 mmol/L，在第八制時達到最大值為1.97 mmol/L。

綜上可以看出隨著蒸制次數的增加，黃精中總酚與總黃酮含量成正相關，且其含量與抗氧化能力也呈正比，在Tang 等[17]和Wang 等[18]的研究中結論相似 。此外，已有研究顯示，有研究表明黃精經過炮制后得到的類黑精成分具有較好的抗氧化性、抗自由基、補腎健脾的功效[34]。

2.11 色譜-質譜分析

2.11.1 代謝物定量分析

2.11.1.1 QC 樣本TIC 總離子流圖重疊分析

使用Compound Discoverer 3.3 進行保留時間校正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等，并通過Thermo mzCloud 在線數據庫，Thermo mzValut 當地數據庫，Chem Spider 數據庫等來完成樣品的鑒別對待測樣品進行定量分析得出在正離子模式下共檢測到1 310 種代謝物；在負離子模式下共檢測到1 841 種代謝物。

質控樣本（QC）是將樣本提取物混合配制，以保證樣品在同一工藝條件下的重現性，混樣質控QC 樣本的總離子流圖（Total Ions Current，TIC），橫坐標為代謝物檢測的保留時間（Retention Time，Rt），縱坐標為離子檢測的離子流強度。圖11 依次為正、負離子模式下的質控樣本TIC 重疊圖。發現不同時間下的QC 樣本TIC 重疊效果比較好，說明機器的穩定性比較好。

圖11 質控樣本TIC 重疊圖Fig.11 TIC overlap chart of QC samples

2.11.1.2 主成分分析（PCA）

通過觀察質控樣本間的離散度，可以得知儀器分析的穩定性和可靠性，所有樣本的主成分分析結果如圖12 所示，分別為黃精一制樣品與九制樣品正、負離子模式下PCA 分析圖，累計R2X ＞0.5，說明PCA 模型擬合效果好，可用于數據主成分分析。質控樣本QC 組數據點較為集中，所有樣品數據點均處于95%置信區內，一制樣品與九制樣品完全分離，差異性明顯，且每組樣品組內差異性小，說明儀器和方法穩定性和準確性較好。

2.11.2 多元統計分析

2.11.2.1 差異代謝物篩選

采取將差異倍數（Fold Change）和P值相結合的方法來篩選差異代謝物。代謝物在對照組和實驗組中差異為2 倍以上或0.5 以下，則認為差異顯著；VIP 值表示對應代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度。在上述的基礎上，使用t-Test 假設檢驗選取P-value≤0.05，表示顯著性差異。

利用火山圖（Volcano Plot），可以迅速查看兩組代謝物的表達水平和差異的統計學意義，從而更好地篩選出不同的代謝物。

火山圖中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化，縱坐標表示student’st檢驗的P-value，散點大小代表OPLS-DA 模型的VIP值，散點越大VIP 值越大，所篩選出的差異表達代謝物也就更可信。圖13 中綠色、紅色、黑色點分別代表下調差異表達代謝物、上調差異表達代謝物和差異不顯著的代謝物[35]。

篩選得到差異代謝產物如下表5、表6 所示，在正離子模式下共有176 個顯著差異代謝物，其中有5 個上調表達代謝物，分別為苯及其取代衍生物（1）、吡咯烷（1）、羧酸及其衍生物（2）、其它類（1），171 個下調表達代謝物主要有羧酸及其衍生物（44）、吡啶及其衍生物（9）、苯及其取代衍生物（8）、有機氮化合物（8）、吲哚及其衍生物（6）、有機氧化合物（5）、其它類（45）等。負離子模式下共有148 個顯著差異代謝物，其中有15個上調表達代謝物，羧酸及其衍生物（4）、苯及其取代衍生物（2）、有機氧化合物（2）、脂肪酰類（1）、黃酮類化合物（1）、吡咯烷（1）、其它類（4），133 個下調表達代謝物主要有羧酸及其衍生物（19）、有機氧化合物（12）、苯及其取代衍生物（7）、脂肪酰類（5）、甘油磷脂（3）、吡啶及其衍生物（2）、黃酮類化合物（2）、擬肽類（2）、咪唑嘧啶類（2）、肉桂酸及其衍生物（2）、其它類（63）等。

表5 正離子模式下差異代謝產物統計表Table 5 Statistical table of metabolite quantity in positive ion mode

表6 負離子模式下差異代謝產物統計表Table 6 Statistical table of metabolite quantity in negative ion mode

表7 組間差異代謝物數量統計表Table 7 Statistical table of metabolite quantity between groups

2.11.2.2 聚類熱圖分析

聚類分析（Cluster Analysis）是對樣品或指標進行分類的一種多元統計分析方法，通常能簡單、直觀的觀察數據特征[36,37]。圖14 中右側區域代表表達量較高的差異代謝物，左側區域代表表達量較低的差異代謝物，通過進一步篩選對兩組樣本進行聚類分析，由圖14 所示對照組樣品主要集中在右側高表達區域，九制樣品主要集中在左側低表達區域，即對照組樣品中差異代謝物含量遠遠高于九制樣品。

圖14 差異代謝物聚類熱圖Fig.14 The clustering heat map of differential metabolities

2.11.3 代謝通路分析

2.11.3.1 差異代謝物KEGG 功能注釋

利用KEGG 數據庫對差異代謝物進行注釋，部分結果如表8 所示。

表8 樣本差異代謝物KEGG功能注釋正離子模式統計表Table 8 Statistical table of KEGG pathway informtion of sample in positive ion mode

2.11.3.2 差異代謝物富集分析

根據注釋結果，利用Metabo Analyst R 進行KEGG 通路富集[38,39]，結果展示如下：其中正離子模式下差異代謝物共有29 條通路（表8），在篩選出來的176 個顯著差異代謝物中被KEGG 注釋到的有75個，且全部顯著下調，主要分布在30 條代謝途徑中（圖15a）。負離子模式下差異代謝物共有25 條通路（表9），在篩選出來的148 個顯著差異代謝物中被KEGG 注釋到的有44 個，其中43 個顯著下調，1 個顯著上調（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成：預酪氨酸），主要分布在26 條代謝途徑中（圖15b）。圖中Fold enrichment 值越大表示富集程度越大，P-value 值其越接近于0，表示富集越顯著，圖中點的大小代表富集到相應通路上的差異顯著代謝物個數。

圖15 樣本差異代謝物KEGG 富集圖Fig.15 KEGG enrichment analysis of differentially expressed metabolites sample

3 結論

結果表明隨著蒸制次數增加，黃精外觀顏色由淺黃色轉變為黑褐色，質地柔韌，麻舌感逐漸消失，多糖含量減少，還原糖、總酚、黃酮等成分富集含量增加，抗氧化活性增強，多糖分子量發生變化，改變單糖組成比例，果糖、葡萄糖含量逐漸增加，蔗糖水解，經過九次蒸制后黃精水提液呈現弱酸性pH 值由5.26 下降到4.03。這可能是由于高溫高濕條件下，發生Maillard 和焦糖化反應，引起糖的異構化和降解，使其在炮制過程中多糖和還原糖發生轉化分解作用，產生的甲酸和乙酸等物質使水提液酸性增強，且該反應涉及羰基化合物和氨基化合物間反應，對黃精色澤和風味產生決定性作用。

采用LF-NMR 分析黃精水分遷移狀況，蒸制后的黃精水分形態主要以結合水形式存在，以氫鍵形式與蛋白質分子緊密結合，蒸制時間越長水分與大分子物質結合越緊密，并于6、7 制時水分相態趨于穩定，選取一制和九制黃精進行全面代謝組學分析，結果發現，用PCA 和OPLS-DA 均可顯著區分兩組樣品差異性。篩選其差異代謝物發現苯及其取代衍生物、吡啶及其衍生物、羧酸及其衍生物、有機氮化合物、有機氧化合物、脂肪酰類等物質差異性較為顯著，為黃精活性成分的篩選與品質評價奠定了基礎。

根據黃精蒸制色澤、風味、水分含量、還原糖等指標發現雞頭黃精蒸制次數達到第7 次即可達到最佳，由于炮制方法不同，對黃精最佳蒸次也不盡相同。本文針對湖北四年生雞頭黃精進行代謝組學分析，對其他不同產地、品種、生長年限黃精蒸制前后差異代謝物是否不同及其炮制過程中有效成分含量的變化與其功效性是否存在相關性有待實驗驗證。本研究對雞頭黃精進行炮制處理，為黃精最佳功效蒸制次數提供新思路，為研究雞頭黃精炮制工藝、作用機制具有參考性意義。