基于VEGF/PI3K/AKT 通路探討消巖湯聯合阿帕替尼抑制胃癌MGC-803細胞增殖的作用機制研究*

牟睿宇，，牛瀟菲，廖洋，賈春鑫，孔凡銘，郭姍琦，賈英杰

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，天津 300381；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

近年來，胃癌的發病率和病死率一直居高不下，中國胃癌發病率與病死率遠超過美國[1]。據2020 年全球癌癥報告[2]顯示，中國胃癌發病率占全球的43.9%，病死率占全球的48.6%，幾乎達到了全球胃癌患者的半數。胃癌往往早期癥狀不顯著，多數患者確診時即為晚期，治療效果差，預后不佳，手術、放化療、靶向治療以及免疫治療等西醫治療手段雖然能在一定程度上改善患者的生存預后，但仍存在不良反應以及耐藥等一系列問題，如何打破目前胃癌臨床治療的瓶頸，提高患者的生存預后是越來越多學者密切關注的問題。中醫藥作為中華民族的文化瑰寶，在治療胃癌方面顯現出良好的臨床療效及發展前景，中西醫相輔相成的綜合治療方式被視為打破胃癌治療困境的一個突破口。

消巖湯作為天津中醫藥大學第一附屬醫院賈英杰教授的經驗方，已在臨床應用十余年，長期的臨床實踐顯示其治療氣虛毒瘀的惡性腫瘤患者療效顯著?，F代藥理學研究[3-6]表明，其可有效抑制多種腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡，逆轉鉑類耐藥，從而發揮抗腫瘤療效。本研究團隊前期臨床研究[7]顯示消巖湯聯合阿帕替尼治療晚期胃癌患者中位生存時間可達6.0 個月，較對照組中位生存時間延長了0.3 個月，在胃癌治療中顯現出良好療效。但消巖湯的抗胃癌作用機制尚未明確，本研究基于血管內皮生長因子（VEGF）/磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）通路探討消巖湯聯合阿帕替尼治療胃癌的作用機制研究，為下一步消巖湯在胃癌領域的應用提供了依據和參考。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人胃癌MGC-803 細胞，由天津中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科實驗室凍存。

1.2 實驗藥品 消巖湯（藥物組成：黃芪30 g，郁金10 g，姜黃10 g，太子參15 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，牡蠣15 g）購自天津中醫藥大學第一附屬醫院國藥堂，嚴格按照回流提取法進行提取，將其濃縮至生藥濃度為1 g/mL 的水煎液，并依次運用0.45 μm和0.22 μm 的無菌微孔濾膜進行過濾除菌；甲磺酸阿帕替尼購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.3 實驗試劑 RPMI 1640 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶[不含乙二胺四乙酸（EDTA）]，均購自以色列BI 公司；雙抗、磷酸鹽緩沖液（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）、脫氧核糖核酸（DNA）含量檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液、彩虹180 廣譜蛋白Marker、TBST，均購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（0.25%EDTA），購自美國Gibco 公司；CCK-8 檢測試劑盒，購自日本同仁化學研究所；AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD 公司；RAPI 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、電泳液、轉膜液、封閉液、一抗二抗稀釋液、一抗二抗去除液，均購自上海碧云天生物技術有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 凝膠制備試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）羊抗兔免疫球蛋白G[（IgG），H+L]、HRP 羊抗鼠IgG（H+L）、超特敏ECL化學發光即用型底物，均購自武漢博士德生物工程有限公司；p-PI3K 抗體、p-AKT 抗體，均購自美國CST 公司；血管內皮生長因子A（VEGFA）抗體、血管內皮細胞生長因子受體2 （VEGFR-2） 抗體、Cleaved Caspase -9 抗體、Bcl -2 抗體、Bax 抗體、GAPDH 抗體，均購自Affinity 公司。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；CO2恒溫培養箱（美國Thermo 公司）；光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；臺式恒溫搖床（天津歐諾儀器股份有限公司）；電子天平（上海?？惦娮觾x器廠）；多功能酶標儀（美國Thermo 公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；干式恒溫金屬?。绹鳷hermo 公司）；小型垂直電泳槽、小型轉印槽、電泳儀電源（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析系統（德國Jena 公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人胃癌MGC-803 細胞使用RPMI 1640 完全培養基[RPMI 1640 培養基+10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗]，5%CO2，37 ℃恒溫條件下進行細胞培養，待細胞生長至80%密度時，使用胰酶進行消化，并按1∶4 進行細胞傳代。

2.2 CCK-8 檢測細胞增殖 消化收集對數生長期的人胃癌MGC-803 細胞并進行細胞計數，將細胞懸液濃度調整為4×104/mL，并將其按4 000 個細胞/孔接種至96 孔板中，靜置培養24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60、80、100、120 mg/mL 的含藥培養基，每個濃度設置4 個復孔，繼續靜置培養24 h 后加入CCK-8 檢測試劑避光孵育1～4 h，使用酶標儀檢測每孔在450 nm 處的吸光度，并計算不同濃度消巖湯對人胃癌MGC-803 細胞的生長抑制率：細胞抑制率=[（對照孔吸光度-實驗孔吸光度）/（空白對照組吸光度-空白孔吸光度）]×100%。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 消化收集對數生長期的人胃癌MGC-803 細胞并制備細胞懸液，將其按2×105個細胞/孔接種至六孔板中，靜置培養24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60 mg/mL 的含藥培養基，每個濃度設置3 個復孔，繼續靜置培養24 h，使用不含EDTA 的胰蛋白酶消化收集細胞，1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，PBS 洗2 次，加入1×Binding Buffer 緩沖液將其制備成1×106個細胞/mL 的細胞懸液。在流式管中加入100 μL 的細胞懸液，加入5 μL 的AnnexinV-FITC 染料和5 μL的PI 染料，混勻，避光反應15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer 緩沖液，混勻，30 min 內上流式細胞儀進行檢測，并使用FlowJo 軟件對凋亡數據進行分析。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期 消化收集對數生長期的人胃癌MGC-803 細胞并制備細胞懸液，將其按2×105個細胞/孔接種至6 孔板中，靜置培養24 h 后分別加入濃度為0、20、40、60 mg/mL 的含藥培養基，每個濃度設置3 個復孔，繼續靜置培養24 h 后消化收集細胞，1 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，PBS 洗2 次，加入預冷的70%乙醇，置于-20 ℃冰箱中固定過夜，4 ℃下1 500 r/min，離心半徑20 mm，離心5 min，棄上清液，PBS 洗2 次，徹底去除乙醇，加入100 μL RNaseA 溶液，置于37 ℃恒溫水浴鍋中30 min，再加入400 μL PI 染色液，4 ℃避光染色30 min。將待測樣品轉移至流式管中，使用300 目細胞篩網進行過濾，上流式細胞儀進行檢測，并使用ModFit 軟件對細胞周期數據進行分析。

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測細胞蛋白表達 分別設置空白對照組、消巖湯組（XYT 組，60 mg/mL）、阿帕替尼組（Apatinib 組，40 μmol/L）以及聯合用藥組（XYT，60 mg/mL+Apatinib，40 μmol/L），加藥處理24 h 后收集細胞，每管中加入200 μL 配制好的裂解液（RIPA 裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1），置于冰上裂解30 min，4 ℃離心10 min，取上清液，利用BCA 法對蛋白濃度進行檢測，并將各組蛋白樣本調整為相同濃度，加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混勻，95 ℃變性5 min。將蛋白Maker及各組樣品（上樣量為40 μg/孔）進行蛋白上樣，80 V恒壓電泳20～30 min，待溴酚藍染料跑至分離膠后調整電壓為120 V 恒壓電泳1.5 h，待溴酚藍染料跑至凝膠最下緣處停止電泳。按照“三明治”法進行轉膜，設置恒流200 mA，1～2 h，轉膜完成后，取出PVDF 膜，根據目的蛋白的分子量范圍進行剪膜，加入封閉液，封閉30～60 min，1×TBST 洗3 次，加入一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST 洗3 次，加入二抗室溫孵育1 h，1×TBST 洗3 次。利用凝膠成像系統曝光顯影，并使用Image J 軟件對不同條帶進行光密度分析。對于分子量重合的蛋白條帶可利用去除液進行抗體洗脫。

2.6 統計學分析 運用SPSS Statistics 21.0 軟件對實驗結果進行分析，計量資料數據結果用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 消巖湯對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響CCK-8的檢測結果顯示，消巖湯對人胃癌MGC-803 細胞活力具有明顯抑制作用，差異具有統計學意義（P<0.05）。不同濃度消巖湯對MGC-803 細胞的抑制率顯示，消巖湯呈劑量依賴性抑制MGC-803 細胞的增殖，通過計算得出消巖湯作用于MGC-803 細胞的半抑制濃度（IC50）為63.56 mg/mL。見表1。

表1 不同濃度消巖湯對MGC-803 細胞影響抑制率Tab.1 Effect of inhibition rate of different concentration of Xiaoyan Decoction on MGC-803 cells

3.2 消巖湯對人胃癌MGC-803 細胞凋亡的影響 細胞凋亡的流式檢測結果顯示，隨著消巖湯濃度的增加，人胃癌MGC-803 細胞的總凋亡率逐漸升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。當消巖湯濃度為0、20、40 和60 mg/mL 時，MGC-803 細胞的總凋亡率分別為（4.49 ±0.26）%、（10.26 ±1.32）%、（20.15 ±2.29）% 和（30.01±1.35）%。檢測結果表明，消巖湯可顯著誘導人胃癌MGC-803 細胞發生凋亡。見圖1。

圖1 消巖湯對MGC-803 細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of Xiaoyan Decoction on apoptosis of MGC-803 cells

3.3 消巖湯對人胃癌MGC-803 細胞周期的影響 細胞周期的流式檢測結果顯示，隨著消巖湯濃度的增加，MGC-803 細胞的G0/G1 期細胞所占百分比逐漸降低，S 期細胞所占百分比逐漸升高，差異均具有統計學意義（P<0.05），G2/M 期細胞所占百分比變化不大，差異無統計學意義（P>0.05）。檢測結果表明，消巖湯可誘導人胃癌MGC-803 細胞發生S 期阻滯。見圖2。

圖2 消巖湯對MGC-803 細胞周期分布的影響Fig.2 Effect of Xiaoyan Decoction on cell cycle distribution of MGC-803

3.4 消巖湯聯合阿帕替尼對MGC-803 細胞活力的影響 CCK-8 的結果顯示，與空白對照組比較，消巖湯單藥組、阿帕替尼單藥組以及聯合用藥組均可明顯抑制MGC-803 細胞的活力，差異有統計學意義（P<0.000 1），抑制率分別為（44.918±1.469）%、（37.585±1.869）%和（66.651±1.599）%。與消巖湯單藥組和阿帕替尼單藥組比較，聯合用藥組對MGC-803 細胞活力的抑制作用更為明顯，且差異有統計學意義（P<0.000 1）。由此可見，消巖湯、阿帕替尼均可有效抑制MGC-803 細胞的生長增殖，與單獨用藥比較，二者聯用的效果更好。見表2。

表2 消巖湯聯合阿帕替尼對MGC-803 細胞抑制率的影響Tab.2 Effect of inhibition rate of Xiaoyan Decoction combined with apatinib on MGC-803 cells

3.5 消巖湯聯合阿帕替尼對人胃癌MGC-803 細胞PI3K/AKT 信號通路蛋白表達的影響 利用Western Blot 檢測不同藥物組作用于MGC -803 細胞后PI3K/AKT 信號通路蛋白表達的情況，實驗結果顯示，與空白對照組比較，消巖湯、阿帕替尼及其聯合用藥組的p-PI3K、p-AKT 以及Bcl-2 蛋白的表達量顯著下調，Cleaved Caspase-9 以及Bax 蛋白的表達量顯著上調，差異均具有統計學意義（P<0.05）。與消巖湯單藥組和阿帕替尼單藥組比較，聯合用藥組對p-PI3K、p-AKT、Bcl-2 蛋白的表達下調更為明顯，差異均具有統計學意義（P<0.05）；對CleavedCaspase-9蛋白的表達上調也更為顯著，差異具有統計學意義（P<0.05）。聯合用藥組較消巖湯單藥組的Bax 蛋白表達有所上調，但差異無統計學意義（P>0.05）；較阿帕替尼單藥組的Bax 蛋白表達上調顯著，且差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 各藥物組對MGC-803 細胞PI3K/Akt 通路相關蛋白表達情況的影響Fig.3 Effects of different drug groups on PI3K/Akt pathway related protein expression in MGC-803 cells

3.6 消巖湯聯合阿帕替尼對人胃癌MGC-803 細胞血管生成相關指標蛋白表達的影響 利用Western Blot 檢測不同藥物組作用于MGC-803 細胞血管生成相關指標的蛋白表達情況。結果顯示，與空白對照組的VEGFR-2 比較，消巖湯單藥組、阿帕替尼單藥組以及聯合用藥組的VEGFA 和VEGFR-2 表達均顯著下調，差異均具有統計學意義（P<0.05）。聯合用藥組較消巖湯單藥組的VEGFA 下調水平有統計學差異（P<0.05），較阿帕替尼單藥組的VEGFA 下調水平無統計學差異（P>0.05）。相較于兩個單藥組，聯合用藥組的VEGFR-2 表達量更低，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖4 各藥物組對MGC-803 細胞VEGFA/VEGFR-2 蛋白表達情況的影響Fig.4 Effects of different drug groups on VEGFA/VEGFR-2 protein expression in MGC-803 cells

4 討論

賈英杰教授認為惡性腫瘤的根本病機為“本元虧虛，癌濁叢生”，其中“正虛”為內因，“癌濁”為誘因，二者貫穿病程始終?；诖?，賈英杰教授提出“黜濁培本”[8-9]大法治療惡性腫瘤，并在“黜濁培本”的理論基礎之上，結合現代藥理學研究成果以及數年臨證經驗，自擬經驗方“消巖湯”用于治療氣虛毒瘀的惡性腫瘤患者。方中黃芪、太子參益氣養陰，扶正抗癌；白花蛇舌草、夏枯草、生牡蠣清熱解毒、軟堅散結；姜黃、郁金化瘀消癥，疏肝行氣，諸藥配伍，共奏黜濁培本之效。本團隊的前期實驗研究發現，消巖湯具有明確的抗腫瘤療效，可以通過多通路、多靶點、多途徑發揮抗腫瘤作用。

胃癌可歸屬于中醫學 “積聚”“反胃”“胃脘痛”“胃痞”等病范疇?，F代藥理學研究發現，多種中藥具有抗腫瘤作用，其中白花蛇舌草[10]可以降低人胃癌MNK-45 細胞線粒體膜電位，從而誘導細胞凋亡；夏枯草[11]可以通過HMGB1 抑制胃癌BGC-823細胞增殖、侵襲與遷移，并誘導其發生凋亡。前期的網絡藥理學研究表明，消巖湯中的多種活性成分均具有抗胃癌作用，黃芪、白花蛇舌草、夏枯草中含有的活性成分槲皮素[12]可以通過誘導ROS 生成，降低線粒體膜電位，從而誘導人胃癌AGS 細胞發生凋亡。黃芪和夏枯草中含有的活性成分山柰酚[13-14]能有效抑制胃癌MKN-28 和SGC-7901 細胞的增殖，誘導胃癌細胞凋亡，并可以通過IRE1-JNK-CHOP途徑誘導胃癌細胞自噬。太子參中含有的活性成分木犀草素[15-16]可以通過調控PI3K-Akt、MAPK、mTOR等多條信號通路，抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移以及血管生成，促進胃癌細胞凋亡。

本研究以VEGF/PI3K/AKT 信號通路為切入點，從體外層面探究了消巖湯治療胃癌的機制，研究結果顯示，消巖湯能有效下調VEGF/PI3K/AKT信號通路中VEGFA、VEGFR-2、p-PI3K、p-AKT 和Bcl-2 的表達，上調Cleaved Caspase-9 和Bax 的表達，從而誘導胃癌MGC-803 細胞凋亡，抑制血管新生，起到抗腫瘤效果。其中VEGFA[17]是常見的血管生成調控因子，其可與VEGFR-2 受體相結合，從而激活下游多條信號通路介導血管新生，PI3K/AKT 信號通路[18]就是其中之一。PI3K/AKT 信號通路是腫瘤發生發展過程中一條重要的信號通路，其可介導多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、周期、侵襲、遷移、免疫微環境以及血管新生等[19-21]，本研究對其通路介導的凋亡相關蛋白進行了檢測，發現其可抑制Bcl-2 的蛋白表達，促進Cleaved Caspase-9 和Bax 的蛋白表達，從而誘導MGC-803 細胞凋亡。阿帕替尼作為VEGFR-2靶向藥物，與消巖湯聯用能增加對VEGF/PI3K/AKT信號通路的抑制作用，更好地發揮抗腫瘤效果。此外，本研究對消巖湯對胃癌MGC-803 細胞的增殖和周期還進行了檢測，發現消巖湯能有效抑制MGC-803 細胞增殖，誘導S 期阻滯，其具體的作用機制還有待進一步挖掘。中藥復方發揮抗腫瘤效果的過程往往是通過多通路、多靶點實現的，本研究僅對VEGF/PI3K/AKT 信號通路進行了探討，消巖湯是否可以通過其他信號通路發揮抗胃癌效果，同樣值得進一步深入研究。