基于數據挖掘和網絡藥理學研究中藥復方治療重癥肌無力的用藥規律及作用機制*

鄭鴻銘，胡芝凡，黃夢芬，陳明榆，李逸婷，繆濤聲，莫喬蘭，邱澤鑫，陳斌

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州 510000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院脾胃病科，廣州 510000）

重癥肌無力是由自身抗體介導的，累及神經肌肉接頭突觸的獲得性自身免疫疾病[1]。本病可累及全身骨骼肌，常表現為上瞼下垂、復視、構音障礙、吞咽困難、呼吸困難等癥狀，具有病程長、病情重、易復發等特點，住院病死率可達到14.69‰[2]。目前西醫治療以膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、糖皮質激素、生物制劑、免疫球蛋白、血漿置換、切除胸腺等治療為主，然而長期用藥可能會導致乙酰膽堿受體破壞、膽堿能危象、免疫力低下等問題，血漿置換及免疫球蛋白等治療也存在著較大的經濟負擔等問題[3-5]。中醫藥治療重癥肌無力方面有著豐富的臨床經驗及研究基礎，具有療效持久，經濟負擔小，不良反應少等優勢，其在重癥肌無力治療中的地位越發得到重視。中藥復方專利及中藥復方臨床研究作為眾多臨床醫師長期實踐總結的經驗，具有較強的實用性及可重復性[6-7]。因此本研究通過數據挖掘探討中國專利公布公告數據庫、中國知網及萬方數據庫中的中藥復方治療重癥肌無力的用藥規律，并通過網絡藥理學分析核心藥物組合治療重癥肌無力的作用機制，以期能為中藥復方治療重癥肌無力提供組方及研究思路。

1 材料與方法

1.1 治療重癥肌無力中藥復方檢索 檢索國家知識產權局中國專利公布公告數據庫（http：//epub.cnipa.gov.cn/）截止至2023 年4 月20 日的專利數據，檢索專利類型為“發明授權”及“發明公布”，在文本名稱及摘要說明中分別以 “中藥and 重癥肌無力”“草藥and 重癥肌無力”進行查詢，同時以“中醫藥”“中醫”“法”“方”“重癥肌無力”及“痿證”作為檢索主題詞，檢索中國知網及萬方數據庫從建庫以來至2023 年4 月20 日所有有關中藥復方治療重癥肌無力的期刊論文及學位論文，根據嚴格的納入、排除標準對查詢及檢索結果進行錄入整理。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 中藥復方納入標準 專利中藥復方：1）檢索國家知識產權局中國專利公布公告數據庫獲取的用于治療重癥肌無力的口服中藥復方專利，不限制藥物劑型，不限制眼肌型及全身型。2）專利適應證中包含重癥肌無力的口服中藥復方。3）專利摘要內容中說明可治療重癥肌無力的中藥復方。

文獻中藥處方：1）研究對象：用于治療重癥肌無力的中藥復方，藥味組成明確，不限制藥物劑型，不限制眼肌型及全身型，所納入研究中的患者均確診為重癥肌無力，診斷標準參照《中國重癥肌無力診斷和治療指南》[4]。2）研究類型：隨機對照試驗、隊列研究、描述性研究。3）結局指標：納入研究具有臨床療效評定等結局指標，結局明確中藥復方對重癥肌無力有治療效果。4）以同一中藥復方組成進行不同研究時僅保留一次。

1.2.2 中藥復方排除標準 專利中藥復方：1）非口服或僅可外用治療重癥肌無力的中藥復方專利。2） 專利處方藥物在專利摘要中未說明或未完全展示。3）用于重癥肌無力并發癥治療的中藥復方專利。4）僅含中藥提取物或中西藥合并使用的復方專利。5）以不同制劑類型相同處方內容重復發表的專利。

文獻中藥處方：1）不以重癥肌無力為唯一治療對象。2）研究類型無法確認以及動物實驗、綜述、專家共識、會議報道等。3）無法獲取全文或藥物組方不明確。

1.3 中藥復方數據錄入與規范 將篩選后符合納入標準的中藥復方錄入Excel 2016，數據規范化處理參照2020 年版《中華人民共和國藥典》及《中華本草》。對中藥名稱進行統一規范，如“山芋肉”規范為“山茱萸”，“丹皮”規范為“牡丹皮”，規范道地名稱，如“淮山”錄入為“山藥”。數據錄入由兩名研究人員分別獨立進行，對錄入結果不一致處查詢原專利內容及文獻內容后討論統一。

1.4 中藥復方數據分析 將規范化錄入后的中藥復方數據導入R 語言（4.2.0 版本），利用itemFrequency函數統計高頻中藥，進行可視化處理，利用apriori 函數分析關聯規則，設置最小支持度為0.22，最小置信度為0.8，然后利用plot 函數對繪制點圖、分組矩陣圖及網狀圖對關聯規則進行可視化處理；利用Excel 2016 對錄入中藥的四氣五味、歸經進行統計分析繪制雷達圖，利用IBM SPSS Modeler 軟件進行復雜網絡分析，利用SPSS 進行系統聚類分析，繪制聚類分析譜系圖，根據統計結果對用藥規律進行分析。

1.5 核心藥對的網絡藥理學分析 綜合高頻藥物統計、關聯規則分析、聚類分析及中醫藥理論，獲得核心藥物組合進行網絡藥理學分析，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/index.php） 檢索核心藥物組合藥物成分及其作用的蛋白質靶點，以口服生物利用度≥30%，藥物相似度≥0.18 作為篩選條件，利用Uniprot（Universal Protein）蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org/）將篩選獲得的蛋白質靶點信息進行規范化處理，從人類基因數據庫、疾病相關的基因與突變位點數據庫（DisGeNET）、藥物數據庫（Drugbank）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）、TTD 數據庫獲取重癥肌無力相關靶點，利用R 語言ggplot2 包將篩選獲得的藥物組合靶點與重癥肌無力靶點取交集，繪制韋恩圖。將交集靶點提交至STRING（https：//cn.string-db.org/）平臺進行蛋白質互作網絡（PPI）分析，利用Cytoscape 3.7.0 Network Analysis 分析并可視化PPI 網絡模型，利用Metascape 數據庫對核心藥物組合與重癥肌無力靶點共同靶點進行基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，利用氣泡圖可視化分析結果。

1.6 分子對接 根據中藥復方藥物組合活性成分-重癥肌無力-通路網絡及PPI 網絡模型獲取的核心藥物成分及靶點信息，利用Chem3D MM2 進行能量最小化結構優化，利用PyMOL 軟件移除水分子、配體、無機鹽等，通過Autodock 軟件對篩選出的核心藥物成分及核心靶點進行分子對接預測，利用PyMOL 對對接結果進行可視化處理，并通過R 語言pheatmap 包繪制結合能熱圖。

2 結果

2.1 中藥復方的數據挖掘

2.1.1 高頻中藥類別及頻數、頻率分析 根據納入、排除標準篩選后共納入專利63 條，文獻162 篇，共涉及中藥復方151 條，其中復方專利處方60 條，文獻報道中藥復方91 條，中藥352 味，共計用藥頻數1 759 次，通過R 4.2.0 統計高頻中藥得到高頻中藥（使用頻率≥10%，即使用頻數≥15 次）共26 味，其中黃芪（121 次，80.13%）、白術（93 次，61.59 %）、當歸（84 次，55.63%）、升麻（78 次，51.66%）、黨參（66 次，43.71%），柴胡（65 次，43.05%），高頻中藥類別及頻數、置信度、頻率見表1。

表1 中藥復方治療重癥肌無力高頻藥物（頻數≥15 次）藥物類別、頻次、頻率情況Tab.1 The TCMs category，count and frequency of Chinese medicine compound for the treatment of myasthenia gravis high frequency drugs (frequency≥15)

2.1.2 四氣五味及歸經分析 處方納入的352 味中藥的四氣以溫性藥（115 次，34.3%）為主，其次是平性藥（92 次，27.5%）；五味以甘味（179 次，34.7%）為主，其次為苦味（154 次，29.8%），四氣五味雷達圖見圖1。歸經以肝經（161 次，22.0%）為主，其次為腎經（120 次，16.4%），歸經旭日圖見圖2。

圖1 四氣五味雷達圖Fig.1 The radar map for four natures and five flavors of drugs

圖2 歸經旭日圖Fig.2 Sunburst chart of channel tropism

2.1.3 中藥復方關聯規則分析 使用IBM SPSS Modeler 18.0 對納入的352 味中藥進行復雜網絡分析，復雜網絡圖見圖3，線條越粗表示支持度越大，使用R 4.2.0 Apriori 函數進行關聯規則分析，設置最小支持度0.25，最小置信度0.9，共篩選得出中藥復方治療重癥肌無力核心藥對76 項，包括中藥7 味：柴胡、當歸、黃芪、黨參、白術、升麻、陳皮。結果按支持度降序排序，見表2-表5，其中白術=>黃芪頻數最高，為87 次，繪制高頻藥物關聯規則網狀圖，箭頭代表相互關聯，點大小代表置信度，點顏色越深代表提升度越高，見圖4。

圖3 復方中藥治療重癥肌無力復雜網絡圖Fig.3 Association network display of TCMs in treatment of myasthenia gravis

圖4 高頻藥物關聯規則網狀圖Fig.4 Network diagram of high frequency TCMs association rules

表2 治療重癥肌無力復方中藥的二項關聯規則Tab.2 Binomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis

表3 治療重癥肌無力復方中藥的三項關聯規則（支持度前10 位）Tab.3 Trinomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis(top 10 in support)

表4 治療重癥肌無力復方中藥的四項關聯規則（支持度前10 位）Tab.4 Quadrinomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis(top 10 in support)

表5 治療重癥肌無力復方中藥的五項關聯規則Tab.5 Pentavalent association rules of TCMs compound for myasthenia gravis

2.1.4 中藥復方高頻中藥聚類分析 利用SPSS 25.0 對34 味治療重癥肌無力中藥復方中的高頻中藥進行系統聚類分析，最小聚類數設置為5，最大聚類數設置為10，測量區間采用皮爾森（Pearson）相關性，見圖5。設置Pearson 相關性為20，可分為7 類，T1：升麻、柴胡、白術、黨參、黃芪、當歸、陳皮、甘草、巴戟天；T2：枸杞子、丹參；T3：杜仲、牛膝、山茱萸、山藥、熟地黃、茯苓、菟絲子；T4：川芎、白芍、炙甘草；T5：葛根、地龍；T6：人參；T7：淫羊藿、生地黃。

圖5 高頻藥物聚類分析Fig.5 Cluster analysis of high-frequency TCMs

2.2 網絡藥理學分析

2.2.1 中藥復方藥物組合及重癥肌無力靶點篩選綜合高頻藥物統計、關聯規則分析、聚類分析及中醫藥理論，最終選擇核心藥物組合“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”進一步探索中藥復方治療重癥肌無力的作用機制。篩選后獲取的柴胡、當歸、黃芪、黨參、白術、升麻活性成分各17、2、20、21、7、17 個，根據已發表文獻補充未預測到的活性成分及相應靶點，去除重復項后，最終納入藥物活性成分55 個，去除重復項后，最終納入活性成分靶點257 個。從Genecards、DisGeNET、Drugbank、OMIM、TTD 數據庫獲取重癥肌無力相關靶點各839、336、14、33、7 個，合并去除重復項后獲得疾病靶點995 個。

2.2.2 中藥復方藥物組合—重癥肌無力靶點PPI 網絡構建 利用R 語言ggplot2 包將篩選獲得的 “柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”藥物組合靶點與重癥肌無力靶點取交集，獲得共同靶點64 個，繪制韋恩圖見圖6。PPI 網絡模型中節點大小代表連接度，邊的粗細代表相互作用強度，見圖7。64 個靶點共存在776 項相互關聯，其中節點平均連接度為24.25，平均介度為0.013，平均緊密度為0.587，連接度、介度、緊密度均大于平均值的核心靶點有14 個，按連接度從大到小排列依次為蛋白激酶B1（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因FOS（FOS）、原癌基因JUN（JUN）、原癌基因MYC（MYC）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細胞介素-1β（IL-1β）、C 反應蛋白（CRP）、腫瘤抑制蛋白（TP53）、血管內皮生長因子（VEGFA）、雌激素受體（ESR1）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2），提示這些靶點可能為 “柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”治療重癥肌無力的關鍵靶點。

圖6 藥物組合-重癥肌無力靶點韋恩圖Fig.6 Venn diagram of drug combination and myasthenia gravis targets

圖7 藥物組合-重癥肌無力靶點PPI 網絡圖Fig.7 PPI network of drug combination and myasthenia gravis targets

2.2.3 KEGG 及GO 富集分析 利用Metascape 數據庫對“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”藥物組合與重癥肌無力靶點共同靶點進行GO 富集分析，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）及細胞成分（CC）并進行KEGG 富集分析，設定P<0.01，選取P值排名前20 位的功能信息，繪制氣泡圖進行可視化處理。KEGG 富集分析結果顯示，“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”藥物組合參與治療重癥肌無力的信號通路主要包括白細胞介素-17（IL-17）信號通路、TNF 信號通路、T 細胞受體（TCR）信號通路、Toll 樣受體（TLR）信號通路、輔助性T 細胞17（Th17）細胞分化信號通路、C-型凝集素受體（CLR）信號通路，詳見圖8。

圖8 KEGG 富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

GO 富集分析結果顯示相關靶點參與的生物過程主要包括蛋白質磷酸化正向調節、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯正向調控、對生長因子的響應、對激素的反應、對活性氧的反應等；主要參與的細胞成分包括膜筏、突觸后膜、受體復合體、基底外側質膜等，主要參與分子功能包括磷酸酯水解酶活性、作用于酯鍵的水解酶活性、血清素受體活性、G蛋白偶聯血清素受體活性、神經遞質受體活性參與突觸后膜電位的調節、G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、突觸后神經遞質受體活性等，詳見圖9。

圖9 GO 富集分析氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of GO enrichment analysis

2.2.4 中藥復方藥物組合活性成分-重癥肌無力-通路網絡構建 利用Cytoscape 3.7.0 構建 “藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路”網絡圖，見圖10，結果提示共124 個節點，產生662 項關聯，55 個藥物活性成分的平均連接度為8.2，平均介度為0.007，平均緊密度為0.384，連接度越大表示相互作用的靶點越多，提示該藥物活性成分在“活性成分-重癥肌無力-通路網絡”中處于核心位置，按連接度降序排列篩選出核心藥物活性成分見表6，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、甲氧異黃酮、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、毛蕊異黃酮、3β-乙酰氧基蒼術酮、大豆黃素、（6aR，11aR）- 3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷、齒阿米醇等。

圖10 藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路網絡圖Fig.10 Network diagram of drug combination-myasthenia gravis-pathway

表6 核心藥物成分表Tab.6 Core drug composition table

2.2.5 分子對接結果 利用Autodock 軟件對“藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路”網絡及PPI 網絡中篩選出的連接度大于平均連接度的核心藥物成分（共10 個）及前10 位核心靶點進行分子對接預測，得到藥物關鍵活性成分與核心靶點結合能結果，見圖11，最低結合能越低代表結合能力越強，對接結果提示，平均分子對接結合能為-6.23 kcal/mol，提示核心藥物成分與核心靶點對接穩定，結合能最低的分子對接為7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR，其分子對接圖見圖12。EGFR 抑制劑吉非替尼與EGFR 靶點的分子對接見圖13。

圖11 分子對接結合能熱圖Fig.11 Heat map of molecular docking binding energy

圖12 7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR 分子對接圖Fig.12 Molecular docking diagram of 7-Omethylisomucronulatol and EGFR

圖13 吉非替尼與EGFR 分子對接圖Fig.13 Molecular docking diagram of Gefitinib and EGFR

3 討論

3.1 中藥復方治療重癥肌無力的用藥規律 中醫典籍中暫無“重癥肌無力”病名，現代醫家根據其臨床表現，將其歸為“痿證”“瘖痱”“虛勞病”等范疇[8]?！饵S帝內經·素問》 中最早闡述了痿證的病因病機“五臟使人痿……肺主身之皮毛，心主身之血脈，肝主身之筋膜，脾主身之肌肉，腎主身之骨髓，故肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著則生痿躄也”[9]。目前重癥肌無力的中醫辨證分型尚無統一的標準，各個醫家對本病辨治也存在不同的學術思想。國醫大師鄧鐵濤教授提出重癥肌無力“脾胃虛損，五臟相關”理論，辨證為脾胃虛損證，治療上“重補脾胃，益氣升陷，兼治五臟”[10]。中國中醫科學院周紹華教授將重癥肌無力分為肝腎虧虛、中氣不足、脾腎陽虛、元氣衰敗4 型[11]。劉亞軍等[12]通過回顧性分析發現重癥肌無力歸以脾氣虛弱證、肝腎不足證及脾腎兩虛證多見。劉小斌教授[13]提出多病因致病理論，重癥肌無力發病可歸于先天稟賦不足，或后天失調，或情志失司等所致，治療上以峻補脾胃、益氣升陷為治療大法，兼以補益肝腎。本研究通過對中國專利公布公告數據庫、中國知網及萬方數據庫的檢索，納入治療重癥肌無力中藥處方60 條，中藥352 味。數據分析結果發現重癥肌無力中藥復方所使用的藥物多歸肝、腎經，重癥肌無力患者常見眼肌受累，肝開竅于目，肝虛則目不得精氣濡養，故可見復視、眼瞼下垂等癥狀，肝主藏血并主一身之筋膜，血海不足則濡潤經脈難以為繼，故出現晨輕暮重的波動性疲勞[14]。腎為先天之本?！饵S帝內經·素問》曰：“腎者作強之官，伎巧出焉?！蹦I虛則伎巧不出，痿軟不用，可見補益肝腎是重癥肌無力治療中的重要方法[15]。重癥肌無力病機以虛損為主，根據數據挖掘結果分析中藥復方納入中藥多為補氣藥、補陰藥及補陽藥，符合重癥肌無力虛損的病機，性味多以甘溫為主，溫藥可以溫補腎陽以固先天之本，甘味藥具有補益和中之作用，且甘能入脾，脾主身之肌肉，甘溫之藥能健脾益氣，補益脾胃以充后天之本，先后天同調達到治療重癥肌無力的目的。

關聯分析共篩選得出中藥復方治療重癥肌無力核心藥對76 項，包括中藥7 味：柴胡、當歸、黃芪、黨參、白術、升麻、陳皮，其中白術=>黃芪、當歸=>黃芪頻數較高。系統聚類分析結果可分為7 類，分別體現出中醫氣血陰陽并補、活血通經、舒筋通絡、補益肝腎、溫腎助陽等治法，T1 聚類方升麻、柴胡、白術、黨參、黃芪、當歸、陳皮、甘草、巴戟天以補中益氣湯加巴戟天，重補脾胃，益氣升陷，兼以補腎助陽；T3 聚類杜仲、牛膝、山茱萸、山藥、熟地黃、茯苓、菟絲子聚類方為經方六味地黃丸加減，體現補腎填精以固先天之本的治療思想；T4 聚類川芎、白芍、炙甘草為四物湯加減，體現重癥肌無力治療中補血以潤宗筋的治療思想；T6 聚類單藥人參補脾益氣，生津養血，上述聚類結果契合了重癥肌無力虛損為本的病機，體現了重癥肌無力治療上重視補益虛損，益氣升陷，養血榮筋，注重肝腎、脾胃先后天同調的特點。

重癥肌無力屬于“痿證”范疇，早在《素問·痿論》中便提出“治痿獨取陽明”的觀點。脾胃為后天之根本，為水谷精微化生之源?！镀⑽刚摗酚醒裕骸胺蚱⑽刚?，倉廩之官也，屬土以滋眾臟，安谷以濟百骸，故胃于中宮，職司南政，旺于四季，體應四肢?！盵16]補中益氣湯出自《內外傷辨惑論》，是補中益氣、升陽舉陷的千古名方。明代《保嬰撮要》中記載“若胃氣虧損，眼睫無力而不能開者，用補中益氣湯”[17]。多項臨床研究也證實補中益氣湯治療重癥肌無力具有良好的臨床療效，體現了從陽明論治痿證的學術思想[18-20]。本研究綜合高頻藥物統計、關聯規則分析、聚類分析及中醫藥理論后得出治療重癥肌無力的核心藥物組合 “柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”，與補中益氣湯組方思路相符合，重癥肌無力患者脾胃虛損，清陽不升，氣陷于下，故見眼瞼下垂，核心藥物組合中柴胡、升麻可升陽舉陷，恢復中焦升降之功能，使得氣機通利，氣血得以榮養宗筋，脾得以升清?！夺t學衷中參西錄》提出當歸能生血活血，又能宣通氣分，使氣分各有所歸，而黃芪既能補氣，又能升氣，核心藥物組合中當歸、黃芪兩者相伍，補血以載氣，補氣以生血，氣血互生，氣得以壯，血得以旺，使重癥肌無力患者筋脈得以濡養，中氣得以升提[21]。黨參、白術補益脾胃，又可輔助黃芪以補中益氣，脾胃得以健運，則氣血生化得其源，配以當歸則可輔以補血和營。脾胃虧虛之病機貫穿重癥肌無力發展與轉歸的始終，整體核心藥物組合組方體現補益脾胃以充后天之本，氣血雙補以榮養筋脈，符合“治痿獨取陽明”的中醫經典理論。

3.2 核心藥物組合“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”治療重癥肌無力的網絡藥理學研究 網絡藥理學分析結果提示“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”藥物組合的主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、甲氧異黃酮、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、毛蕊異黃酮、3β-乙酰氧基蒼術酮、大豆黃素、齒阿米醇等。其中當歸中含有的β-谷甾醇及黨參、升麻、柴胡含有的豆甾醇屬于植物甾醇化合物，研究表明β-谷甾醇可選擇性地抑制CD4 陽性細胞（Th1）活性并促進輔助型T 細胞2（Th2）偏倚，Th1 細胞和Th2 細胞的細胞間平衡失常與重癥肌無力的發生發展密切相關，糾正Th1/Th2 失衡可能為重癥肌無力治療的關鍵之一[22-24]。豆甾醇可影響調節T 細胞（CD4+CD25+）的增殖水平，而胸腺來源的CD4+CD+25Tr 免疫調節細胞數量及功能的異?？赏ㄟ^主動調節的方式影響重癥肌無力等自身免疫病的發生發展，重癥肌無力癥狀未控制時CD4+CD+25Tr 細胞百分率明顯降低，因此推測豆甾醇可影響調節T 細胞來治療重癥肌無力[22，25-26]。白術中的3β-乙酰氧基蒼術酮為網絡藥理學預測治療重癥肌無力的活性成分之一，研究表明蒼術酮可通過核因子-κB（NF-κB）通路抑制炎癥，抑制炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放，從而進一步參與重癥肌無力自免過程[27]。柴胡、黃芪中的槲皮素、黨參中的木犀草素等活性成分屬于黃酮類化合物，1 項對128 種黃酮類化合物的研究表明，黃酮類化合物具有乙酰膽堿酯酶抑制活性及抗氧化活性等[28]。重癥肌無力最主要的自身抗體為乙酰膽堿受體抗體（AChRAb），可分為毒蕈堿型受體（M 受體-G 蛋白偶聯型受體）和煙堿型受體（N受體-離子通道型受體），主要存在于突觸后膜，重癥肌無力患者中AChRAb 陽性率可達85%[29-30]。研究發現槲皮素可以濃度依賴的方式競爭性抑制乙酰膽堿酯酶，減少乙酰膽堿水解以增加突觸間隙的乙酰膽堿水平，此外槲皮素還具有抗氧化應激、抗炎及免疫調節等廣泛的藥理作用，可以降低（IL-1β、IL-6 及TNF-α 等的表達，從而減輕神經炎癥及凋亡神經元細胞死亡[31-37]。異鼠李素可抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放以抑制炎癥反應，并能增強神經突觸可塑性，用于多種神經系統疾病，其衍生物也具有抗乙酰膽堿酯酶活性潛力[38-40]。實驗證明山柰酚可以降低促炎因子TNF-α、IL-1β 表達從而起到抗炎的作用，Beg 等[41-42]研究發現，山柰酚可降低阿爾茲海默癥果蠅的氧化應激及乙酰膽堿酯酶活性。木犀草素可通過抑制活性氧（ROS）/硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）/ NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）信號通路激活，降低血清白細胞介素-18（IL-18）、IL-1β 及TNF-α 水平，減輕炎癥反應與氧化應激[43]。黃芪中的黃芪總皂苷成分，雖然非本藥物核心組合的核心藥物成分（連接度=5），但最新研究表明其可通過調控細胞因子分泌的水平，如抑制IL-1β 表達等起到神經保護及修復的作用，其在重癥肌無力治療中的作用機制可進一步深入研究[44]。網絡藥理學分析結果及上述研究闡明了核心藥物組合“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”治療重癥肌無力具有多成分的特點，為研究中藥復方治療重癥肌無力的物質基礎提供了參考。

PPI 網絡提示，核心活性成分主要作用于AKT1、EGFR、FOS、JUN、MYC、IL6、TNF、CASP3、IL1B、CRP、TP53 等靶點，對疾病藥物共同靶點的KEGG 富集分析結果提示，核心藥物組合主要通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、Th17 細胞分化信號通路及C-型凝集素受體信號通路發揮對重癥肌無力的治療作用。肌肉特異性酪氨酸肌酶（MuSK）在突觸成熟、乙酰膽堿受體（AChR）聚集及維持神經肌肉結構中發揮著重要作用，約1%～4%重癥肌無力患者血清中可檢測出MuSK 抗體[4，45]。研究表明AChR+和MuSK +MG 中血清中微小核糖核酸（miRNA）表達水平與健康對照組存在統計學差異，其中MuSK +MG 相關的血清miRNA（miR-151a-3p、miR-423-5p）與FOS、JUN 蛋白的結合位點最多，相關轉錄激活因子AP-1（AP-1）轉錄因子（FOS、JUN 等）參與了重癥肌無力相關自身免疫通路[46-47]。CASP3 可調節Ⅱ型干擾素（IIFN）信號通路，激活JAK 激酶（JAK）信號傳感器和信號傳導及轉錄激活蛋白（STAT）途徑激活子，導致干擾素刺激基因（ISGs）的轉錄，從而校準宿主防御，并限制組織損傷和防止自身免疫[48-49]。

多項研究表明，TNF 信號通路與重癥肌無力的發病相關，TNF-γ 可誘導T 細胞及B 細胞活化增殖，并產生抗乙酰膽堿受體抗體，破壞神經肌肉接頭功能，TNF-α 可正性調節T 細胞及B 細胞的增殖分化，不同程度重癥肌無力患者血清中TNF-α 含量均高于正常對照組[50-53]。Interfinger 等[54]研究發現系統性產生TNF 的CD103+Th 細胞是重癥肌無力的特征性Th 細胞亞群，且與臨床疾病嚴重程度之間存在顯著的負相關關系。體內IL-1β 與TNF-α 相互誘導產生，IL-1β 的過表達會促進TNF-α 表達水平，因而IL-1β 通過影響TNF 信號通路也可參與重癥肌無力自免過程[55]。研究發現Akt1 可通過調控磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/Akt/NF-κB 信號通路減輕細胞炎癥反應，抑制Akt1 表達后TNF-α、IL-6 蛋白的表達水平顯著升高，可通過影響干擾素水平及細胞因子參與到重癥肌無力的發病過程中[56]。對重癥肌無力患者血清炎癥介質水平及其壓力性損傷程度相關性的研究中發現，患者血清超敏C 反應蛋白（hs-CRP）、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均與壓力性損傷程度呈正相關[57]。

胸腺相關重癥肌無力約占重癥肌無力的10%～15%，研究表明自身免疫調節因子（Aire）表達水平與胸腺瘤相關重癥肌無力存在關聯[4，58]。Bian 等[59]對于98 例胸腺瘤患者的研究表明，胸腺切除后患者TP53 水平下降，考慮TP53 為胸腺瘤預后因素，參與胸腺瘤相關重癥肌無力。EGFR 為表皮生長因子受體，在胸腺瘤及胸腺癌中高表達，研究發現胸腺瘤患者中EGFR 高表達者共患重癥肌無力幾率更高[60-61]。對胸腺瘤及腫瘤差異基因表達的研究發現，胸腺組織中c-MYC 基因表達陽性率高于對照組[62]。因此推測中藥復方成分治療胸腺相關型重癥肌無力可通過EGFR、TP53、MYC 等相關靶點。分子對接結果提示藥物組合關鍵活性成分與EGFR 靶點的對接結合能最低，結合能力最強，其中7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR 分子對接最低結合能為-9.5 kcal/mol（見圖12），研究表明[63]EGFR 抑制劑吉非替尼對胸腺瘤具有良好的治療作用，吉非替尼與EGFR 分子對接最低結合能為-8.9 kcal/mol （見圖13），提示藥物組合關鍵活性成分與EGFR 結合穩定，“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”可能通過靶向EGFR 治療胸腺相關型重癥肌無力。

Th17 細胞是一種CD4+T 細胞亞群，以特異性分泌高水平IL-17 為特征，Th17 可分泌IL-17、IL-22、IL-6 及TNF-α 等細胞因子，參與Th1/Th2 細胞因子的調節，促進B 細胞合成并分泌大量自身免疫性抗體，加速重癥肌無力的發病[64-65]。p38α MAPK 可通過整合樹突狀細胞中的多種信號調節介導自身免疫的輔助T 細胞分化為程序化樹突狀細胞依賴的Th17 細胞[66]。Toll 樣受體（TLR）參與非特異性免疫，可影響固有免疫細胞活化，表達和分泌TNF-α、IL-12、IL-6 等促炎因子，并影響Treg 細胞向Th17 分化，動物實驗也證明阻斷TLR9 信號可減輕實驗性自身免疫性重癥肌無力（EMAG）小鼠重癥肌無力的癥狀[67-68]。Aricha 等[69]研究發現，注射抗IL-6 抗體可下調EMAG 小鼠Th17 相關基因表達。C 型凝集素受體（CLR）在樹突狀細胞的攝取糖蛋白、呈遞抗原信息過程中發揮重要作用，從而調節自身免疫、感染等，CLR 與TLR 的相互作用也參與了對DC 功能的調控[70-71]。上述研究提示核心藥物成分可能通過靶向IL-6、參與MAPK 調控等作用于IL-17 信號通路、Th17 細胞分化、T 細胞受體信號通路、C 型凝集素受體信號通路從而用于治療重癥肌無力。GO 富集分析結果提示核心藥物組合可能通過參與MAPK 級聯正向調控、腺發育、對激素及活性氧的反應等生物過程，作用于突觸后膜等細胞成分，影響G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、突觸后神經遞質受體活性等分子功能治療重癥肌無力。

上述研究結果共同提示了復方藥物組合 “柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”治療重癥肌無力具有多成分，多靶點共同作用的特點。分子對接結果顯示核心藥物成分與主要靶點的平均分子對接結合能為-6.23 Kcal/mol<-5.0 Kcal/mol，結合活性均較強，說明核心藥物成分與核心靶點對接穩定。

綜上所述，本研究通過對中藥復方治療重癥肌無力的數據挖掘，揭示了重癥肌無力先天稟賦不足，后天失調的病因，治療上重視補益虛損，養血榮筋，注重肝腎、脾胃先后天同調的用藥規律，并總結出治療重癥肌無力的核心中藥復方藥物組合“柴胡-當歸-黃芪-黨參-白術-升麻”，并通過網絡藥理學發現核心藥物組合可能是通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、甲氧異黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇及毛蕊異黃酮等化合物與主要靶點AKT1、EGFR、FOS、JUN、MYC、IL -6、TNF、CASP3、IL -1β、CRP 的作用，并由IL-17 信號通路、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、Th17 細胞分化及C-型凝集素受體信號通路，通過參與腺發育，對激素及活性氧的反應等生物過程，作用于突觸后膜等細胞成分，影響G 蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、突觸后神經遞質受體活性等分子功能，從而起到對重癥肌無力的治療作用，可為后續中藥復方治療重癥肌無力的機制研究提供思路與參考。