靜電紡絲復合支架在骨組織工程中的應用

王 妮,程佳佳,高 麗

(1.遵義醫科大學 口腔醫學院,貴州 遵義 563099;2.遵義醫科大學附屬口腔醫院 牙周病科,貴州 遵義 563099)

創傷、骨折、炎癥、先天性疾病或腫瘤等導致的嚴重骨缺損,因超過機體的自愈能力而難以愈合,增加了骨折風險,這不僅損害了患者的身心健康,而且加重了醫療經濟負擔。有相關文獻建議缺損長度大于2 cm或周徑損失大于50%的骨缺損,需要采取移植手術來恢復或替代缺失骨組織的形態和功能[1]。自體骨移植因具有良好的組織相容性、成骨特性及非免疫原性成為骨缺損修復的金標準,但供區損傷、供區組織數量短缺、受區難以適應解剖結構及后期畸形的缺點制約了其臨床應用[2]。骨組織工程是21世紀興起的一門新興的交叉學科,提出將種子細胞、生長因子和工程支架材料用于骨修復,為骨缺損的治療提供了一種可替代的治療方法。其中,支架材料作為替代物的物理基礎,不僅提供了利于細胞附著、增殖和分化的適宜環境,還作為骨細胞外基質沉積的載體,在骨組織工程中起著關鍵作用[3]。

靜電紡絲制備的納米纖維具有仿生細胞外基質、高比表面積、高孔隙率等特性,有助于細胞黏附、遷移,有效促進細胞間的物質交換,而納米技術能進一步提升支架在組織和器官再生方面的性能,納米結構支架比宏觀支架在組織和器官的再生方面更具優勢[4]。近年來,靜電紡絲納米纖維支架因可規?；a、低毒,以及可通過化學修飾靈活控制和微調支架的特性,而被研究應用于血管、肌肉、皮膚等組織工程的再生研究[5-7]?，F從骨組織工程和靜電紡絲技術的基本概念、靜電紡絲改性及復合支架幾個方面進行綜述,以期為靜電紡絲復合支架應用于骨缺損的修復提供理論依據。

1 骨組織工程

1.1 骨組織的生物學特點 骨組織是人體硬組織的主要構成部分,了解天然骨的生理學是成功開發骨修復支架材料的第一步。骨組織由松質骨和皮質骨構成:皮質骨主要位于骨組織的最外層,不含有機質,礦化度高,具有質量重、密度高、彈性模量高、抗壓能力強等特點;松質骨主要位于骨組織內部,由眾多小梁骨構成,質地較皮質骨軟,具有質量輕、密度低、血管密度高、高度多孔性、彈性好韌性強及拉伸強度低的特點,可容納血管、骨基質和其他有機成分,是營養物質和代謝產物運輸的通道[8]。二者結合使骨組織成為一種獨特的機械結構,能承載高水平的載荷及抗變形的能力。骨ECM的無機成分主要是羥基磷灰石晶體,約占60%;其余40%是有機基質,包括Ⅰ型膠原蛋白,糖蛋白、蛋白聚糖和非膠原蛋白、水等[9]。

1.2 骨組織形成的機制 在胚胎發育過程中,骨組織有兩種不同的成骨模式,即軟骨內骨化和膜內骨化,兩種成骨模式均可通過間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分泌細胞外基質(ECM),從而調節炎癥反應,刺激組織再生;MSCs在骨再生過程中受微環境、細胞間通信、物理因素和細胞結構的影響,可分化為成骨、成軟骨、成脂和骨髓基質細胞譜系。軟骨內骨化是指多能MSCs聚集、增殖、先分化為軟骨細胞分泌ECM形成軟骨組織,繼而分化為肥大軟骨細胞,經成骨細胞祖細胞、破骨細胞和血管吞噬吸收并被骨髓取代,形成原發性和繼發性骨化中心;隨后分化為成骨細胞,分泌一系列ECM蛋白(骨鈣素、堿性磷酸酶和類骨質),最后類骨基質層和外部鈣化外殼包裹成骨細胞,形成骨細胞,四肢及肋骨的發育和生長屬于軟骨內骨化[10]。而膜內骨化則是不形成軟骨中間層,MSCs直接分化為成骨細胞[11]。

機體骨組織在出生后為適應機械環境的變化不斷改建和重塑,骨的重塑對于骨骼保持結構完整性和適應機械應力變化至關重要。骨缺損愈合的生理過程中涉及成骨細胞、骨細胞、破骨細胞和骨襯里細胞的協同作用,調節舊骨組織吸收和新骨組織的形成。在骨折、腫瘤或感染導致的骨缺損部位,成骨細胞負責合成、鈣化形成新骨,是參與新骨形成的主要細胞[8]。

1.3 骨組織工程 骨組織工程(bone tissue engineering,BTE)是建立具有高孔隙率和可控孔徑大小的三維支架,可將種子細胞植入其中或利用內源性干細胞的分化潛能,從而促進骨組織再生。近年來,隨著材料和制造工藝的進步,BTE逐漸成為治療臨界骨缺損(critical size bone defect,CSBD)的一種非?？尚械姆椒?不僅可以修復受損的骨骼,還可以克服當前臨床治療的局限性,如自體骨、同種異體骨的缺如等。骨生物支架材料的構建是BTE的難點,目前關于骨生物支架的研究方興未艾。在支架的設計上應考慮到以下幾點:(1)生物安全性:其本身或降解產物對機體應是安全無毒害的。(2)生物相容性:利于細胞黏附和增殖。(3)生物降解性:可程序化替代骨樣沉積的支架材料。(4)3D多孔結構:利于細胞滲透,物質交換以及血管生成所需合適的孔隙率和孔徑結構。(5)無菌性且不喪失生物活性。(6)可控性釋放生物活性分子或藥物。(7)機械性能:骨改建過程中能承受外部載荷和應力,由降解引起的機械性能變化都應保持與愈合或再生過程的相容性[12]。

2 靜電紡絲

2.1 靜電紡絲 靜電紡絲是一種最普遍、便捷、經濟實惠的制造納米纖維支架的方法[13]。靜電紡絲是利用高壓電源克服聚合物溶液的粘性,從液體表面噴出帶電液體射流的技術。該技術的基本原理是高壓電源對注射器針頭的溶液施加靜電力,當靜電力超過液體表面張力時,旋轉的液滴在針頭尖端變形,形成“泰勒錐”。當作用力超過錐形液滴表面張力的臨界值時,形成射流,同時,紡絲液中的溶劑揮發,直徑從幾十納米到幾微米(取決于聚合物溶液和靜電紡絲參數)的連續聚合物纖維沉積在集電極上[14]。靜電紡絲制備的納米纖維支架具有應用于骨組織再生的突出優勢,其在結構上類似于天然骨ECM中發現的分層組織微/納米級纖維結構,其多孔結構及高比表面積可負載種子細胞和生物活性分子可以促進細胞黏附、增殖和分化,且生產過程中可以控制纖維直徑、纖維取向、孔隙率等特性從而改善支架的性質[15]。

2.2 靜電紡絲基質 近年來,靜電紡絲制備的可生物降解聚合物支架可以避免二次手術,在骨組織再生醫學領域受到特別關注,根據其材料來源分為天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物根據其組成分為蛋白質類材料(如膠原、明膠和絲素蛋白)和多糖類材料(如纖維素、殼聚糖),大多數天然聚合物具有良好的生物相容性有助于細胞黏附及增殖[16]。但天然聚合物制備的靜電紡絲支架存在機械性能、生物降解性難以控制的缺點,無法為成骨細胞提供足夠的結構支持和保護。此外,部分天然聚合物易受材料性質限制。例如,透明質酸因其優異的生物相容性、生物黏附性和低免疫原性等生物學特性而備受關注,但其機械強度相對較低,并且作為聚電解質還具有大量的自由電荷載流,該特性使得純透明質酸難以被紡絲成膜[17]。具有優良力學性能和紡絲能力強的合成聚合物,如聚乳酸(polylactic acid, PLA),聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)和聚己內酯(polycaprolactone, PCL)及其共聚物組成等,其可以通過改變材料的單體單位、反應條件、共聚物的比例和濃度來控制和調整合成聚合物的力學特性、降解速率、可加工性、混溶性等性質,具有可預測和復制的機械和物理性能;其制備的靜電紡絲支架在大多情況下不表現出毒性作用,但其表面的性質(例如形貌、親水性、電荷)不能促進細胞黏附、增殖和分化;并且缺乏天然ECM的生物活性,表現為體內排斥率增加,骨再生能力低[18-19]。有研究報道,PCL具有優異的機械性能滿足許多骨科應用的機械需求,然而,由于其高度疏水性和細胞識別位點的缺失導致細胞黏附性差,這導致支架的骨傳導性差[20]。

3 靜電紡絲的改性方法

近年來,靜電紡絲技術因為能夠使可生物降解聚合物支架滿足特定組織再生所需要求,并賦予支架生物活性功能,逐漸成為骨組織支架材料的研究熱點。而單一聚合物制備的支架通常不能達到理想的骨再生效果,通常需要采用生物活性物質、藥物、無機生物材料等對其表面和結構進行進一步修飾以改善其生物功能可將聚合物轉化為具有生物活性功能的仿生支架。

3.1 生物活性分子 生物活性分子是構成組織工程(tissue engineering, TE)的三大支柱之一,能顯著影響支架特性和細胞行為。從組織工程的角度來看,生物活性分子是改善支架特性、影響細胞活性的生物因子或信號,從而促進目標組織更好、更密集的再生。因此,生物活性分子主要通過增加細胞黏附、增殖和分化來提高靜電紡絲支架生物相容性[21]。

3.1.1 細胞來源細胞外基質 細胞來源的細胞外基質包含復雜且有組織的大分子混合物,可以模仿天然細胞微環境來維持細胞表型及功能,可通過選擇用于生成ECM的細胞類型、培養系統、應用外部刺激調節產生ECM,以及對源細胞進行遺傳修飾以增強或沉默靶分子表達的能力來定制表面的細胞行為[22]。細胞來源的ECM富含膠原蛋白、基質大分子和生長因子,具有良好的生物相容性和生物降解性,有利于MSCs的增殖和成骨分化。用ECM改性的聚合物支架可以在材料和組織之間的界面上呈遞ECM分子來促進干細胞成骨分化。如Carvalho等[23]研究了負載人間充質干細胞(HMSCs),人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)來源的ECM的PCL靜電紡絲支架對MSCs成骨分化的作用,實驗結果表明,兩種細胞來源的ECM的PCL靜電紡絲支架具有相似的物理/機械特性,都促進了細胞增殖,并且當支架同時負載兩種ECM時的微結構更接近天然骨微環境而能夠刺激MSCs的Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor, Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin, OCN)等成骨標志物的表達更高,更有利于細胞成骨分化,表現出更加優異的成骨潛能。

3.1.2 富血小板纖維蛋白 富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin, PRF)是第二代血小板濃縮物,已被證明可以促進成骨細胞的增殖和Runx2、ALP、OCN等成骨基因的表達,在骨形成中具有重要作用[24]。然而其單獨用于骨再生時,其成骨能力有限。Rastegar等[25]用同軸靜電紡絲的方法制備了含富血小板纖維蛋白的PCL/殼聚糖(PCL/CS-PRF)核殼納米纖維支架,PRF的摻入增加了純PCL/CS的機械性能、親水性、孔隙率等,并且PRF還能緩慢且持續的釋放影響HMSCs的成骨分化,含PRF的支架上ALP活性值和鈣沉積量顯著高于純支架組,PCL/CS-PRF核殼支架可以為骨組織工程應用提供具有改善成骨作用的堅固結構。

3.1.3 透明質酸 透明質酸(hyaluronic acid, HA)是一種線性糖胺聚糖聚合物,存在于脊椎動物組織的細胞外基質中,包括結締組織、上皮組織和神經組織;參與多種生物學過程,如胚胎發育、傷口愈合、癌癥進展、血管生成、炎癥和骨再生[26]。研究發現,透明質酸可調節細胞粘附、增殖和分化等重要細胞過程[27]。因此透明質酸通常與另一種聚合物結合,以制備靜電紡絲支架。如Rachmiel[28]等使用靜電紡絲技術制備了一種由PCL聚合物和HA組成的核/殼形態的復合支架,并結合了自組裝短肽,該肽包含精氨酸——甘氨酸——天冬氨酸(RGD)基序,將HA和RGD序列的良好生物相容性和細胞附著特性賦予到PCL基支架中,且合成的纖維支架在形態上類似于骨ECM的纖維狀結構,體外實驗也表明了HA和RGD的添加確實提高了PCL支架的生物相容性,且MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性及鈣化物沉積顯著增加也表明該支架能促進成骨分化。

3.1.4 成纖維細胞生長因子-2 組織工程化引導組織再生膜不可避免的缺點是種子細胞在體外擴增過程中容易喪失分化能力。添加適量的生長因子在支架中是一種維持種子細胞分化能力的重要的方法,可以有效促進骨修復。成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)是1種眾所周知的促進血管生成的生長因子,有研究證明了 FGF-2能促進體內牙周骨組織生成[29]。Zhang 等[30]采用靜電紡絲法制備的負載FGF-2的水性聚氨酯(WPU)纖維支架。結果證實,通過控制支架降解及力學性能,實現了生長因子的持續釋放,血管生成相關因子的免疫組化結果表達呈陽性,表明負載在纖維中的FGF-2可顯著促進細胞血管形成,負載FGF-2的纖維支架具有作為功能性GBR膜的潛力,以促進牙周修復過程中骨外血管的形成。

3.2 藥物 靜電紡絲可作為藥物運輸載體,通過在靶點位控制和優先釋放藥物來提高其生物利用度和功效,并增強其穩定性和溶解度[14]。靜電紡絲可輸送具有成骨功能的藥物到骨缺損區,以最大程度發揮成骨效應,且部分藥物還能發揮抗炎抗菌等多種功效。

3.2.1 米諾環素 米諾環素(minocycline, MINO)是對抗大多數牙周炎致病菌最常用的廣譜抗生素之一。除了抗菌活性外,MINO還可以抑制骨吸收并促進骨形成。Ma等[31]制備負載MINO的PLGA靜電紡絲膜,體外實驗研究表明含有2%藥物的MINO-PLGA膜更有利于成骨細胞增殖和粘附,隨后的體內實驗性牙周炎模型的研究結果也表明.MINO-PLGA膜增加牙周炎模型的牙槽嵴高度,抑制核因子-κB受體激活物(RANKL)配體的表達,促進骨保護素的表達,具有促進牙周炎患者的骨再生的潛力。

3.2.2 糖皮質激素 地塞米松 (dexamethasone, DEX) 是一種合成糖皮質激素,已被用于誘導骨髓干細胞 (BMSC) 的成骨分化,然而,高濃度的DEX可以抑制成骨細胞的增殖,甚至誘發毒副作用[32]。骨組織工程的一種常用方法將分化因子如抗壞血酸和DEX添加在靜電紡絲上,從而增加維持干細胞在體外分化時間。DEX是一種合成的糖皮質激素,在骨分化中也扮演著重要角色,如果將 DEX從培養物中完全去除,HMSCs 則不會發生分化。Omidvar等[33]研究用殼聚糖微球(CSM)封裝Dex,將其嵌入到PCL支架中,形成PCL/CSMs-Dex復合支架,由于其核殼結構,致使Dex 能在 14 d內持續釋放,不會出現明顯的突發釋放,可以延長釋放時間并消除初始爆發;在CSMs存在下,PCL支架的水接觸角從141.4 ± 3.8減小到118.4 ± 7.6, PCL的親水性明顯提高,hMSC在PCL/CSMs-Dex支架上的增殖也有所改善。此外,成骨測定顯示堿性磷酸酶活性和礦物質沉積物增加,骨特異性基因的表達也有所增加。

3.2.3 辛伐他汀 辛伐他汀(simvastatin,SIM)是一種降膽固醇藥物,可通過增加成骨細胞樣細胞和干細胞中BMP-2、ALP、骨鈣素和COL1mRNA的表達來支持成骨細胞分化并促進新骨形成,同時增加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進血管生成[34]。在引導骨組織再生(GBR)中,理想的屏障膜應由兩個表面組成:面向骨缺損的多孔表面用于引導骨形成,面向軟組織的致密表面用以防止非成骨細胞(如成纖維細胞)干擾骨愈合。傳統采用共混的靜電紡絲方法缺點一是暴露于有機溶劑的生物活性分子在靜電紡絲過程中容易變性,二是缺乏持續緩釋能力。Yu 等[35]用同軸靜電紡絲的方法制備了一種新型的具有致密層及多孔層PCL-明膠/PCL-辛伐他汀屏障膜,將骨髓間充質干細胞(BMMSCs)和人包皮成纖維細胞(HFFs-1)分別接種在多孔層和致密層表面,共聚焦圖像顯示致密層有效的阻止了成纖維細胞的浸潤,從藥物釋放曲線也證明了同軸靜電紡絲實現了可控的藥物持續緩釋,且7 d時Cbf-α1及ALP成骨基因表達也顯著提高,主要是通過提高膜的屏障功能及辛伐他汀的釋放促進骨再生。

3.3 無機生物材料 無機生物材料具有特殊的成分、微觀結構和長期可重復性,已被建議用于修復或替代肌肉骨骼系統和牙周異常的病變和受損部分[36]。無機生物材料因其生物相容性、骨傳導性和生物可吸收性而得到認可,可用于改善聚合物靜電紡絲支架表面拓撲結構、機械性能及生物相容性等。

3.3.1 生物陶瓷 羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)屬于無機生物陶瓷材料,其化學成分和晶體結構與天然骨礦物質相似,具有生物活性、骨傳導性和可生物降解性,已被廣泛用作人工骨替代物。然而,由于脆性大,斷裂韌性不足等缺點,純HA支架的使用受到限制[37]。而與聚合物形成復合支架能獲得更優良的生物性能及機械性能,如de Siqueira等[38]通過靜電紡絲法以聚L -乳酸(PLLA)/聚己內酯(PCL)纖維為基材,結合電噴涂羥基磷灰石(HA),開發了定向和非定向排列的組織工程支架。研究發現在PLLA/PCL/HA支架中,HA的引入顯著提高了這種材料的機械強度。此外,將成骨細胞(MC3T3-E1)與支架共培養后發現,添加HA的兩種纖維支架都能夠促進成骨細胞黏附和增殖,并且纖維定向排列的支架誘導細胞代謝活性增加。

3.3.2 二氧化硅 二氧化硅(SiO2)由于骨誘導活性而被選為骨形成的誘導因子,它不僅能改善成骨細胞的功能、抑制破骨細胞的功能,而且能在早期沉淀磷酸鈣從而促進礦化。近年來研究者們也開發了SiO2改性的成骨復合材料,如Ge等[39]基于PCL/CS基礎上制備了一種內嵌SiO2納米顆粒的互相連續纖維的靜電紡絲支架(PCL/CS/SiO2),結果表明SiO2的存在讓PCL/CS/SiO2生物支架具有更好的親水性,并提供了更多的細胞黏附位點;且成骨相關基因RUNX2、OCN和 COL1蛋白表達升高。將SiO2引入生物聚合物納米纖維中,有利于細胞附著,促進細胞增殖,促進新骨形成,增強機體成骨能力。

3.3.3 氧化石墨烯 氧化石墨烯(GO)可以增強和支持MSCs的黏附、增殖,并且研究表明氧化石墨烯結構中的疏水π結構域通過疏水和靜電作用改善了其與蛋白質的相互作用,從而誘導干細胞向成骨細胞分化[40]。Marrella 等[41]制備了負載用抗壞血酸還原的氧化石墨烯(RGO)或氧化石墨烯(GO)的PCL靜電紡絲膜,以再現骨ECM的纖維結構,并評估了RGO摻入對納米復合材料網的結構特性、生物力學和生物活性的影響。結果表明,RGO/PCL纖維支架顯示出優越的機械性能(即楊氏模量和極限拉伸強度),其粗糙表面促進了成骨生長因子在其表面的吸附,顯著促進了細胞黏附、擴散、增殖和礦化,從而改善了骨組織再生過程中的礦化。

4 多相復合支架

骨再生是一個復雜和漫長的過程,涉及大量的生長因子和激素協同調控,并且支架植入體內后面臨細菌定植和耐藥性。通過設計將多種改性劑共同加載到支架中被認為是促進骨組織再生的有效途徑,其組合制備的靜電紡絲支架不僅具有可定制的物理特性和可預測的機械性能,還優化了支架的生物相容性、促干細胞分化能力、抗菌性等,能更好地模擬細胞外基質的結構和組成,從而提高骨生物支架材料的臨床應用價值。

HA和SIM的聯合應用可序列調控成骨過程,Rezk等[42]制造了負載有SIM的PCL-聚癸二酸甘油酯(PGS)-HA納米纖維;體外細胞培養試驗表明,將HA納米顆粒和SIM摻入復合納米纖維中可改善成骨細胞的黏附和增殖,HA納米顆粒為晚期成骨分化和生物礦化提供了適宜的環境,而SIM支持前成骨細胞初始附著和增殖,納米纖維具有很強的骨再生能力。

聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic acid-co-glycolic acid), PLGA]具有良好的生物相容性,但PLGA在受到紫外線照射、液體介質浸泡、熱處理和環氧乙烷氣體等物理或化學因素的刺激下會迅速收縮和變形,而膠原蛋白的引入改善了這些缺點。Jin等[43]用魚膠原蛋白來修飾同軸纖維的PLGA殼層(PFC),并將黃芩苷(baicalin, BA)加載到PCL核心層(PCL-BA),該支架促進了骨間充質干細胞的成骨分化,刺激巨噬細胞極化為促修復表型。此外,體內研究表明,PFC / PCL-BA支架可以調節炎癥和破骨細胞分化,有利于新生血管形成和骨形成。

為了克服當前復合支架材料在成骨和抗菌性能方面的局限性,Qian等[44]利用聚多巴胺(PDA)作為介質將銀(Ag)/膠原蛋白涂覆PLGA/PCL支架(PP-PDA-Ag-COL),PP-pDA-Ag-COL支架上MC3T3增殖速率更高并且顯著增強了MC3T3細胞黏附。在PP-pDA-Ag-COL支架上培養7 d和14 d的MC3T3細胞的ALP活性,BMP2和RUNX2成骨基因表達水平更高,PP-pDA-Ag-COL和PP-pDA-Ag支架具有更寬的抗菌區,該支架是具有持續抗菌特性和促進成骨分化的新型仿生材料。

5 展望

目前,用生物活性分子、藥物及無機生物材料改性靜電紡絲,能夠改善支架的親水性及生物活性,有利于間充質干細胞的黏附、增殖、分化及礦化,促進骨生成。靜電紡絲制備的納米纖維支架是一種合適的載體并且還能實現持續緩釋的性能,避免了功能性分子在局部爆發性釋放的缺點。此外,由于某些生物活性分子難以儲存且在體外難以維持其長效的生物活性,故未來可以采用其他如微球、脂質體和介孔二氧化硅納米顆粒等載體運輸活性分子,與靜電紡絲聯合最大程度提高骨的生成。