基于網絡藥理學和分子對接探討八珍湯治療乳腺癌的作用機制*

黨文軍,聶 宏,劉 爽,孔祥穎,姜雨微△

(1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

乳腺癌是乳腺組織來源的癌癥,占全球所有惡性腫瘤的7%～10%。根據2020年全球癌癥負擔數據表明,乳腺癌成為女性新發病例數1/4和死亡病例數1/6的常見惡性腫瘤[1]。在中醫學理論中并無癌癥的相關概念,現代醫學認為腫瘤相關疾病屬于中醫學概念中的“癓瘕積聚”?！鹅`樞》中記載“積之始生,得寒乃生,厥乃成積?！敝嗅t學上的“乳巖”“乳核”等病名與乳腺癌屬于同一疾病范疇。

八珍湯來源于《瑞竹堂經驗方》,為氣血雙補功效的代表方劑,適用于氣血皆虛證,為治療正虛毒盛型乳腺癌的推薦方劑。而且八珍湯的中藥組方均為國家衛生健康委員會公布的可用于保健食品的中藥或藥食同源中藥材,且方便易做,在諸多的保健藥膳方中均被推薦。有研究表明,八珍湯可以有效抑制乳腺癌細胞增長[2],促進乳腺癌患者創口愈合,改善術后焦慮、抑郁、癌性疲乏等情況[3-4]。查詢文獻,未能發現從細胞及分子水平解釋八珍湯治療乳腺癌的作用機制。在網絡藥理學的研究中,同一疾病的不同階段是由不同的基因調控,同種基因可以調控不同疾病,這與中醫的“同病異治”“異病同治”理論相一致。本研究擬通過網絡藥理學方法和分子對接技術,針對八珍湯的主要活性成分進行篩選、乳腺癌的相關靶點進行預測,探索藥物與機體的相互作用關系,揭示潛在的作用機制,為八珍湯的臨床應用及深入研究提供科學依據。

1 資料與方法

1.1八珍湯的活性成分及靶點 八珍湯方劑有藥材八味,即白芍、白術、川芎、當歸、茯苓、甘草、人參、熟地黃。利用TCMSP檢索八珍湯的藥材主要成分及靶點?？紤]中藥中并非所有成分都可以被人體吸收,參考現有文獻及平臺推薦,在檢索結果中設置限定條件,以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選閾值,得到化學成分信息作為候選活性成分。通過蛋白質數據庫Uniprot將篩選候選靶點轉化為基因名稱,并刪除不符合研究要求的靶點。

1.2乳腺癌相關疾病靶點的收集 以“breast cancer”或“breast carcinoma”為關鍵詞檢索與乳腺癌相關的靶標基因。通過在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、GenCards數據庫、DisGeNET數據庫收集疾病相關靶點。

1.3網絡模型的構建與分析 使用Cytoscape3.7.2構建“中藥-活性成分-靶點”網絡。將藥物與疾病取得交集的基因從藥物的數據中選取對應的數據,將數據導入Cytoscape軟件,得到“藥物-有效成分-靶點”網絡圖。

1.4蛋白相互作用(PPI)網絡構建與分析 將共同靶點數據輸入STRING數據庫獲取靶標PPI網絡關系,以minimum required interaction score>0.4為進行篩選標準,網絡圖中靶蛋白以節點呈現。利用Cytoscape3.7.2軟件構建PPI網絡。

1.5GO與KEGG富集分析 對藥物靶點基因進行GO和KEGG富集分析,以P<0.05為篩選標準,篩選出顯著富集的生物學注釋,并將結果繪制成氣泡圖進行可視化分析。

1.6關鍵靶點與活性成分的分子對接 從TCMSP數據庫中下載有效成分的結構式,并通過AutoDockTools軟件轉化格式后作為配體。從PDB數據庫下載蛋白受體,再通過PyMOL軟件刪除水分子和小分子配體,通過Vina軟件進行分子對接,利用PyMOL軟件對結果進行可視化分析。

2 結 果

2.1八珍湯活性成分及作用靶點 在TCMSP數據庫中檢索篩選八珍湯主要組成藥物的有效成分及靶點,共獲得相關有效成分1 034個,靶點7 661個,去除重復成分后,根據閾值OB≥30%和DL≥0.18,篩選出有效成分2 336個,選取OB≥70%的活性成分列入表1?；钚猿煞窒鄳悬c的名稱通過Uniprot數據庫轉換為基因名稱,剔除重復及非人類靶點后,共獲得211個潛在靶點。

表1 八珍湯活性成分

2.2八珍湯治療乳腺癌的潛在靶點 查詢GeneCards數據庫,設置數據標準為relevance score≥15,得到與乳腺癌相關的靶點1 229個。檢索OMIM數據庫得到相關靶點168個。檢索DisGeNET數據庫,設置數據標準為score gda≥0.3,得到相關靶點30個。將3個數據庫數據合并并刪除重復項,最終得到靶點1 268個。與“2.1項”中靶點取交集后,最終獲得乳腺癌相關靶點1 166個,八珍湯相關靶點109個,八珍湯治療乳腺癌的潛在靶點共102個。

2.3構建“藥物-有效成分-靶點”網絡圖 “藥物-有效成分-靶點”網絡圖由230個節點和1 208條邊組成,每個活性成分平均與5.25個靶點相互作用,度值大于5的活性成分有71個,其中槲皮素(quercetin)與76個靶點關聯,山柰酚(kaempferol)與30個靶點關聯,柚皮素(naringenin)與16個靶點關聯,楊梅酮(myricanone)與13個靶點關聯,β-谷甾醇(kaempferol)與12個靶點關聯,人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)與8個靶點關聯,豆甾醇(stigmasterol)與7個靶點關聯,(+)-兒茶素[(+)-catechin]與5個靶點關聯,馬卡因(inermin)與5個靶點關聯,灌木遠志酮A(frutinone A)與5個靶點關聯,原阿片堿(fumarine)與5個靶點關聯。見圖1。

注:綠色菱形代表的是乳腺癌潛在靶點,紫色橢圓形周圍是八珍湯主要成分的化合物分子。邊表示各節點之間相互作用關系,邊的數量與化合物和靶點之間的作用關系成正比。

2.4PPI網絡圖 將八珍湯作用靶點與乳腺癌作用靶點的交集基因(102個)數據導入STRING數據庫獲取靶標PPI網絡關系,此網絡包含102個節點,2 047條邊,見圖2。度值前30的關鍵靶點為TP53、AKT1、ESR1、JUN、MYC、CASP3、EGFR、HIF1A、CCND1、STAT3、TNF、HSP90AA1、IL-6、MAPK3、PTGS2、FOS、IL-1β、ERBB2、MMP9、PPARG、CASP8,度值分別為92、86、83、83、80、79、77、77、75、74、74、73、73、69、68、67、67、66、66、64、60。

注:圖形顏色越亮、圖形越大代表度值越高,說明其對應的節點在網絡中越重要。

2.5GO富集分析 對八珍湯的組方活性成分-潛在靶點網絡中的102個靶點進行GO富集分析,共有2 233條GO數據條目(P<0.05)。生物學過程(BP)條目數最多,共有2 083條,根據通路上富集到靶點數目而分析,主要集中于對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、細菌分子過程的反應(response to molecule of bacterial process)。細胞成分(CC)相關條目有40條,主要由細胞膜筏(membrane raft)、細胞膜微區(membrane microdomain)、膜區域(membrane region)。分子功能(MF)相關條目有110條,主要有泛素樣蛋白連接酶結合(ubiqutin protein ligase binding)、DNA結合轉錄激活因子的活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity/RNA polymerase Ⅱ-specific)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)。將每一類按照顯著性進行排序,排在前10的富集條目的柱狀圖和氣泡圖展示,見圖3。

圖3 GO富集分析

2.6KEGG富集分析 對八珍湯的組方活性成分-潛在靶點網絡中的102個靶點進行KEGG富集分析,共得到174條代謝通路(P<0.05)。進行KEGG富集分析,按照顯著性進行排序,排在前20的富集條目的氣泡圖見圖4。八珍湯治療乳腺癌主要涉及脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、乙型肝炎(hepatitis B)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等。顯示共同靶點主要集中于肝癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等,主要信號通路涉及IL-17、TNF信號通路等。

圖4 KEGG富集分析

2.7分子對接結果 篩選出主要3個度值較大的活性成分槲皮素、柚皮素、山柰酚,其與ATK1、CASP3關鍵靶點相互結合。其結合能均小于-5 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ),提示有效活性成分與關鍵靶點的結合活性較好,篩選的結果可靠。見表2。八珍湯抗乳腺癌的關鍵性成分與關鍵靶點的分子對接模式見圖5。

表2 核心活性成分與關鍵靶點的分子對接

3 討 論

乳腺癌成因復雜,除了癌癥細胞本身的病變之外,還與炎性因素、血管微環境、成纖維細胞等腫瘤微環境相關[5],其產物與乳腺癌上皮細胞聯系緊密。國內有研究表明,乳腺癌患者中氣血虧虛證型居多,八珍湯是補氣生血的代表方劑,主要治療氣血俱損時諸病。乳腺癌因為虛勞,脾腎虧虛,氣血生化無源[6]?，F階段對于乳腺癌的治療方法多有諸多不良反應,相比之下中醫藥的多靶點、多途徑抑制腫瘤生長的優勢逐漸體現[7]。

3.1八珍湯活性成分分析 本研究結果顯示,八珍湯有效成分2 336個、潛在靶點211個與乳腺癌相關,初步篩選出11種核心成分,槲皮素、山柰酚、柚皮素、楊梅酮、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、豆甾醇、(+)-兒茶素、馬卡因、灌木遠志酮A、原阿片堿。槲皮素為甘草的主要成分,對乳腺癌細胞具有細胞增殖、凋亡誘導、細胞周期阻滯、轉移減少、氧化應激發展、雌激素受體調節及耐藥降低功能[8],可以通過調節VEGF、PI3K/AKT/mTOR信號通路。而且伴隨著槲皮素濃度升高,其抗腫瘤的作用增強[9]。有研究表明,槲皮素可以阻滯宮頸癌Hela細胞周期于G2/M期,下調Bcl/Bax誘導細胞凋亡。山柰酚為白芍、人參、甘草的主要成分,有研究表明,山柰酚誘導三陰性乳腺癌(TNBC)細胞中乳腺癌耐藥蛋白的表達并下調抗腫瘤藥物對細胞的殺傷力[10]。柚皮素為甘草的主要成分,其可以減少癌細胞的增殖,通過細胞周期阻滯在G2/M期,下調了MDA-MB-231細胞的生長[11]。此外,其還參與了調節線粒體介導的細胞凋亡信號轉導,并在動物模型中顯示了對二甲基苯蒽誘導的乳腺癌的抗炎潛力[12]。β-谷甾醇為白芍、人參、當歸的主要成分,動物實驗表明其可以上調miR-10a表達水平,誘導細胞凋亡和抑制細胞轉移[13]。人參皂苷Rh2為人參的主要成分,可能通過mTOR、MAPK、TNF、泛素-蛋白酶體信號通路,對乳腺癌SKBR3細胞的活性進行抑制[14-15]。豆甾醇為熟地黃、人參、當歸的主要成分,可以抑制人乳腺癌細胞MCF-7的增殖。

3.2關鍵靶點分析 本研究結果顯示,八珍湯各活性成分作用于多個靶點,通過PPI網絡分析,經過篩選后關鍵靶點為TP53、AKT1、ESR1、JUN、MYC、CASP3、EGFR、HIF1A等。TP53是位于17號染色體上的基因,編碼為P53轉錄因子蛋白[16-17],在應激反應中,TP53會直接介導細胞凋亡的PUMA、NOXA、PERP和BAX等基因。TP53是乳腺癌中最常見的突變基因之一,TP53在約80%的TNBC中發生突變。AKT1靶點可以通過PI3K被胞外激活,激活AKT1可促進乳腺癌的增殖,抑制AKT1會促進腫瘤的遷移。雌激素受體(ER)是乳腺癌內分泌治療的重要靶點之一,其中ESR1為編碼ERα,約5%的原發腫瘤中存在ESR1突變,并且在轉移性環境中顯著富集(30%～40%)。ESR1突變轉移表型中可以促進癌癥的標志通路上調,包括雌激素反應、TP53通路、MTORC1信號[18]。ESR1突變細胞通過Notch信號通路富集了干細胞特性,該通路可能靶向于ESR1突變表達的腫瘤患者[19]。MYC是一種雌激素應答基因,MYC過度表達與ER+乳腺癌細胞和腫瘤模型中的激素獨立性有關。雌激素介導的MYC基因表達的誘導是通過內質網和AP-1轉錄因子激活的上游增強子。MYC癌蛋白是許多細胞信號傳導和代謝途徑的主調節因子,通過允許癌細胞在特定藥物誘導的應激下重新編程,與乳腺癌的耐藥性有關。CASP3是細胞凋亡的核心蛋白、Caspase-3是Caspase-9的下游效應體;Caspase-3可能與其他底物相互作用,并可能通過HER2信號通路調節細胞凋亡[20]。EGFR是一種受體絡氨酸激酶,參與血管生成、細胞增殖、轉移和抑制細胞的凋亡。轉錄因子HIF1A是缺氧信號傳導的典型主調控因子,在缺氧條件下易位到細胞核,并調節多種途徑,包括血管生成和糖酵解。有研究表明,在小鼠和人類中,HIF1A本身的核表達在乳腺癌腦轉移中增加,HIF1A信號通路可能在腦內乳腺癌細胞的增殖中發揮重要作用[21]。與原發性腫瘤相比,乳腺癌腦轉移面臨更深刻、更廣泛的缺氧,這可能導致它們對HIF1A信號增殖的依賴增加。

3.3活性成分與關鍵靶點作用的分析 本研究KEGG富集分析結果顯示,八珍湯治療乳腺癌涉及多個BP,主要集中在脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切力與動脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。GO富集結果顯示,通路靶點包括對類固醇激素的反應、對氧化應激的反應、對脂多糖的反應等。在PI3K-AKT通路中,TP53可以激活Bax并且促進其表達上調,進而引起下游CASP級聯反應,而AKT激活的磷酸化可以抑制BAD表達,導致Bcl-2和Bcl-xL減少,這2種調節途徑均可以導致細胞凋亡[22]。EGF與EGFR結合,可以導致EGFR二聚化,促使酪氨酸激酶催化結構域的磷酸化,磷酸化酪氨酸殘基也可激活PI3K-AKT通路[23]。類固醇激素是影響乳腺生長的重要激素,其中的ERα在乳腺癌中表達廣泛。ERα可以將DNA甲基轉移酶的表達上調,干預基因組DNA的甲基化。脂多糖可以促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長和侵襲[24]。IL-17信號通路與癌癥發展歷程也密切相關,相關研究表明,IL-17可以通過免疫細胞,產生促炎性細胞因子,間接性促進腫瘤生長[25]。IL-17的陽性表達為TNBC患者術后的獨立影響因素,與預后不良緊密相關[26]。

山柰酚可以通過破壞細胞周期來抑制細胞生長,也能抑制MCF-7乳腺癌細胞對乳酸的吸收,導致癌細胞死亡。山柰酚能有效誘導MCF-7細胞中PARP的表達,導致下調Bcl-2蛋白表達。有研究發現,乳腺癌細胞的上皮-間充質轉化會抵抗化療,從而使化療的效率降低,甚至導致化療失敗。LEE等[27]的研究結果表明,山柰酚能有效抑制內源性雌激素引起的乳腺癌轉移,山柰酚的外源性異源化合物可有效抑制E2或三氯生誘導的上皮間質轉化和轉移蛋白的表達。同時山柰酚也可作為一種較強的NRF2誘導劑,調節NRF-7細胞中NRF2及其NQO1酶的表達,從而抑制癌基因的轉化[27]。值得一提的是,山柰酚與其他果皮多酚,如楊梅素、槲皮素、紅素、兒茶素、表兒茶素、花青素或白藜蘆醇聯合使用,顯示出良好的抗癌活性。槲皮素能夠調節腫瘤相關的氧化應激反應、細胞周期停滯及腫瘤增殖、凋亡、轉移,其抗癌特性主要是通過調節VEGF、PI3K-AKT/mTOR、MAPK/ERK1/2和Wnt/β-catenin信號通路實現的。通過增加RIPK1和RIPK3的表達來誘導細胞壞死。文獻報道與本研究結果一致,分子對接結果也驗證了活性成分(山柰酚、槲皮素、柚皮素)與關鍵靶點具有較強的結合活性。表明八珍湯可以通過山柰酚、槲皮素、柚皮素等活性成分作用于AKT1、CASP3等相關靶點。

本研究針對八珍湯治療乳腺癌的作用機制進行了分析,但是研究存在一定的局限性,如KEGG富集分析結果顯示與乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路具有相關性等,缺乏研究支撐,仍需要日后進一步深入研究。本研究探討了八珍湯治療乳腺癌的可能作用機制,并篩選出關鍵靶點及信號通路,為以后八珍湯、乳腺癌的分子生物學驗證研究提供了前期基礎。