基于細胞自噬的中醫藥治療帕金森病的研究進展*

張敬雯 范仙靈 王楠 張子騰 楊一帆,2 賈妮,2 閆詠梅,2

(1陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712000;2陜西中醫藥大學附屬醫院,陜西 咸陽 712000)

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一類以黑質多巴胺能神經元的進行性丟失為特征的神經退行性疾病,截止目前全球PD患者的總人數已超過610萬[1],已成為世界第二常見的神經系統退行性改變的疾病。越來越多的證據表明,細胞自噬受損可能在PD的發病機制中發揮關鍵作用。自噬是維持蛋白質穩態和清除受損細胞器的關鍵細胞過程,功能失調的自噬與異常蛋白質聚集體的積累和線粒體質量控制機制的損害有關,并可能導致神經變性。中醫藥在包括PD在內的神經系統退行性病變的治療上經驗頗豐,臨床效果顯著,一系列研究均顯示中醫藥治療可能通過干預細胞自噬的過程從而抑制PD的產生及進程。因此,本文從中藥單體、中藥復方、針灸等中醫藥治療方法回顧目前對PD發病與自噬功能障礙的作用的科學認識,對中醫藥治療PD相關細胞自噬研究進行綜述,明確中醫藥調節自噬過程的機制,以期為PD患者提供新的治療途徑。

1 PD發病與細胞自噬

PD又名震顫麻痹,是一類以黑質多巴胺能神經元的進行性病變為特征的神經退行性疾病,主要發病機制為α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的異常聚集、氧化應激、線粒體功能障礙、重復激酶2(leucine rich repeat kinase 2,LRRK2)基因突變、神經炎癥及腸道菌群的失調等導致多巴胺能神經元變性[2],然而其具體發病機制仍未闡明。細胞自噬在PD的體內和體外模型中均已被證實可防止神經變性,為臨床治療PD提供了新的思路。

自噬是一種去除多余或有缺陷的細胞成分的降解過程,通過細胞內或細胞外信號的整合啟動。在生長因子剝奪或營養不足的條件下,核心自噬蛋白和微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈 3 (LC3-Ⅰ)脂化形成膜結合的脂化形式(LC3-Ⅱ),吞噬膜擴張形成自噬體,待其完全成熟以后就會完全吞噬靶蛋白和細胞器并與溶酶體融合,其中蛋白酶降解內部成分,然后釋放產生氨基酸和脂質,供細胞循環利用[3]。在哺乳動物細胞中,存在三種類型的自噬:巨自噬、伴侶蛋白介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和微自噬。巨自噬是自噬的主要類型,通過形成自噬體并與溶酶體融合促進降解發生;CMA是需要在特定分子伴侶如HSCP70等協助下完成的自噬過程;微自噬是經溶酶體膜直接包裹入溶酶體內,經過溶解酶水解后降解內容物。一般而言,自噬指的就是巨自噬[4]。

蛋白質聚集體在中樞神經系統大量積聚為 PD的病理特征,而α-syn是蛋白質聚集體的主要成分。α-syn水平異常會損害吞噬體與溶酶體的融合,其過度表達會導致 SNAP29(介導自噬體-溶酶體融合的關鍵因素)水平降低,從而損害自噬體和溶酶體之間的整合,而SNAP29共表達能夠逆轉α-syn誘導的自噬周轉,減少神經元死亡[5]。PD中自噬途徑的失調表明受損的蛋白質降解系統與LBs中α-syn和其他蛋白質的積累之間存在聯系。自噬缺陷或通量阻斷不僅會導致PD基因編碼的蛋白質的功能失調,還會加劇α-syn和 tau聚集,形成雙向致病循環。α-syn與氧化應激、細胞自噬的調節均相關,過高的氧化應激水平會導致α-syn病理性擴散出現線粒體功能障礙,而自噬可以清除α-syn。而自噬異常也影響PD患者體內氧化應激和線粒體功能。一項研究提供了PD患者大腦自噬、CMA和線粒體受損的證據,即在PD患者黑質的多巴胺能神經元中觀察到自噬變性,并在超微結構下顯示出線粒體被大量磷酸化 ERK 標記[3]。LRRK2基因突變是遺傳性PD患者的常見病因,但無論PD患者是否存在LRRK2突變,其腦內均存在LRRK2過度激活[6]。當LRRK2蛋白的過度表達激活巨自噬,通過鈣相關途徑誘導自身吞噬體形成的持續增加,并增加了自噬受體p62的水平。在正常情況下,野生型LRRK2可被CMA降解,但致病性突變體以及高濃度的野生型LRRK2可通過抑制溶酶體膜上的易位復合物來阻斷CMA[7]。攜帶GBA1突變的PD患者自噬通量也會受到干擾,影響自噬體清除導致α-syn水平升高[8]。DJ-1蛋白通過調節氧化應激等方式調節線粒體功能,研究發現DJ-1蛋白可激活自噬過程來保護多巴能神經元免受線粒體功能障礙和氧化應激的影響,若DJ-1功能喪失會直接影響細胞氧化還原狀態而影響自噬通量[9]。LRRK2、GBA1、DJ-1等基因突變會引起PD患者線粒體功能障礙和自噬異常,從而影響疾病進展。

當使用自噬化學誘導劑時[10-11],在PD的體內和體外模型中均觀察到激活自噬可減輕神經變性,所以自噬的上調被廣泛認為是一種有前途的治療策略。

2 細胞自噬的中醫機制

氣是人體構成和生命維持的物質基礎,若氣虛則氣血津液推動無力,機體各處無法得到精微物質的滋養。此時,細胞可以通過自噬的方式溶解錯誤疊加的蛋白質和破損的細菌器,以供應生命所需的精微物質,進而達到陰陽平衡。顏培正等[12-13]主張,人體各個系統間的信息傳輸依賴于氣,同時自噬通過激酶級聯信號傳導,展示出其所控制的生理功能,這兩者在生物學角度有相似之處。廣泛意義上的細胞自噬過程包含了許多氣體活動的元素,同時,這些氣體活動也可能會對其產生一定的影響。如果肺部主要負責調節氣的正常運行,那么當其出現氣虛時,就可能導致氣機的紊亂,進而干擾到自噬信號的傳遞和表達,最后有可能引發自噬的不平衡狀態。另外,脾臟和腎臟的功能異?；蛘唧w內的痰濕過盛都有可能加劇肺氣虛現象。而肺氣虛、肺衛功能受損以及自噬失衡等情況,都會給人類身體的防衛能力帶來負面效應,使得人們更容易遭受外來病原體的入侵。

中醫學認為脾為后天之本,主運化,意為脾主導身體的代謝和轉化。若脾失健運,則其運化水谷精微之能力將逐漸減弱,導致臟腑機體無法獲得必要的滋養[14],脾虛日久,化生痰濁且無法及時清除。采用健脾祛痰療法可以激發細胞的自噬能力,清除體內的有害細胞器和錯誤的折疊蛋白,進而將痰濁和其他病理代謝產物排出體外,調整身體的偏性并恢復其自我調控能力,從而實現陰陽平衡[15-16]。由此可見,通過調節細胞自噬能力恢復機體能量代謝正常和調節中醫脾胃運化功能從而恢復運化水谷精微之能力存在一定關聯,故自噬缺失可以看作是脾胃功能衰退的微觀基礎。

人體是陰陽對立統一的整體,自噬水平失衡出現自噬不足或自噬過度的病理表現,可以類比到中醫所說的陰陽失衡概念。近代中醫學者研究提出3種支持觀點:一是將細胞自噬這個病理生理現象看作是從微觀層面上反映出人體對陰陽平衡的調整;二是細胞自噬消除有害物質并修正自身的方式被視為一個體現機體內陰陽相互協調的微觀機制;三是引發細胞自噬性凋亡的過程可以理解為個體的陰陽失衡表現[17-18]。中醫注重陰陽平衡,若陰陽失衡,身體內部可能出現機能失調的情況,自噬能夠清除胞內廢物并保持平衡和穩態,有助于修正陰陽失衡,以糾正邪盛正衰的不平衡狀態,實現機體自我調整。

3 中醫藥調控細胞自噬對PD的作用

PD 傳統治療方案以口服左旋多巴治療為主,但這僅能改善患者的運動癥狀,并不能延緩或阻止PD的病程進展,長期使用還會出現一系列不良反應及并發癥,影響患者的生活質量。因此,尋求新的治療思路至關重要。根據PD的臨床具體表現可將歸納為中醫學“顫證”的類別,顫證病位多責之于肝、脾、腎三臟,其病理性質當為本虛標實,多由患者年齡、思維情志等因素日久導致機體氣、血、津、液虧虛,筋脈失于濡養,風氣內動,或熱盛動風,擾亂筋脈而發為肢體顫動,故名“顫證”[19]。臨床治療PD多從臟腑入手,治其“本虛”而“標實”則愈,根據其證型的差異而采取不同的治法,以五臟氣血陰陽為核心,盡量調節全身使機體達到“陰平陽秘”,從而緩解PD的臨床癥狀[20]。當前不少臨床研究結果已顯示,常規治療結合中醫藥治療方法可顯著提高PD臨床療效,同時降低不良反應及副作用,常用的治療手段有中藥單體、復方、針刺等,有操作簡便、有效、耐受的優點。

中醫藥能夠通過多重通路提高自噬蛋白表達,促進細胞自噬,減少細胞凋亡,防止由黑質多巴胺能神經元變性引起的神經病變,改善PD患者臨床癥狀,多項現代研究結果均已表明,中醫藥治療PD的機制可能是通過調控細胞自噬手段來實現的,其中中藥單體、復方[21-22]和針灸療法[23]的研究最多,也較為透徹。

3.1中藥單體調控細胞自噬對PD的作用 研究顯示山奈酚能有效改善PD模型小鼠的運動及行為學障礙,保護小鼠多巴胺能神經元內細胞器的完整性,維持自噬小體形態,并通過調節mTOR通路中TH蛋白和Beclin-1、LC3等自噬蛋白表達,降低p62、cleaved Caspase-3凋亡相關蛋白表達,發揮對PD模型小鼠的保護作用[24]。厚樸酚(厚樸活性成分)能激活自噬上游AMPK/SIRT1通路,使得p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1上調,逆轉Bcl-2/Bax比值,減少細胞凋亡,改善小鼠行為學障礙。同樣,石菖蒲揮發油亦能對AKT/mTOR通路起到抑制作用,產生和厚樸酚相似的神經保護作用[25]。而姜黃素則是通過改善MPP+誘導SH-SY5Y的PD模型細胞存活率,抑制PI3K和下游Akt磷酸化,降低p-mTOR表達水平誘導自噬發生,清除α-syn從而增加多巴胺能神經元存活數,來保護PD細胞模型[26]。白藜蘆醇(虎杖的有效成分)可防止 SH-SY5Y 細胞中魚藤酮誘導的細胞凋亡,并通過自噬誘導增強表達 α-syn的 PC12 細胞系中 α-syn的降解,這種效應被 Beclin-1 敲低或溶酶體抑制所逆轉,表明巨自噬對于白藜蘆醇誘導的 α-syn 清除至關重要[27]。此外,烏梅干預6-OHDA誘導的PD大鼠,其LC3-Ⅱ、Beclin-1、BNIP3蛋白上調且上調水平與劑量呈正相關,Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶相比模型組活力明顯提高,提示烏梅通過調控線粒體自噬,發揮保護線粒體作用[28]。另外,在穿心蓮相關研究中發現其有效成分穿線蓮內酯既可以通過抑制NLRP3炎性小體減輕神經炎癥,又可以激發腦內線粒體自噬,改善PD小鼠行為學功能[29]。牟蕾使用MPTP構建斑馬魚PD模型,黃連素衍生物9-OH小檗堿可以改善其運動遲緩等行為,與下調lc3b、atg5等基因和α-syn蛋白表達有關[30]。

因此,中藥有效成分山奈酚、姜黃素、穿心蓮內酯、白藜蘆醇、厚樸酚、石菖蒲揮發油等可以通過激活線粒體自噬,增加Beclin-1、LC3等自噬蛋白表達,抑制神經炎癥而發揮保護多巴胺神經元的作用。

3.2中藥復方調控細胞自噬對PD的作用 PD的發病機制尚不明確,臨床上PD患者證型不一,中藥單體神經保護作用有限,而中藥復方遵循中醫藥辨證論治原則,療效顯著。隨著對細胞自噬與PD研究的不斷深入,越來越多研究人員開始從細胞自噬角度探索中醫藥對PD的治療機制。平肝益腎方可以促進細胞自噬,調節Beclin1、LC3B表達,抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷而保護神經元[31]。止顫湯可通過p62蛋白改善注射lactacystin制備的PD大鼠癥狀[32]。李茜羽等[33]發現蓯蓉舒痙顆粒干預增加了自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達,激活SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白表達,使黑質多巴胺神經元數目增多,腦活性氧水平降低,改善PD大鼠各項行為學障礙。加味五虎追風散可通過TFEB,使得LC3Ⅱ、P62表達量降低,緩解α-syn聚集[34]。菖蒲郁金湯能通過上調LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值,減少α-syn蛋白表達,促進神經元細胞的自噬活性,并明顯增加小鼠黑質TH陽性細胞表達,從而起到對PD小鼠的神經保護作用[35]。韋一佛等[36]用滋腎益髓方干預PD小鼠模型,結果顯示,中藥組小鼠Cath D、HSP70蛋白上調,與模型組相比有統計學意義,說明用藥后增強了CMA而治療PD。彭偉等[37]將50只大鼠分為假手術組、PD模型組、西藥組、天麻鉤藤飲高、低劑量組,研究顯示給藥8 w后大鼠黑質部Beclin1、LC3B表達強度明顯增強,α-syn減少,模型大鼠的神經損傷癥狀減輕。高鑫等[38]采用MPP+刺激SH-SY5Y細胞制備PD模型,分為對照組、模型組、拜顫停復方組、自噬抑制劑3-MA組,研究結果顯示拜顫停復方不僅可以降低Bax、Caspase等凋亡蛋白表達繼而改善細胞凋亡,同時上調Bcl-2、LC3B、Beclin蛋白促進自噬,在給予3-MA后,上述改變被逆轉,說明拜顫停復方通過促進神經元自噬,干預了自噬與凋亡平衡,反饋性抑制凋亡,從而實現神經保護的作用,進而治療PD。經方斂肝熄風止顫方,能夠抑制過度激活的CaMkkβ、p-AMPK蛋白,使得細胞不因過度自噬而破壞線粒體結構,其止顫效果隨劑量上升而增強,表明其對PD具有神經保護作用[39]。龜羚帕安丸對6-OHDA誘導的PD大鼠模型有保護作用,表現為大鼠黑質部神經元損傷減少,Beclin1、P62、LC3Ⅱ蛋白表達較模型組明顯上升[40]。

故而,中藥復方能從調節自噬與凋亡間平衡、降低細胞凋亡、避免細胞過度自噬等多種角度達到改善震顫癥狀、減輕神經損傷的效果。

3.3針刺療法調控細胞自噬對PD的作用 早在1996年,中國就率先開展了針刺治療PD的動物實驗研究,先前的研究顯示針灸治療在改善PD患者認知功能和生活質量方面有一定優勢,同時降低了藥物不良反應發生率。針刺干預PD的作用機制主要體現在增加腦內神經營養因子、減少腦內異常代謝產物、增強自噬、減少α-syn聚集、抑制神經細胞凋亡、抑制氧化應激、抑制內質網應激、調節腸道菌群及減輕神經炎癥反應等方面。吳海洋等[41]采用通督調神針刺法提高線粒體自噬水平和紋狀體中多巴胺含量,改善神經元形態,從而保護PD模型小鼠神經損傷。符之逸[42]電針針刺“百會、太沖”穴位治療MPTP誘導的PD小鼠發現,電針后可上調Agt7、p62、LC3等自噬蛋白,減弱MPTP對小鼠的神經損傷,進一步減少α-syn的表達,改善PD模型小鼠運動功能障礙。羅宇雄等[43]對魚藤酮誘導大鼠的百會、腎俞、太溪穴位每周進行1次埋線處理,5周后行為學數據顯示實驗組移動潛伏期縮短并有統計學意義,蛋白免疫印跡結果顯示LC3 B-Ⅱ/LC3 B-Ⅰ蛋白上調,p63蛋白下調并可改善細胞凋亡,降低α-syn表達,改善了PD癥狀。馬駿等[44]利用魚藤酮制備PD模型,將60只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、電針組,實驗結果表明,電針 “太沖、風府”穴后,模型大鼠CMA相關Lamp2A蛋白和Hsc70蛋白表達水平上升,α-syn聚集被抑制,大鼠PD樣癥狀得到改善。

以上實驗證據表明,針刺“太沖”“百會”“腎俞”“太溪”等穴位能抑制α-syn聚集,增加自噬相關蛋白表達,實現改善運動功能障礙的目的。

4 小結

PD困擾人群眾多,而發病病因及機制不明為臨床治療帶來極大挑戰,需要創新和整體的治療方法。近年來隨著中醫學者對PD的認識逐步加深,中醫藥治療已被越來越多地運用于此類疾病的臨床治療中,且臨床研究顯示中醫藥治療PD對改善其臨床癥狀具有顯著療效。細胞自噬是 PD 發病機制中的一個關鍵過程,目前各項研究顯示,不論是中藥單體、中藥復方或針刺等各類中醫藥療法應用越來越廣泛,利用中醫的獨特視角,多種傳統療法相結合以及個體化治療方法,通過細胞自噬干預,在溶酶體消化降解過程中清除受損細胞器和錯誤折疊蛋白質等來達到物質代謝所需,從而使細胞本身達到內穩態,細胞器不斷更新,有望增強自噬清除率并改善PD的臨床結果。自噬在PD中作用復雜,涉及氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡等多個方面,但目前研究較少,不論是中藥單體、中藥復方或針刺研究仍是以基礎研究為主,尤其是中藥單體多為體外或動物實驗,無法運用于臨床,因此更應著眼于中藥復方的深入研究,對復方進行拆分或調整,進行標準化隨機對照試驗,深挖相關信號傳導、作用靶點等機制研究,將基礎實驗與臨床研究結合起來,為中醫藥治療PD提供更多高質量的理論支撐和循證醫學證據。未來可著眼于此進一步完善中醫藥基于細胞自噬的研究,包括嚴格的科學研究和大規模、多中心的臨床試驗,為PD患者的循證中醫干預鋪平道路。