異種腎移植的亞臨床研究進展

陳羽翔 李卓騁 李濤 馬曉杰 王毅 蔣鴻濤

腎移植是治療終末期腎病的最有效途徑，同種異體腎移植雖然取得了一定成功，但腎臟來源短缺仍是限制臨床腎移植的主要障礙[1]。目前，我國為擴大移植器官來源，除腦死亡或心臟死亡器官捐獻的供者及親屬活體供者外，還納入邊緣供者、ABO血型不相容腎移植等[2]。盡管如此，仍然不能從根本上緩解腎源壓力。因此，增加腎源已成為一個亟需解決的問題。異種移植是解決器官來源短缺的根本途徑之一。隨著基因修飾工程和包括單克隆抗體在內的免疫抑制方案的發展，異種腎移植研究取得了重大的進展，豬-非人靈長類動物（non-human primate，NHP）的腎移植日趨成熟，受體猴最長存活時間已達758 d[3]。然而NHP 與人類存在較大差異，在獲得臨床試驗的經驗之前，豬-人異種腎移植的收益和風險是不明確的，并且因為生物安全和社會倫理等問題，現有條件不允許進行大規模豬-人異種腎移植。亞臨床研究是橋接基礎和臨床研究的過渡性階段，可以在更接近臨床的試驗環境中驗證既往結論，并發現、明確新的問題。自2021年起公開報道的多例豬-腦死亡受者腎移植表明異種腎移植已經進入了亞臨床研究階段[4-5]，因此有必要就目前異種腎移植亞臨床研究的進展以及所面臨的重點問題進行綜述，以期為異種腎移植發展提供方向。

1 異種腎移植供體

1.1 供體豬的基因修飾

開展異種腎移植臨床研究前必須做好針對供體動物的選擇與設計，并在異種移植模型中進行研究，以評估其安全性和有效性。盡管NHP 與人的血緣關系最近，但通常攜帶人類易感的病毒，不適合作為異種腎移植的供體。豬腎的大小、重量、解剖結構、生理指標與人類接近，繁殖快，且易進行基因修飾，是理想的供體來源[6]。但由于人和豬之間巨大的種間差異，直接進行豬到人腎移植會產生強烈的排斥反應，造成移植失敗。因此，需要對供體豬進行基因修飾，隨著CRISPR/Cas9 技術的發展，這一問題得到了部分解決。例如，敲除豬α-1,3-半乳糖基轉移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）基因可消除主要異種抗原α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）引起的超急性排斥反應[7]，敲除豬編碼聚多糖S Da的β-1,4-N-乙酰半乳糖轉移酶（β-1,4-N-acetylg alactosaminyltransferase，β4GalNT2）基因和編碼N-羥乙酰神經氨酸（N-a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d，Neu5Gc）的單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因，可減少非αGal 抗原介導的急性血管性排斥反應[8]，這種3 基因編輯豬在異種腎移植研究中使用廣泛。除此以外，還可轉入人補體調節蛋白hCD46、hCD55 等，抑制人的補體系統對移植物的殺傷作用[9]；轉入人血栓調節蛋白（human thrombomodulin，hTBM）及內皮蛋白C 受體（human endothelial protein C receptor，hEPCR），抑制微血管血栓形成，改善凝血情況[10-11]；轉入人整合素相關蛋白hCD47 以避免巨噬細胞的吞噬作用[12]；轉入人血紅素加氧酶（human hemeoxygenase，hHO）-1 用于調節免疫和抵抗炎癥[13]。包含上述9 種基因編輯的供體豬曾被認為臨床試驗的最佳選擇。

1.2 亞臨床研究的供體豬

上述這些基因的作用在大量異種移植實驗中已經得到證實，并將在豬-腦死亡受者的異種腎移植研究中逐步明確。美國阿拉巴馬大學使用了10 基因編輯豬，包括2 個人補體抑制基因（hCD55、hCD46）、2 個人抗凝血基因（hTBM、hEPCR）和2 個免疫調節基因（hCD47、hHO-1）靶向插入，以及3 個豬糖基抗原和1 個豬生長激素受體基因敲除[5]。敲除生長激素受體基因可能是因為豬異種器官的內在生長潛力會損害其原位移植后的長期功能[14]。除此以外目前仍然存在許多未知的異種抗原等待我們去探尋和識別。來自美國eGenesis 公司的Wenning Qin 和Michele E.Youd 團隊對尤卡坦半島小型豬供體進行69 次基因編輯，以實現3 種糖基抗原的消除、豬內源性逆轉錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）失活和7 個人類轉基因過表達，將該供體豬的腎臟移植到NHP 體內并與臨床相關免疫抑制方案結合，受體存活達758 d，這一研究成果使基因工程豬-人腎移植的臨床試驗更近了一步[3,15-16]。

基因編輯并非越多越好，重要的是明確每種基因的具體作用。深入探究基因的功能和編輯后的影響，有助于更精確地調控供體豬的基因組，以實現更安全有效的異種腎移植。豬或許是異種腎臟最合適的來源，供體豬基因編輯取得了令人振奮的進展，未來的研究應從臨床需求入手，探究未知抗原的同時明確相關基因的作用機制，為異種腎移植的進一步發展提供科學依據。

2 異種腎移植受體

2.1 受體選擇

2.1.1 臨床前研究的受體 自1906年開始，人們嘗試將不同動物的器官移植到人身上，但均以失敗告終[17]。隨著外科技術發展，考慮到小型動物之間更大的遺傳差異（小鼠-大鼠核苷酸差異33.4%，而獼猴-狒狒核苷酸差異2.6%）以及更低的實驗花費，研究者們逐步使用嚙齒類動物揭示異種移植的機制，包括小鼠-大鼠、倉鼠-大鼠等。盡管用嚙齒類動物實驗數據指導異種移植存在很大的局限性，但這些異種腎移植模型在闡明體液和細胞因子的機制方面作出了巨大貢獻。2012年以前約95%有關異種移植的研究都基于嚙齒類動物模型。此后NHP 受到研究者青睞，因為新的基因編輯方案使NHP 受體存活時間大大延長[3]。但即使NHP 與人類相似，仍有一定局限性，豬-NHP 移植模型僅限于對免疫抑制方案、急性排斥反應等問題進行初步探究，無法清楚地反映豬-人異種腎移植中的真實情況。

2.1.2 亞臨床研究的受體 豬-腦死亡受者是一種橋接動物實驗和臨床研究的較好選擇，雖然目前接受豬腎的腦死亡受者生存時間較短，無法進一步暴露更多諸如病毒感染、豬腎快速生長等問題[18]，但在豬-人異種移植的科學技術、社會倫理問題沒有解決時，豬-腦死亡受者模型仍是目前最直觀反映臨床問題的研究模型。對于基因修飾豬-人異種腎移植受者的選擇，目前仍未達成共識，有觀點認為，受者至少要發生某一器官衰竭，且現有的手段無法有效干預[19]。此外，受者對同種異體抗原的敏感性是腎移植中的難題，例如群體反應性抗體（panel reactive antibody，PRA）水平較高的患者，接受腎移植的機會小，且移植的預后較差，這類患者經過嚴格配型、評估后可以作為異種腎移植的潛在受者[20]。但對于早期臨床研究，在異種腎移植技術成熟以前選擇這種高致敏患者接受豬腎移植是不合適的，可能達不到預期的研究目的，因為有研究發現豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）存在交叉位點[21]，因此，高PRA 的受體中存在的抗HLA 抗體可能會與SLA 結合，形成抗原抗體復合物，激活補體系統，對移植腎造成損傷。在安全性和有效性方面，異種腎移植臨床研究應該更多地與長期透析治療相比，而非與同種異體腎移植相比，因此因血型、地域等原因，接受同種異體移植希望不大或等待時間較長的患者，可以考慮異種移植。除上述患者外，自愿參與研究的終末期腎病患者是否可以作為受者？將異種腎移植作為過渡治療是否合適？這些問題有待更多亞臨床研究來明確。

受研究條件、供受體選擇、社會倫理等問題的限制，現階段異種腎移植的亞臨床研究數量還很少，筆者未發現關于腦死亡受者術前準備的研究報道?；仡櫼呀泩蟮赖漠惙N腎移植，術前詳細的評估、合適的免疫誘導方案有助于維持移植腎功能和受體存活。從同種異體移植中取得的成果來看，圍手術期進行康復干預等措施在將來豬-人異種腎移植中或許是有效的，但目前沒有關于異種移植康復方面的文獻，因此這一猜想還需要更多研究來證明。迄今為止，已報道進行了2 例異種心臟移植。相較于異種腎移植，嚴重心臟衰竭患者缺乏有效的替代治療、供心數量少，迫使臨床不得不嘗試異種心臟移植，或許是異種心臟移植更早進入臨床的原因。而終末期腎病患者基礎條件比心臟、肺臟、肝臟衰竭的患者更好，且當移植腎發生感染、排斥反應、功能障礙時可以通過透析等方法維持直至移植腎功能完全喪失，在移植腎切除后也有可用的替代治療方案——已有研究表明在配型合適、免疫抑制方案合理時，異種腎移植對后續的同種異體腎移植可能沒有明確的危害[22]，這可能為將來臨床研究提供更多機會。腎臟功能復雜，豬腎生理功能能否滿足人的需求尚無定論，因此還需要在亞臨床研究中進行明確。

2.2 免疫抑制藥的使用

除對供體豬進行基因編輯外，免疫抑制藥的使用也是異種移植腎存活所必須的。但異種移植中哪種免疫方案效果更好、對受體負擔更小，未來的免疫抑制藥還需要關注哪些方面，仍有待在亞臨床研究中進一步探究。目前異種腎移植中常用的免疫抑制藥包括他克莫司、環孢素、霉酚酸酯（mycophenolic acid，MPA）、西羅莫司和糖皮質激素等。為了獲得更好的療效，一些新型的免疫抑制藥逐漸問世。

2.2.1 阻斷共刺激通路 CD40/CD154 是促進T 細胞活化的一種重要的共刺激通路。2016年Mohiuddin 等[23]報道了使用抗CD40 抗體的方案，基因編輯豬的心臟在狒狒體內最長存活了945 d。后續研究證明阻斷CD40/CD154 軸可促進豬心臟、腎臟和胰島的長期生存，且抗CD154 效果可能比抗CD40 效果更好[24]。

2.2.2 抑制補體系統 補體系統通過經典途徑、替代途徑、凝集素途徑以及缺血-再灌注損傷參與先天免疫和適應性免疫，可以促進巨噬細胞破壞、誘發凝血，進一步導致超急性排斥反應和血栓形成，引起移植腎廣泛缺血壞死，是異種移植中重要的識別和效應機制。雖然供體豬轉入了人補體調節蛋白如hCD46、hCD55 等，但在異種移植過程中仍然有補體系統的激活，因此需要針對性的抑制方案[25]。

C1 抑制劑對抗體介導的排斥反應（antibodymediated rejection，AMR）的治療作用在多項實驗均有探究，包括降低AMR 發生和減輕慢性AMR 損傷，且有一定安全性[26]，但因為研究結果不一致、藥物方案和樣本量不同等原因尚未真正進入臨床。蘇替利單抗（sutimlimab）是一種抗C1 單抗，通過抑制補體經典激活途徑用于治療冷凝集素病[27]。一項關于sutimlimab 的Ⅰ期臨床試驗，觀察到AMR 和補體經典通路仍有激活，但10 例腎移植受者C4d 沉積水平均有不同程度降低，腎功能和供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）未見明顯變化[28]，表明sutimlimab 有一定應用前景。

抗C5 抗體特度魯單抗（tesidolumab）也可以減輕AMR。Adams 等[29]在豬-恒河猴腎移植研究中發現，抗CD154、T 細胞耗竭、使用MPA 和糖皮質激素的免疫抑制基礎上，每周使用tesidolumab 減少了早期IgM 介導的AMR，且實驗中的恒河猴大多存活300 d 以上。

2.2.3 其他免疫抑制藥 其他正在進行異種移植研究的藥物包括抗CD38 抗體達雷木單抗（daratumumab）和貝利木單抗（belimumab）[30]。另一種新藥imlifidase能迅速清除循環IgG[31]，有一定的應用前景。初步研究表明，在高致敏NHP 中，使用imlifidase 后預存抗豬抗體水平降低[32]，但具體的結論仍需要更詳細的實驗。

2.2.4 亞臨床研究的方案 美國阿拉巴馬大學的豬-腦死亡受者的異種腎移植使用糖皮質激素、抗胸腺細胞球蛋白、利妥昔單抗用于免疫誘導，后續使用MPA 類藥物、甲潑尼龍以及他克莫司用于免疫維持，直到試驗終止未觀察到超急性排斥反應，也沒有細胞排斥反應、抗體或補體蛋白沉積的表現[5]。美國紐約大學的2 例豬-腦死亡受者腎移植使用糖皮質激素和MPA 進行免疫維持，并且在6、24、48、54 h進行活組織檢查，未發現超急性排斥反應或AMR 跡象[4]。3 例異種腎移植均未使用抗CD40 單抗，表明豬-腦死亡受者移植后并非需要很復雜的免疫抑制方案，也可能因為受者生存時間太短，部分排斥反應還沒有發生。因此今后亞臨床研究中，在條件允許的情況下可以適當延長受者觀察期，使之暴露更多潛在的問題。

2.3 術后監測和管理

與同種異體腎移植不同，異種移植腎來源是基因修飾豬，這可能需要一些新的檢測方案來明確異種移植圍手術期的各種問題?；蛐揎椮i作為供腎來源意味著許多指標的檢測可以在移植開始前進行，包括移植相關抗原和抗體的檢測以及細胞毒性實驗。除此以外，移植腎功能也需要更全面的監測方式，除同種異體移植術后常規監測的血液生化指標外，與排斥反應相關的DSA、非HLA 抗體、補體水平等都需要檢測。另外，根據豬-NHP 腎移植研究，巨噬細胞在異種移植排斥反應中發揮重要作用，因此移植術后病理活組織檢查也需要注意巨噬細胞浸潤、吞噬、極化以及細胞因子表達的情況。豬腎的生理功能也值得關注，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）、酸堿平衡等指標同樣需要納入術后監測范圍[33]。已有研究顯示豬腎素可以用人酶聯免疫吸附試驗試劑盒進行檢測[34]，但豬EPO 還沒有明確的檢測方法。豬來源的病毒感染是影響移植物存活的原因之一，因此除上述指標以外，還需要對PERV、豬巨細胞病毒/豬玫瑰狀病毒（porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus，PCMV/PRV）進行檢測，以保證移植物和受體的安全?？偟恼f來，探究未來異種腎移植需要更新哪些技術手段、納入哪些新的指標、如何評價受體狀態等問題，對異種腎移植的成功有重大意義，而這些問題有望通過亞臨床研究初步明確。

3 異種腎移植面臨的問題

盡管異種腎移植取得了一些進展，但仍面臨眾多挑戰，如排斥反應、炎癥反應、凝血功能障礙、移植腎生理功能維持、病毒感染以及異種腎移植相關的社會和倫理問題等。

3.1 排斥反應、炎癥反應與凝血功能紊亂

由于供體豬和受體存在分子差異，異種腎移植往往面臨嚴重的排斥反應，且目前雖然通過基因編輯、免疫抑制等手段克服了超急性排斥反應，但急性排斥反應仍無法避免。一方面，由于已報道的豬-腦死亡受者異種腎移植觀察時間短，未觀察到明顯的排斥反應和炎癥反應[4-5]；但另一方面，根據1 051 例NHP 同種和異種腎移植的結果來看，異種腎移植中急性排斥反應很難避免（48.6%），且以AMR 為主（45.5%）[35]。慢性排斥反應也影響異種移植腎的存活，Kim 等[36]通過耗竭CD4+T 細胞將豬-恒河猴移植腎存活時間延長至499 d，證明CD4+T 細胞是慢性排斥反應的原因之一，但具體機制仍然所知甚少。另外，在異種移植中，轉入hCD55 或hCD46 后依然觀察到補體激活，如何克服也有待進一步研究[25]。因此，開發更有針對性的免疫抑制藥以及具有免疫耐受特征的基因修飾豬仍是未來異種移植中排斥反應研究的目標。當移植腎功能障礙時，血小板數量往往降低，移植腎表現出微血栓形成和腎間質出血。且部分凝血異常與急性排斥反應損傷血管內皮細胞相關[37]，因此減少排斥反應造成的損傷，或許能夠抑制受體凝血功能紊亂。持續存在的炎癥反應是移植失敗的重要原因之一，炎癥反應與上述的凝血功能紊亂、排斥反應有一定關聯。

細胞外組蛋白在異種腎移植中的作用及其機制也需要關注。細胞外組蛋白是一種由損傷和活化的細胞釋放到胞外的正電荷蛋白質，介導組織、細胞損傷，并作為損傷相關分子模式介導炎癥、凝血障礙、免疫反應和細胞毒性。筆者團隊前期研究也發現豬-NHP 腎移植后血清中細胞外組蛋白水平升高，用白細胞介素-6 受體阻斷劑治療后可降低細胞外組蛋白和C-反應蛋白水平[38]。

采取針對炎癥發生發展的措施、使用相應炎癥介質的阻斷劑、阻斷共刺激通路可以抑制炎癥反應，同時應當關注細胞外組蛋白在異種移植中的作用，這些措施有助于延長異種移植腎存活時間[39]。

3.2 腎臟生理功能

在異種腎移植研究中，研究者們普遍認為豬腎的生理功能將對受者長期預后產生重要影響，但具體的生理功能，例如EPO 生成、RAAS 調節以及鈣磷代謝平衡等對移植腎存活及患者預后的影響還不清楚[40]。從目前研究結果來看，豬腎生成的EPO 能否對NHP起效仍未明確[41]；豬來源的腎素雖然通過受體的RAAS 發揮生理功能，但效果明顯受損——血管生成素（angiopoietin，Ang）Ⅱ和醛固酮水平降低，血鉀升高，尿液滲透性和鈉離子濃度也有不同程度降低，說明豬腎對尿液的濃縮能力下降[34]。

盡管異種移植后大多數電解質都維持在正常范圍內，但仍然面臨高血鈣、低血磷的問題[33,37]，目前還沒有研究探索豬與人或NHP 之間鈣磷調節機制的差異。除此以外，筆者團隊前期研究觀察到接受豬腎移植的獼猴出現血液碳酸氫根升高，但因為受體獼猴存活時間短，高碳酸氫根是否影響移植物存活、受體長時間存活時碳酸氫根的濃度能否恢復正常等問題暫時無法回答[42]。上述結果提示，豬腎移植到NHP 后，其生理功能或許沒有達到預期。近期報道的多例豬-人異種腎移植也因為觀察期太短，無法明確腦死亡受者是否存在上述內分泌和代謝問題。但即使這些問題可用人源化基因修飾豬、調控受體飲食或者外源性導入人EPO 等方法解決，在亞臨床研究中還是不能忽視對異種腎移植生理學的探究，包括具體機制、早期識別以及針對性的管理方案等。

3.3 病毒感染

PERV 整合在基因組中，是異種跨物種傳播的逆轉錄病毒，基因修飾豬有傳播PERV 的可能性。根據目前研究，隔離傳染源、使用抗病毒藥物治療、接種疫苗等常規手段很難減少PERV 傳播，甚至在已感染的受體細胞中，PERV 傳播能力會進一步增強[43]。在免疫抑制不可避免、PERV 無法根除的情況下，PERV 感染風險意味著移植前后應該對供體和受體進行更加嚴格的安全檢測，包括但不限于聚合酶鏈反應、Southern 印跡、熒光原位雜交、基因測序等手段[44-45]。通過CRISPR/Cas9 技術敲除已知的PERV 相關基因是否真正可行，面對未知的PERV 相關基因能否利用PERV 的共性使用特定手段進行沉默，亞臨床研究有望發現并明確PERV 新的解決辦法。

PCMV/PRV 與人皰疹病毒6A、6B、77 密切相關，在世界各地的豬群中廣泛分布[46]。美國馬里蘭大學進行的豬-人心臟移植中，觀察到這種病毒可由豬傳播給患者[47]。感染PCMV/PRV 會導致受體血小板減少、纖維蛋白原水平下降和無法控制的出血，大大影響移植物存活和受體預后[48]，因此如何檢測、清除這類病毒是異種移植需要克服的困難之一。Halecker 等[49]報道，通過逆轉錄聚合酶鏈反應及免疫學方法可以檢測并清除PCMV/PRV，雖然效率很低，但這也為后續PCMV/PRV 的研究提供了一種思路。

因此，在未來豬-腦死亡受者腎移植中，需要格外注意PERV 和PCMV/PRV 感染的問題，這種亞臨床研究相較于過去的各種動物模型，更接近于真實的臨床情境，因此有助于揭示PERV 和PCMV/PRV 感染與傳播的關鍵。在亞臨床研究中深入挖掘PERV和PCMV/PRV 感染機制，并試驗相應的預防措施，有助于提高異種腎移植的臨床安全性，推動其早日走入臨床。

3.4 社會和倫理問題

只有在社會和倫理問題得到有效解決，異種移植才能真正應用于臨床。異種腎移植中，不光受者需要重點關注，參與其中的動物權利、福祉以及社會公眾的態度也需要關注。美國食品與藥品監督管理局2022年批準了1 例豬-人的異種心臟移植[50]，這是異種移植倫理、法規的一項突破。近日國際移植協會發表的一篇特刊文章總結了30 條移植相關的基本倫理原則[51]，表明異種移植相關的法律、倫理原則正在不斷完善和適應未來發展趨勢。這也表明在正確的監管和決策評估下進行異種移植是符合倫理要求的。國外一些研究顯示，公眾對于異種器官移植的接受度為10%～90%，考慮到地區、宗教、被調查者身體狀況等問題，一些數據或許無法反映異種移植所面臨的真實社會態度。筆者團隊也進行了一項研究，納入終末期腎病等待移植的患者、腎移植術后患者、患者家屬以及醫學生4 個群體進行調查，約53.2%的受訪者明確表示“在異種腎移植與同種異體腎移植有著相同結果及風險時”能接受異種腎移植；而46.8%的受訪者態度不確定，主要原因是目前異種移植的風險尚不明確、擔心受到歧視；態度不確定的受訪者中，21%～35%在面臨無法進行同種異體腎移植或接受異種腎移植更有優勢時，態度發生了轉變[52]。提示當前面臨的社會問題有望通過推進研究、科普宣傳逐漸解決。

4 小結

異種腎移植在基礎研究中展現出巨大的應用潛力，但這些成果難以直接應用于臨床。因此，亞臨床研究作為一個過渡性階段就顯得尤為重要，不僅可以驗證實驗室內的研究成果，確保其在更接近真實世界的環境中的有效性，同時在實驗成果向臨床轉化的過程中也會暴露一些實驗室難以發現的問題，這些問題既反映了臨床的需求，同時給實驗室內的研究提供方向。目前看來，亞臨床研究中使用“9 基因豬”或“10 基因豬”可能是比較合適的，但還要進一步明確具體的作用機制，同時也需要積極探究新的異種抗原?，F階段基因修飾豬的培育周期還很長，未來如何提高產量也是值得考慮的問題。雖然將終末期腎病的志愿者或不能接受同種異體腎移植的患者作為臨床研究受者還存在爭議，但在當前亞臨床研究中腦死亡患者可能是一種較好的選擇?，F有的免疫抑制方案還不完善，未來還需要更多有效的免疫抑制藥。盡管取得了突破性的進展，但是異種腎移植供腎基因型和受體選擇尚未統一，圍手術期監測、管理方案還不明確，同時仍然面臨排斥反應、持續的炎癥反應、凝血功能紊亂、腎臟生理功能的維持以及病毒感染等問題，未來的亞臨床研究應該積極尋找可能的解決辦法，推動異種腎移植從實驗室走入臨床。